Tema 10C: Replicació (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 1º curso
Asignatura Estructura i funció de biomolècules
Año del apunte 2016
Páginas 10
Fecha de subida 31/05/2016
Descargas 36
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 10C: REPLICACIÓ Tots els processos de replicació, i la resta dels processos metabòlics, estan orientats a garantir que no hi ha errors, mutacions, en el DNA perquè aquestes tindrien una conseqüència directa a la vida de la cèl·lula o organisme en aquell moment. Però els canvis en el DNA, no només són un problema immediat, sinó que si no es solucionen es consoliden i passen a ser mutacions que es transmeten a la herència.
Per tant, aquests processos inverteixen molta energia en garantir que no hi hagi errors.
Propietats fonamentals En procariotes El DNA és molt curt, per tant hi ha un sol origen de replicació la replicació comença en un sol punt d’origen i transcorre de manera bidireccional.
En eucariotes Disposa de diferents punts d’origen de la replicació En cada punt, hi ha dos forquetes, i genera una bombolla de replicació que podem veure en els autoradiogrames. I dins d’aquesta hi ha les forquetes que aniran en sentits contraris per anar mes ràpid, de manera que hi haurà replicació simultàniament en dos sentits oposats. I això es va veure en processos de marcatge, afegint a les forquetes nucleòtids marcats radioactivament, i si només fos unidireccional només hauríem vist marcatge en un sentit, però no va ser així. I això, permet justificar el curt temps en el que es dóna la replicació, per tant és bidireccional: el DNA parental és desenrotllat i les cadenes separades ràpidament replicades.
Els enzims que s’encarreguen de dur a terme la replicació, els principals, són les DNA polimerases, les que sintetitzen. Un DNA polimerasa, per fer aquesta funció necessita un DNA motllo, un DNA a qui copiar per poder sintetitzar, i un encebador que li doni un extrem 3’ o OH lliure, necessita que prèviament un enzim li proporcioni un fragment que principalment és de RNA que li doni un extrem 3’ OH, i llavors si que pot dur a terme la síntesi. Per tant, necessitarà un encebador per cada cadena, a part de que necessita nucleòtids, sinó no podrà sintetitzar.
I un altre requisit bàsic que condicionarà el procés de replicació, és que la polimerasa no té capacitat de sintetitzar en qualsevol sentit, sinó que només pot fer-ho de 5’ a 3’. I com sabem que la doble cadena són dues cadenes antiparal·leles i que quan acaba la longitud de la cadena, els dos extrems que quedaran seran diferents, perquè un tindrà el 5’ amb el fosfat sense reaccionar (extrem 5’), i el 3’ sense reaccionar (extrem 3’), per sintetitzar de 3’ a 5’ la DNA polimerasa teòricament no ho podria fer. Per tant, en la forqueta que va de 5’ a 3’ en la direcció de síntesi la polimerasa podrà sintetitzar, però amb la forqueta que va de 3’ a 5’ no podrà sintetitzar la polimerasa, i això es resol amb els fragments d’Okazaki.
En cada forqueta ens trobarem que hi haurà una de les dues cadenes que no es podrà sintetitzar en la direcció d’avançament de la forqueta, sinó en el sentit contrari, i això es solucionarà formant petits fragments, la direcció de síntesi dels quals serà contraria a la direcció d’avenç de la forqueta, i aquests són els fragment d’Okazaki. I aquests fragments es formaran en aquesta cadena discontinua. Aleshores quan la polimerasa arribi al nou fragment d’Okazaki ja podrà anar sintetitzant de 5’ a 3’, però com s’anirà obrint mentrestant la cadena per la direcció de la forqueta líder, haurà de venir un altre encebador amb enzim que sintetitzi respecte el tros format. Per tant la cadena líder només necessita un encebador, en canvi l’altre per cada cop que comença un fragment d’Okazaki necessita un encebador.
Aleshores, veim que hi ha un grau extraordinari de fidelitat durant la replicació, de manera que només hi ha error cada 109 o 1010 nucleòtids incorporats. I això es deu a que:  El primer enzim que es va sintetitzar va ser la DNA polimerasa 1, on veiem que hi havia una contribució de la geometria dels parells de bases a la fidelitat de la replicació, de manera que quan una A al centre actiu de l’enzim només reconeixia una T com a complementaria, i no una C o una G (un nucleòtid incorrecte cada 104 o 105 de correctes). I l’altre mecanisme que garanteix la fidelitat és l’activitat exonucleotídica 3’5’, de la DNA polimerasa 1, que quan detectava un error, tornava enrere, de manera que deixava anar de 5’3’ i començava a anar de 3’ a 5’, i així el que fa és tallar i treure’l, i posteriorment segueix correctament de 5’ a 3’. Per tant, té com 2 activitats, una polimerasa de síntesi i una correctora en sentit contrari, i la suma d’aquestes dues dona la taxa de fidelitat que es coneix de la síntesi del DNA, i la resta que ens falta per arribar a 10 a la 9 o a la 10, és l’adició, són mecanismes específics de correcció i reparació però un cop ja està feta la síntesi el DNA.
I quan van estudiar aquesta amb detall, van veure que el seu ratio de polimerització, la seva velocitat no justificava el temps en que es donava la replicació, és a dir que aquesta era massa lenta. I van trobar que l’enzim realment encarregat de fer la còpia és el DNA polimerasa 3, que té una velocitat molt més alta, i té una processivitat de poder copiar més de 500.000 parells de base sense desenganxar-se. I això fa que la copia sigui un procés molt i molt ràpid.
A més la DNA polimerasa 1 té només una subunitat, en canvi la 3 en té almenys 10.
La 1 té una capacitat exonucleasa 3’5’ correctora, i la 3 també té aquesta capacitat correctora.
Només la 1 té activitat exonucleasa 5’3’, té la capacitat de degradar en el mateix sentit que sintetitza. És un enzim capaç de copiar, corregir, i es l’únic que pot degradar en el mateix sentit que sintetitza quan reconeix els fragments de RNA que porta la cadena amb múltiples encebadors, té la propietat de neteja dels encebadors, la propietat de degradar en el procés de la síntesi. I a mesura que degrada omple, però aleshores farà falta un enzim que es diu DNA lligasa, perquè acabi de formar l’enllaç fosfodièster per acabar d’unir covalentment les dues cadenes.
Per tant, l’enzim que es dedica a fer la còpia, és l’holoenzim DNA polimerasa 3, que com hem dit, té almenys 10 subunitats té 2 subunitats alfa molt grans que fan la funció de síntesi, i cada subunitat alfa té penjada una omega i una subunitat èpsilon, i fins aquí seria semblant a la polimerasa 1, però tot lo demés li dóna l’aport necessari per desenganxar-se tant poc de la cadena, i aquest aport l’hi proporcionen dues subunitats beta (“abrazaderas”) que abracen cada subunitat alfa, perquè aquesta estructura serà l’encarregada de sintetitzar a la vegada dues cadenes de RNA, la líder i la endarrerida. És una estructura fixe que podrà sintetitzar a la vegada dues cadenes que van en direccions contràries. Tot i que hi haurà 2 DNA polimerases per cada punt d’inici de replicació.
Llavors, els enzims o proteïnes que estan implicades en la replicació de bacteris són; les SSB que s’uneixen a cadenes senzilles necessàries per estabilitzar el DNA al tenir una monocadena, o una helicasa que va obrint i desenredant la doble hèlix, per tant gestionarà la velocitat de funcionament de la forqueta, és un enzim que talla i desfà els ponts d’H. O la primassa que és l’enzim que va molt a prop de la helicasa i que sintetitzarà l’encebador inicial per les dues cadenes però les trobarem en la cadena endarrerida perquè és la que té més requeriments. La DNA polimerasa, traurà l’RNA amb activitat hexo 5’3’ i l’anirà corregint i sintetitzant, per tant neteja. I un cop netejat intervé la lligasa per formar l’enllaç fosfodièster que uneix els fragments de DNA. I després hi ha la Dna gyrase, que talla, desenrotlla i torna a enrotllar, distorsiona l’avenç de la forqueta i la funció de la helicasa. Aquesta topoisomerasa és II perquè talla les dues cadenes, de manera que fa dos talls.
La helicasa és un macroenzim de 6 unitats que s’ancora a una de les dues cadenes, la endarrerida, i va trencant els pont d’H a costa de formar molta tensió en la part davantera, de manera que més endavant i hi ha la gyrasa destensionant la tensió que genera la forqueta.
SSB són un braç que protegeix i impedeix que es tornin a unir les cadenes, però no són enzims que catalitzen la reacció, són proteïnes estructurals que impedeixen que el DNA s’uneixi.
I aquests són els enzims o elements més importants en tot el procés.
La replicació per etapes La síntesi d’una molècula de DNA es divideix en tres fases:  Inici  Elongació  Terminació I en cada etapa els enzims que hi participen varien. Hi ha proteïnes que es necessiten només a l’inici, i altres que es necessiten en tots 3 Algunes són només inicials perquè són les que reconeixen el punt d’inici, i un cop actuen ja es desentenen, i les que reconeixen el punt de terminació també només les veurem en la terminació.
Així que aquestes fases es distingeixen per les reaccions que tenen lloc en cadascuna d’elles i els enzims implicats.
Inici de la replicació:  Hi ha d’haver un element que reconegui la regió ori C de tot el DNA , i aquesta és la proteïna DnaA, ja que sense aquesta no hi ha reconeixement del punt d’inici, i no s’engegaria el procés.
El lloc ori C ocupa uns 245 pb que no són conservats totalment però si regions que són molt importants per la seva funció. Tenim 4 regions que s’anomenen caixes de DnaA, i una regió que consta d’una mateixa seqüència triplicada que està super conservada en procariotes i això és molt rellevant a nivell funcional, i s’anomena regió DUE, que és molt rica en T o A, i les caixes són seqüències curtes.
La DnaA reconeix de manera específica les caixes perquè tenen afinitat, i formen per interacció com un nucleosoma, un cilindre i provoca que el DNA s’entortolligui al seu voltant, de manera que provoca que en l’ori C hi hagi com una torsió, amb el qual aconsegueix tensionar de manera local el DNA.
I si sumes aquesta tensió del gir amb que llavors queda molt propera la regió DUE, com que és molt rica en T i A (menys estable que si fos més equilibrada en aparellaments de bases) acaba provocant que el DNA s’obri, de manera que en comptes de tenir superhèlix es generarà una torsió i obertura del DNA. I això és necessari per l’origen de la replicació, i a partir d’aquí ja intervenen els altres elements començant per la helicasa, i lligada a aquesta la primasa, seguida de les SSB.
Aleshores en el punt d’avenç de la forqueta hi ha associada una subunitat alfa formant una cadena i l’altra formant la endarrerida, i aquesta última forma uns llaços que li permeten transitòriament una subunitat segueixi una direcció i l’altre la contraria en funció de les cadenes.
Elongació Elongació de la cadena retardada La primasa col·loca un encebador (RNA primer) el més a prop que pot del punt de replicació de la forqueta, i aleshores les subunitats de carga de la “abrazadera”, les beta, s’acostaran i carregaran l’encebador de subunitats beta, mentre per l’altra banda es va sintetitzant, fins que es troben un fragment d’Okazaki amb el consegüent senyal de que la primasa s’haurà de preparar per sintetitzar un nou encebador, i la DNA polimerasa desfarà i alliberarà la “abrazadera” que ha estat fent servir, i ara la subunitat detectarà la nova “abrazadera” i tornarà a formar com un llaç. Tot això, és el mecanisme d’actuació ciclada que es va repetint en la cadena endarrerida.
Unió dels fragments d’Okazaki Per tant, la abrazadera que ha fet servir és la que abandona, i s’ha de tornar a carregar mitjançant ATP que provoca l’obertura i el tancament de la abrazadera. Quan és tancat és mitjançant enllaços fosfodièster.
En el cas del cromosoma bacterià, en procariotes, com és cíclic, és important que hi hagi proteïnes que marquin el punt final, i les Tus són les responsables de la terminació.
La replicació s’acaba amb una activitat topo II (topo IV), perquè separi les dues cadenes.
De DNA polimerases en eucariotes n’hi ha moltes més: hi ha enzims equivalents a la polimerasa I, III i molts altres que intervenen en mecanismes de reparació molt sofisticats.
Escurçament del telòmer Aleshores, en un cromosoma lineal hi ha per una mateixa forqueta una cadena continua i una discontinua. En la discontinua si ve la DNA polimerasa I i neteja el fragment taronja, no pot sintetitzar aquest perquè no té ningú que li doni un extrem 3’ OH lliure, per tant la nova cadena filla en aquesta serà més curta que la parental, i si això passa en cada cicle de divisió el cromosoma s’anirà escurçant i això la cèl·lula no s’ho pot permetre, perquè arribarà un moment que això afecti a gens essencials.
Aleshores per resoldre-ho, hi ha els telòmers, que són DNA molt repetitiu entre 2000 i 3000 vegades repetit, que tenen una funció de manteniment de la integritat del cromosoma imprescindible, són repeticions d’una seqüència molt curta no codificant, que es formen per evitar que aquest escurçament afecti a informació rellevant.
Allargament dels telòmers per la telomerassa Aleshores són com un rellotge biològic, i arriba un moment en que al cap de X divisions cel·lulars la cèl·lula entra en mort programada perquè prefereix tenir un rellotge de vida mitja, que no que es vegi afectat el seu material genètic.
Tot i que hi ha excepcions, que són les cèl·lules mare o embrionàries que tenen un enzim que es la telomerassa, un riboenzim, que és una barreja de proteïnes i RNA, que serveix perquè ella mateixa té una seqüència de RNA, i així pot agafar l’extrem 3’ del motllo i allargar-lo molt, perquè no hi hagi l’entrada en mort segura. Moltes cèl·lules cancerígenes tenen activa la telomerasa que no hauria de tenir una cel diferenciada.
Aleshores la telomerasa, fent servir el seu RNA allarga l’extrem 3’ i es va transposant i allargant, és a dir fa servir el seu RNA per copiar DNA, procés que s’anomena de retrotranscripció. De manera que al final queda un fragment molt llarg monocadena i un que és el que es veu afectat per la síntesi discontinua, i com això no és estable, al final la monocadena acaba formant uns llaços perquè no vingui cap enzim a degradarlos.
...