Tema 4A (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 10
Fecha de subida 22/04/2016
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Tema 4: Transcripción Mutaciones puntuales El DNA rige su propia replicación y su transcripción a RNA, el cual a su vez dirige su propia traducción a proteínas si es que codifica para ellas.
Por lo tanto, la transcripción es la síntesis de cualquier molécula de RNA.
Generalidades Cada cadena de un DNA codifica para dos RNAs diferentes. Como cada cadena de DNA de un gen no codifica para la misma proteína (codifica diferentes aminoácidos), sólo se transcribe una de las dos cadenas de DNA. Algunos virus son una excepción, por cuestión de espacio necesitan optimizar su capacidad de almacenamiento de información y por lo tanto presentan genes solapantes.
Distinguimos entre:   Cadena sin sentido. Hace de molde para sintetizar el tránscrito o RNA, también permitirá tener una base para las correcciones.
Cadena codificante. Es la cadena de DNA complementaria, y que no hace de molde. Tiene las mismas bases que el RNA (haciendo el cambio de T por U).
La transcripción siempre empieza con adeninas o en algún caso con una guanosina, es decir, siempre con una purina. Para empezar no necesita cebadores.
ORF: Opening Reading Frames, marcos abiertos de lectura. El mRNA presenta 3 ORF’s posibles, según dónde se empiza a leer cambian los tripletes (codones) y se altera la secuencia de DNA. La traducción siempre comenzará con una metionina.
RNA El RNA es una macromolécula sintetizada por las RNA polimerasas por transcripción de una secuencia de nucleótidos de DNA que sirve como molde. El RNA engloba a una familia muy heterogénea.
Está formado por nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster.
Presenta una ribosa como pentosa y uracilo en lugar de timina. Su estructura se caracteriza por:   Suelen ser de cadena sencilla.
La estructura primaria, determinada por la secuencia de nucleótidos, permite que el RNA presente formas muy variadas de estructuras secundarias  formadas por uniones intercatenarias. También se han observado estructuras terciarias para ciertos tRNA y rRNA.
La estructura secundaria, en regiones de doble cadena, es similar al A-DNA. No puede adoptar forma B por impedimentos estéricos creados por el grupo OH 2’.
Tipos de RNA eucariota RNA heterogéneo nuclear (hnRNA) También llamado pre-mRNA. Son moléculas directamente transcritas del DNA y codifican para una proteína determinada. Poseen secuencias codificantes, exones, y secuencias no codificantes, intrones. Será procesado posteriormente.
RNA mensajero (mRNA) Representa las moléculas procesadas del hnRNA y que codifican para proteínas concretas. Su secuencia de nucleótidos es traducida a una de aminoácidos durante la traducción.
Incluye formas muy heterogéneas tanto en tamaño como en secuencia.
En general existe una molécula de mRNA para cada gen o grupo de genes que vayan a expresarse.
Es el menos abundante de todos los RNAs celulares. En E.Coli representa entre el 2% y el 5% del RNA total.
RNA ribosómico (rRNA) Es el más abundante de la célula (muchos ribosomas). Principal componente de los ribosomas con un tercio de su volumen. Tiene una función catalítica y estructural en la síntesis de proteínas, forma los enlaces peptídicos en los ribosomas. La actividad catalítica se encuentra en la subunidad grande de los ribosomas.
Existen diferentes tipos asociados específicamente a la subunidad grande y a la pequeña del ribosoma en función de su coeficiente de sedimentación.
Procariotas:    rRNA 16S. Subunidad pequeña.
rRNA 23S. Subunidad grande.
rRNA 5S. Subunidad grande.
Eucariotas:     rRNA 18S. Subunidad pequeña.
rRNA 28S. Subunidad grande.
rRNA 5’8S. Subunidad grande.
rRNA 5S. Subunidad grande.
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología RNA de transferencia (tRNA) Es el RNA más pequeño con 75 nucleótidos de media. Su función es transportar aminoácidos en forma activada hasta el ribosoma durante el proceso de traducción del mRNA.
Existe al menos un tipo de tRNA para cada uno de los 20 aminoácidos.
En el extremo 3’ todos los tRNAs presentan una secuencia de nucleótidos CCA-3’ independientemente del aminoácido que transporten y constituye el extremo aceptor del aminoácido.
RNA pequeño nuclear (snRNA) El extremo anticodón se apareará con el ribosoma Participa en el proceso de soldadura de exones o de eliminación de intrones, splicing, marcándolos durante la formación de mRNA. Son pequeñas secuencias de unos 150 nucleótidos llamados U1, U2, U3, U4, U5 y U6, que hacen de componentes catalíticos del complejo del Spliceosome.
Un RNA de unos 300 nucleótidos, el 7SK snRNA, actúa de andamio de los factores que controlan la elongación de la transcripción.
RNA pequeño nucleolar (snoRNA) Tiene un tamaño de entre 100 y 300 nucleótidos. Marca los puntos a procesar en la maduración del pre-rRNA en el nucléolo (contiene genes para transcribir rRNA).
RNA citoplasmático pequeño (scRNA) RNA de alrededor de 300 nucleótidos. Son los responsables de enviar las proteínas recién sintetizadas hacia compartimientos intra o extracelulares. El 7SL RNA, que forma parte de la SRP (Signal Recognition Particle), secuencias que indican la diana de la proteína, es un ejemplo.
RNA’s pequeños (snRNA, snoRNA, scRNA), suelen asociarse a proteínas, RNPs (ribonucleoproteínas), que apantallan cargas, y donde el RNA es la parte catalítica.
RNA de interferencia (iRNA) Están asociados a complejos proteicos que suprimen la expresión de genes específicos degradando el mRNA o impidiendo su traducción.
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología  siRNA (small interfering). dsRNA (RNA de doble cadena) que proviene de un retrovirus (no es endógeno) o de un retrotransposón y que tiene un apareamiento perfecto de 21-25 nucleótidos y dos nucleótidos protuberantes en 3’. Tiene una función de defensa.
Un virus de RNA grande, posee trozos que se autoaparean de forma perfectamente estable. La célula los detecta y se apropia de ellos, bloqueando todos los mRNA posteriores que aparezcan con esa secuencia.
 miRNA (micro interfering). Es de origen endógeno y muchos provienen de intrones. Se expresan como ssRNA (una sola cadena) de unos 70 nucleótidos que autohibridan de manera imperfecta generando, en el citoplasma, fragmentos de 22 nucleótidos imperfectos. Función de regulación en embriogénesis.
Las bacterias adaptan sus respuestas al medio rápidamente porque su mRNA tiene muy poca esperanza de vida. Sin embargo, en eucariotas los mRNA son muy estables. En la embriogénesis, cuando es muy importante detener la expresión de algunos genes en momentos determinados, cuando empieza una fase, para eliminar o bloquear los mensajeros de la fase anterior, los miRNA hibridan con los mRNAs viejos, marcándolos para la degradación.
 piRNA (Piwi-interacting): es de origen endógeno y consiste en largos fragmentos de ssRNA. Importante función regulatoria.
Transcritos de RNA Existen dos tipos de transcritos:   Monocistrónico. Se da 1 gen (o cistrón) por transcrito. En eucariotas: o mRNA es monocistrónico, codifica proteínas (excepto el de histonas).
Policistrónico. RNA contiene información de varios genes.
o rRNA y tRNA es policistrónico en eucariotas.
o rRNA, tRNA y mRNA es policistrónico en procariotas.
Transcripción vs. Replicación Similitudes:     Mecanismo de síntesis.
Existe polaridad.
Se necesita un molde.
Hay tres etapas: iniciación, elongación y terminación.
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología Diferencias:     La transcripción no necesita primer o cebador.
Involucra sólo algunos segmentos de la molécula de DNA.
Sólo una cadena sirve como molde.
Tiene secuencias específicas que marcan el principio y el final de los fragmentos de DNA que serán transcritos como promotores y terminadores de la transcripción.
Transcripción en procariotas Todos los tipos de RNA se transcriben a partir de una única polimerasa, a excepción de la primasa en la cadena retrasada (sintetiza cebadores en la cadena). Además no necesita cebadores.
Polimeriza en el sentido 5’→3’, mediante un ataque nucleofílico del grupo 3’-hidroxilo de la cadena naciente sobre el grupo fosfato del NTP entrante, creándose un enlace fosfodiéster.
No posee actividad correctora (de proofreading, exonucleasa 3’→5’). Se dan más errores, pero como se sintetizan muchas moléculas de RNA son menos representativos.
Alta procesividad. Si el inicio es correcto (hasta 11 pb), no abandona el molde hasta terminar la transcripción. La parte más difícil es el comienzo, donde la polimerasa separa las cadenas y copia, pudiéndose dar abortos.
La RNA polimerasa procariota no necesita activación mediante factores de transcripción, a diferencia del eucariota.
RNA polimerasa Núcleo (muy grande) formado por 4 subunidades:    2 subunidades α.
Una subunidad β y una β’.
Una subunidad ω.
El holoenzima (enzima completo) contiene otra subunidad más: σ. Cambia en función del tipo de genes que ha de transcribir.
   σ70, por defecto.
σHS (o σ32), se activa cuando se da un heat shock, desplaza la σ70 y activa genes de chaperonas para la reparación de proteínas.
σ60, retirada de nitrógeno en emergencias.
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología Estructura del núcleo: Conocida como Pinza de cangrejo. En el canal de 110 A se insertará el DNA.
Es importante el Mg2+, que cataliza la polimerización (no usar agentes quelantes en los experimentos).
Subunidades α inician la cadena e interaccionan con proteínas reguladora y promotores.
En cuanto a la β y la β’, provienen de diferentes genes.
  Subunidad β: Se encarga de iniciación y elongación.
Subunidad β‘: Posee en su interior dedos de Zn, importantes en el reconocimiento y unión de DNA.
El factor σ La subunidad σ media el reconocimiento del promotor, facilita la unión al DNA de forma específica.
La existencia de diferentes factores σ indica la existencia de diferentes secuencias promotoras. Mediante el uso de diferentes subunidades la célula puede coordinar la expresión de diferentes genes y así dar respuesta a cambios celulares.
El promotor procariota Partiendo de la posición +1 (primer nucleótido que se transcribe, en ella suele encontrarse una purina), hay dos regiones promotoras. Se sintetiza en dirección downstream o corriente abajo (5’→3’). La otra dirección se llama upstream o corriente arriba.
 En la región -10 encontramos una secuencia de consenso llamada caja Pribnow.
En ella hay una secuencia repetitiva, la TATAAT), que es fácil de abrir por ausencia de C y G, lo que explica que no se necesiten promotores en la transcripción.
Biología molecular   Nanociencia y nanotecnología En la región -35 la secuencia no está tan conservada. Genes con transcripción más fuerte (rRNA…). Es además el punto de anclaje de la polimerasa, ésta aborta si no lo reconoce.
Las regiones promotoras se pueden encontrar en un rango de -70 / +30 bases. Los genes de expresión elevada tienen un elemento UP que es un promotor en una región de -40 / -60.
Transcripción en procariotas Iniciación Comienza en secuencias promotoras o promotores.
La RNA polimerasa se une al DNA de forma inespecífica, busca el sitio promotor desplazándose por la molécula de DNA.
Puede detectar secuencias -35 y -10 sin desenrollar la doble hélice, por lo que es un proceso rápido. Esto es llevado a cabo por el factor σ.
Elongación Los abortos se dan hasta los 11 bp, a partir de ahí la burbuja de replicación se desplaza.
No se sabe si la subunidad σ se libera tras pasar esta primera parte o si cambia de posición.
La burbuja de transcripción es de 15 bp (1,5 vueltas) y el híbrido de 8 bp. Contiene:    RNA polimerasa.
DNA molde.
RNA.
DNA queda desenrollado (W<0) por donde ha pasado la burbuja, y superenrollado (W>0) por delante, por lo que las topoisomerasas deben ir realizando correciones. La velocidad es de 50 nucleótidos/s.
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología Terminación  Terminación independiente de ρ (secuencia intrínseca de terminación). Al final de la secuencia, se da simetría de manera que al sintetizar RNA, éste forma una horquilla. La horquilla terminadora es rica en G y C (muy estable) y el débil apareamiento de la cola de Us con el molde de DNA hacen que se dé la terminación.
 Terminación dependiente de ρ. El factor ρ se desplaza por el RNA en sentido 5’→3’, actuando como helicasa al llegar a la burbuja, deshaciendo la hélice híbrido entre RNA y DNA. Se da la disociación de ambos y de la polimerasa.
Transcripción en eucariotas RNA polimerasas eucariotas nucleares Hay 3 RNA polimerasas diferentes con funciones específicas y reclutadas por promotores diferentes. Requieren de factores de transcripción para la formación del complejo de transcripción. El núcleo del enzima es homólogo al del enzima en procariotas. Tiene también unidades comunes y unidades adicionales, que varían en cada polimerasa.
Un factor de transcripción permite que la polimerasa transcriba. Habrá factores de transcripción para cada una de las polimerasas. En las eucariotas no hay factor σ por lo que el reconocimiento del promotor se hará gracias a factores de transcripción.
RNA polimerasa I Está localizada en el nucléolo (cuerpos granulares densos).
Es responsable de la síntesis de un solo tipo de RNA, denominado RNA pre-ribosomal, precursor de los rRNA 18S, 5.8S y 28S (gen policistrónico). Los genes de RNA preribosomal se repiten en tándem cientos de veces. Esta polimerasa reconoce un único promotor:   Elemento upstream (-170 a -110).
Elemento núcleo (-45 a +20).
Un elemento es una secuencia de DNA a la que se unen factores de transcripción específicos de la polimerasa I.
El elemento upstream ayuda a evitar abortos (no es indispensable).
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología RNAP III Está localizada en el nucleoplasma. Sintetiza tRNAs, el rRNA 5S y otros RNAs pequeños.
Sus promotores son bien conocidos. Curiosamente a veces se pueden localizar dentro de su zona codificante.
En eucariotas un factor de transcripción reconoce al promotor y coloca la polimerasa para que empiece a sintetizar en el lugar correcto.
RNAP II Localizada en el nucleoplasma. Sintetiza los precursores de mRNA y algunos RNAs especializados. Reconoce promotores con secuencias muy variables.
Frecuentemente contiene una secuencia consenso denominada caja TATA (secuencia de DNA concreta y corta), específica de la polimerasa II en eucariotas y cerca de la posición -30 (en bacterias en la posición -10), donde se unen factores de transcripción.
Contienen muchas otras cajas, como la GC, que puede cambiar su posición y número de copias.
Además, hay elementos de respuesta específica (son secuencias de DNA más largas que las cajas que permiten más variedad de secuencia y que unen factores de transcripción como hormonas). Es necesario un gran número de factores de transcripción para la síntesis basal.
Transcripción por polimerasa II 1. La TBP (TATA Binding Protein) reconoce la caja TATA y permite que se monten los factores de transcripción.
2. Un factor B realiza control de calidad.
3. La RNA polimerasa II es reconocida por un factor F (TRIIF), guiándola hasta el punto de inicio de la transcripción.
4. Se da la unión de otros factores (TRIIE y TRIIH). Todo el complejo recibe el nombre de complejo de iniciación PIC.
Una de las subunidades análogas a la β’ de la polimerasa II tiene en el extremo C-ter una secuencia de 7 aminoácidos que se repite hasta 52 veces. Contiene ser y thr. Permite que una fosforilasa fosforile este extremo, lo que va indicando cuándo terminar la polimerización (en lugar de una secuencia terminal como en eucariotas).
Inhibición de la transcripción en eucariotas La seta Amanita phalloides produce α-amanitina, que bloquea la elongación del RNA debido a la inhibición de la polimerasa II y la III (la II necesita menor concentración para ser inhibida por cuestión de constantes de disociación).
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología Retrotranscripción Los virus tienen la capacidad de copiar, a partir de su RNA, una copia de DNA que podrán integrar en el genoma del huésped.
Pueden llevar a cabo la retrotranscripción porque poseen la enzima capaz de hacerlo, la retrotranscriptasa o Rt. En la retrotranscripción es un tRNA el que hace de cebador para la síntesis de DNA. A partir del cebador empieza la síntesis formando un híbrido RNA-DNA.
Cuando se llega al final de la cadena, una RNasa H (helicasa) degrada el RNA molde y la Rt copia la cadena de DNA sobre sí misma. Lo hace sin desprenderse de modo que solo hay una cadena que se autoaparea. Cuando se termina la síntesis se cortará el bucle que unía las dos cadenas y obtendremos el segmento que se introducirá en el genoma.
Flujo de la información genética ...