Tema X BioCel (2014)

Descripción

Apuntes de la asignatura Biologia Celular para cualquier grado de Biociencias (biologia, biomedicina, genetica, nanotecnologia, microbiologia, biotecnologia, bioquimica).

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1 Biologia celular Bloque X: Núcleo La aparición del núcleo no está muy clara todavía, aunque existe una teoría cariogénica que propone que se formó tras la invaginación del ADN. El núcleo es lo que diferencia a las eucariotas de las procariotas, y es fuente de importantes estudios. A continuación estudiaremos sus componentes.
Envoltura nuclear Membrana nuclear externa e interna.
El núcleo posee dos membranas con un espacio perinuclear en medio. La membrana externa es continua con el retículo endoplasmático liso y puede tener ribosomas adheridos. La interna, al igual que la externa, contiene proteínas transmembranales. Están conectadas por poros nucleares. No se sabe con exactitud cómo se transportan las proteínas de la membrana externa a la interna.
Lamina nuclear Está formada por unos filamentos intermedios (constituidos por lamina A, B y C) que cubren la membrana interna y le da soporte. La asociación íntima entre la membrana interna de la envuelta nuclear y la lámina nuclear se produce gracias a la existencia de al menos 20 proteínas localizadas en la membrana interna.
Una de sus principales funciones de la lámina nuclear es la de mantener la estructura de la envuelta nuclear.
Las deficiencias en estas proteínas producen las enfermedades denominadas laminopatías, las cuales presentan núcleos desorganizados y pueden llevar a la muerte celular o a la fragilidad de la envuelta nuclear.
Se desorganizan durante la mitosis, causando que la membrana nuclear desaparezca.
La desorganización y organización de la envuelta nuclear durante la división celular se debe a acciones enzimáticas sobre las láminas. Cuando se destruyen, las laminas de tipo B quedan enganchadas a fragmentos de membrana nuclear, mientras que las A se vuelven solubles en el citosol.
Poro nuclear Los poros nucleares son complejos proteicos grandes formados por proteínas llamadas nucleoporinas.
Su número oscila entre 3.000 y 4.000, dependiendo de la actividad transcripcional de la celula. Su tamaño es el de 30 veces un ribosoma, su diámetro 120 nm y su apertura de 9nm. Las FG-nucleoporinas son un tipo de proteínas que lo constituyen. Son ricas en fenilalanina y glicina y se encuentran en el canal del poro, en los filamentos citoplasmáticos del poro y en los filamentos de la jaula. Su mayor rol es ayudar al transporte entre el núcleo y el citoplasma, sirviendo además como regulador de las sustancias y moléculas que entran al núcleo.
2 Biologia celular Transporte núcleo-citoplasma.
Las proteínas transmembranales nucleares se transportan por difusión desde el RER, donde son sintetizadas, ya que las membranas están conectadas entre sí. Las proteínas solubles, tales como histonas o subunidades ribosómicas tienen que entrar por los poros. También tienen que poder salir. Para que la importación y la exportación se produzca necesitaremos los siguientes componentes:    Secuencia señal, situada en la superficie de la proteína, ya que esta se transporta plegada, aunque puede estar repartida en diferentes zonas.
o NLS: secuencia de importación al núcleo, es rica en Lys y Arg y está cargada positivamente o NES: secuencia de exportación, rica en Leu Proteína receptora, la cual pertenece a la familia de las Carioferinas. Necesitan interaccionar con las FG-nucleoporinas para guiar a la proteína a través de los poros nucleares.
o Importina: reconoce NLS o Exportina: reconoce NES GTPasa monomérica, llamada Ran. La RanGEF (convierte GDP en GTP) se encuentra exclusivamente en el interior del núcleo, por lo que cabe esperar que en el interior encontraremos RanGTP, es decir, activada. En los filamentos que hay en el citosol pertenecientes al poro nuclear encontramos GAP que inactiva Ran (convierte GTP en GDP mas P), por eso en el citosol encontraremos RanGDP.
Importación de proteínas.
1) Una proteína con secuencia señal NLS en su superficie interacciona con la Importina, quien la introduce en el interior del núcleo a través del poro y gracias a sus interacciones con la FG-porinas que constituyen los filamentos citosólicos y los filamentos de la jaula del poro.
2) La RanGEF promueve que haya RanGTP, la cual provoca que la Importina sufra un cambio conformacional cuando interacciona con ella y el complejo Importina-proteína se separa. La Importina queda unida a Ran GTP.
3) RanGTP tiene que salir para poder exportar la Importina al citosol y que pueda ser reutilizada. Una vez fuera, Ran GAP hidroliza el GTP, formándose RanGDP, el cual no es afín por la Importina y se disocian. La Importina queda entonces libre para poder volver a transportar proteínas marcadas con NLS.
4) RanGDP tiene que volver a entrar para poder convertirse nuevamente en RanGTP y volver a sacar importinas. Para ellos es transportada por NTF2 a través de proteínas transmembranales específicas, no de poros. Una vez dentro, RanGDP se vuelve a fosforilar gracias a RanGEF y se libera de NTF2, el cual sale del núcleo mediante otra proteína transmembranal.
Exportación 1) Una proteína con secuencia señal NES en su superficie es reconocida por la Exportina en el interior del núcleo. La Exportina tiene que estar unida a RanGTP para poder reconocerla.
3 Biologia celular 2) Una vez atraviesan el poro nuclear, RanGAP hidroliza el GTP, causando la disociación de los tres componentes. La proteina queda libre en el citosol, pero la Exportina tiene que volver a entrar, al igual que la RanGDP.
3) La Exportina entra mediante los poros, pero RanGDP necesita asociarse con NTF2 para poder entrar.
Una vez dentro es fosforilada por la RanGEF, convirtiéndose nuevamente en RanGTP.
Exportación Importación A diferencia que otro tipo de transportes, NO se elimina la secuencia señal por varias razones. La proteína entra plegada, por lo que su eliminación supondría una pérdida de la configuración espacial. Además, necesita la secuencia señal para poder entrar y salir cuando quiera, ya que el núcleo se deshace durante la división celular y necesita poder volver a reconstruirse una vez esto ocurra.
4 Biologia celular Orgánulos subnucleares Son asociaciones de moléculas que realizan funciones determinadas. Entre ellas destaca el nucléolo, del que hablaremos en mayor profundidad posteriormente. También podemos encontrar cuerpos de Cajal y GEMS, que participan en la formación de snRNP (small nuclear ribonucleoproteinas) que interactúan sobre RNA y snoRNP (small nucleolar ribonucleoproteinas) que interaccionan sobre rRNA, ya que son los genes que se localizan en el nucléolo. Así mismo, encontramos gránulos intercromatínicos o speckles, que contienen proteínas que procesan pre-mRNA, como snRNP.
Nucléolo Es una estructura densa y esférica involucrada en la transcripción de rRNA y pre-ensamblaje de ribosomas. No está rodeada de membrana sino que constituye una agregación de moléculas, tales como genes, rRNA, enzimas y proteínas. Podríamos dividirlo en tres zonas: centro fibrilar, donde tiene lugar la transcripción de DNA que codifica los rRNA; componente fibrilar denso, que corresponde a los transcritos de rRNA, su procesamiento y su modificación; y el componente granular, donde ocurre el ensamblaje de pre ribosomas.
En los humanos, las regiones que codifican por rRNA se sitúan en tándem (unos detrás de otros, separados por DNA separador) y en 5 cromosomas diferentes, todos ellos acrocéntricos-NOR, y que corresponden a los números 13, 14, 15, 21 y 22. En condiciones normales, durante la interfase, los genes que codifican por el rRNA en la cromatina se encuentran en una misma región del núcleo, más oscura, que es lo que constituye el nucléolo. Cuando se condensa para dar lugar a cromosomas, el nucléolo se deshace porque los genes ya no están juntos.
Tenemos unas 200 copias de genes que codifican para rRNA, lo cual se debe a que necesitamos muchos ribosomas para producir tal elevado número de proteínas. Numerosos estudios muestran que se trata de genes con una alta frecuencia de transcripción. En la imagen podemos ver una región con dos genes de rRNA separados por un DNA separador. Los genes se están transcribiendo continuamente, y prueba de ello son los numerosos transcripts (colas). Las “colas” más largas corresponden a genes que se han transcripto prácticamente en su totalidad, mientras las “colas” pequeñas corresponden a genes que se están transcribiendo y cuyas RNA-polimerasas avanzaran por la cadena hasta llegar al final, donde serán “colas” largas.
5 Biologia celular El gen que codifica por rRNA está más oscuro porque sobre él se encuentran numerosas RNA polimerasas, que corresponden con los puntos negros. Después de este proceso obtenemos rRNA precursor, el cual tiene que ser modificado por las snoRNP para llegar a ser funcional. Dos de las modificaciones más comunes son la matilación y la sustitución. Después de una maduración del rRNA, se produce el corte o splicing y las modificaciones químicas correspondientes, y la secuencia es cortada en tres secuencias, cada una constituyente de un ribosoma diferente. Después de agregarse con las subunidades ribosómicas proteicas puede abandonar el núcleo mediante los poros nucleares. Ambas subunidades contienen secuencias señal, ya que aún no han formado un ribosoma.
Cromatina La cromatina está formada por la secuencia de nucleótidos del ADN y proteínas asociadas que permiten su plegamiento. El Proyecto del Genoma Humano llevado a cabo a finales del siglo XX pone en manifiesto la secuencia señal ordenada de todas las bases que conforman al ser humano, es decir, su genoma. Gracias a esta secuenciación hemos podido descubrir que solo una parte pequeña de ADN codifica proteínas. La mayor parte del DNA restante la forman fragmentos de secuencias cortas móviles que se han insertado durante la evolución.
A pesar de ello, contamos con unos 27.000 pares de nucleótidos por cada gen, de los cuales solo 1300 serán necesarios para construir una proteína. Dichas secuencias codificantes por proteínas se llaman exones, y entre ellas se encuentran intercaladas secuencias no codificantes llamadas intrones. La mayoría de resto de organismos no contienen intrones. Además de estos dos elementos, contamos con secuencias de DNA reguladoras.
Algunos datos del genoma humano Longitud del DNA 3,2 x 109 pares de nucleótidos Número de genes Aproximadamente 25.000 Numero de pseudogenes* Más de 20.000 Porcentaje de la secuencia de DNA en exones 1.5% (secuencias que codifican proteínas) Porcentaje de DNA en otras secuencias altamente 3.5% conservadas** *Un pseudogen es una secuencia de nucleótidos muy parecida a la de un gen funcional, pero que contiene muchas mutaciones que evitan su expresión adecuada. La mayoría de pseudogenes han surgido de la duplicación de un gen funcional que posteriormente ha acumulado mutaciones nocivas en una copia.
**Regines funcionalmetne conservadas, entre ellas DNA que codifica UTR 5’ y 3’ (regiones no traducidas), RNA estructurales (como por ejemplo rRNA) y funcionales y regiones conservadas de DNA de unión a proteínas.
6 Biologia celular En las células eucariotas el DNA se encuentra distribuido en diferentes cromosomas en el interior del núcleo. Recordemos que dentro de la cadena de DNA tenemos genes, DNA espaciador y otras secuencias de DNA. Cuando la doble hélice se una a proteínas conforma entonces la cromatina. Dichas proteínas pueden ser histonas o no.
Las histonas son proteínas muy pequeñas pero muy conservadas, apenas han sufrido alteraciones. Son ricas en aminoácidos positivos, como la Lys y Arg y están unidas fuertemente al DNA independientemente de la secuencia. Su función es la de empaquetar DNA. Las proteínas que no son histonas pero que participan en el empaquetamiento y organización del DNA son grandes y acidas y se unen a unas secuencias específicas de la doble hélice. Participan además en procesos de replicación, reparación y transcripción.
En las células procariotas, el DNA es circular y se encuentra en el citoplasma. Sus genes están altamente compactados y se unen a proteínas básicas análogas y a histonas.
Empaquetamiento.
Parte del genoma se pequeño grado durante la empaquetamiento en rosario, posterior fibra en loops. El nivel durante la mitosis.
encuentra condensado en un interfase, lo que sería el fibra en zig-zag/solenoide y más alto de condensación se da Rosario o fibra de 10nm.
También se conoce como collar de perlas, donde cada perla representa un nucleosoma y entre ellos DNA espaciador. Se puede ver al tratar el DNA con agente descondensantes. Si después lo tratamos con nucleasas que rompan el DNA espaciador obtendremos los nucleosomas. Cada uno de ellos está formado por un complejo de ocho proteínas histonas –dos moléculas de cada una de las histonas H2a, H2B, H3 y H4 –y un DNA de doble elice de 147 pares de bases, que da dos vueltas sobre el complejo de histonas. Los puentes de hidrogeno y las interacciones hidrofóbicas son las que mantienen ambas moléculas unidas.
En la imagen podemos ver una cadena de DNA que rodea a las diferentes histonas. En el extremo N terminal de las histonas tienen lugar diferentes modificaciones, las cuales se recogen en el Código de Histonas.
Dependiendo de la variación (acetilación, metilación…) tienen lugar distintos hechos, como por ejemplo la facilidad con la que proteínas asociadas a cromatina (factores transcripcionales, etc.) podrían acceder al ADN, las modificaciones actuarían como señal de reconocimiento para proteínas reguladoras, y por tanto, las formas modificadas resultaría relevantes para la regulación génica. Las estructuras de eucromatina y heterocromatina serán en mayor medida dependientes de las concentraciones locales de histonas modificadas.
7 Biologia celular Fibra de zig-zag/solenoide o θ30nm En el modelo de zig-zag , una histona adicional H1 de mayor tamaño que las otras se une a un nucleosoma y entra en contacto con el DNA y las proteínas, provocando un cambio de sentido del DNA que sale del nucleosoma. El cambio parece ser crucial para el empaquetamiento del DNA nucleosómico.
Para formar la estructura de solenoide necesitan establecerse interacciones entre nucleosomas mediante las colas de las histonas, especialmente de la H4. Si el cromosoma se condensa en forma de zig-zag o de solenoide no está todavía claro, podría incluso tratarse de una mezcla de ambos.
Fibra de loops o θ300 nm La cromatina se asocia con una matriz proteica no de histonas en forma de lazos, tal y como se muestra en la imagen. Existen bucles más grandes que otros, y se cree es porque esta menos condensado para poder añadirse otras proteínas como los primers o DNA polimerasa y que pueda replicarse o transcribirse.
Los cromosomas plumulados son uno de los tipos de cromosomas más grandes y se hallan en los oocitos de la mayoría de los animales, exceptuando a los mamíferos.
Se hallan durante el estadio de la meiosis I denominado diploteno. Luego de este relativamente largo período de la meiosis I, los cromosomas en escobilla vuelven a compactarse durante el período de metafase I. Son estructuras transitorias, específicamente bivalentes (es decir, dos cromosomas apareados cada uno de los cuales está formado por dos cromátidas hermanas). Cada uno de los dos cromosomas está constituido por dos largas hebras que forman muchos "rulos" o "bucles", a la manera de un cepillo o escobilla, a lo largo del eje mayor del cromosoma. Esos "rulos" permiten que el ADN se halle disponible para el proceso de transcripción durante la maduración del ovocito.
8 Biologia celular Remodelación de la cromatina Por definición, la remodelación de la cromatina es el proceso de enzima-asistida para facilitar el acceso de ADN nucleosomal para la remodelación de la estructura, la composición y el posicionamiento de los nucleosomas. La remodelación de la cromatina es la modificación dinámica de la arquitectura de la cromatina para permitir el acceso de las proteínas de la maquinaria de transcripción reguladoras al ADN genómico condensado, y de ese modo controlar la expresión de genes. Para ello la cadena de DNA tiene que ser capaz de separarse ligeramente de las histonas para que puedan actuar las proteínas remodeladoras.
Tal remodelación se lleva a cabo principalmente por 1) modificaciones covalentes de las histonas por enzimas específicas, es decir, acetiltransferasas, histona desacetilasas, metiltransferasas, y quinasas, y 2) los complejos de remodelación de la cromatina dependientes de ATP que mueven, expulsan o reestructuraran nucleosomas. Además de regular activamente la expresión génica, la remodelación dinámica de la cromatina imparte un papel epigenético* regulando varios procesos biológicos clave, como por ejemplo, la replicación y reparación del ADN, la apoptosis, la segregación cromosómica, así como el desarrollo y la pluripotencia. Las aberraciones en las proteínas de remodelación de la cromatina se encontraron asociadas con enfermedades humanas, incluyendo el cáncer. La remodelación de cromatina es una vía que está actualmente evolucionando como una estrategia terapéutica importante en el tratamiento de varios tipos de cáncer.
Organización de la cromatina en la interfase La interfase es una fase del ciclo celular que comprende el G1, S y G2. Durante esta etapa, la cromatina se encuentra descondensada, en forma de heterocromatina y eucromatina.
Heterocromatina Eucromatina Representa el 10% del genoma Representa del 90% del genoma Tincion oscura en el nucleo interfasico, ya que está Tincion clara en interfase, ya que su condensación altamente condensada.
varia en grado Asociada a la envuelta nuclear.
Replicación tardía y poca transcripción de genes.
Replicación temprana, genes transcripcionalmente activos Constitutiva: idéntica para todas las células del Estructura en fibras de 30nm o bucles.
organismo. Incluye los telómeros y centrómeros.
Facultativa: cromosoma X inactivo. diferente en los distintos tipos celulares. Contiene aquellos genes que no se expresan pero que pueden expresarse en algún momento.
*La epigenética hace referencia al estudio de todos aquellos factores no genéticos que intervienen en la determinación de la ontogenia o desarrollo de un organismo, desde el óvulo fertilizado hasta su senescencia, pasando por la forma adulta; y que igualmente interviene en la regulación heredable de la expresión génica sin cambio en la secuencia de nucleótidos.
9 Biologia celular Organización de la cromatina en mitosis La mitosis se divide en cinco fases: profase, metafase, anafase, telofase y citocinesis; donde la metafase representa la máxima condensación cromosómica. Es por ello que se usan los cromosomas metafásicos para realizar los cariotipos, la ordenación de cromosomas homólogos según su tamaño. Para determinar el cariotipo se usa una hibridación in situ donde se le añade un fluorocromo a una sonda de DNA que marcara los distintos cromosomas. La sonda de DNA tiene una secuencia específica, por eso se unirá la misma al par de cromosomas homólogos, quedando coloreados por el mismo fluorocromo.
La condensación de los cromosomas interfásicos para convertirse en cromosomas mitóticos comienza durante la fase M de la interfase, en donde se realizan modificaciones específicas en las histonas que ayudan a reorganizar la cromatina, como por ejemplo la fosforilación de la H1. El empaquetamiento es asistido por un tipo de proteínas denominadas condensinas y cohesinas.
Condensinas Las condensinas son grandes complejos proteicos que contienen dímeros de proteína SMC. Los dímeros se forman cuando dos monómeros rígidos y largos se unen por sus extremos dando lugar a una bisagra, dejando dos dominios globulares en los otros dos extremos a través de los cuales se unen al DNA e hidrolizan ATP. La función de las condensinas es “enrollar” la cromatina para que pueda resistir a la división mitótica. Primeramente, y en presencia de la enzima topoisomerasa I, induce el superenrollamiento de la cromatina. En segundo lugar, promueve la formación de lazos, en colaboración con la enzima topoisomerasa II.
Las condensinas se encuentran en un eje central sobre el cual se enrolla el DNA. Es por ello que en un marcaje con flurocromos se podrán observar en el medio del cromosoma.
Cohesinas Las cohesinas utilizan energía procedente de la hidrolisis del ATP y colaboran en el plegado de las dos moléculas de DNA de cada uno de los cromosomas interfásicos, convirtiéndolas en dos cromátidas de un cromosoma mitótico, manteniéndolas juntas.
Al llegar a la fase M la cohesina une cromátidas hermanas en toda su extensión, pero la M-cdk (enzima kinasa dependiente de cilcina), entre los estados de profase y prometafase, fosforila directamente a un componente del complejo de la cohesina denominado kleisina (ver esquema molecular de la cohesina), lo que provoca la disociación de la cohesina de los brazos de las cromátidas pero no de los centrómeros, por lo que las cromátidas permanecen unidas por este punto. Las 10 Biologia celular cohesinas del centrómero evaden esta fosforilación por la actividad de una proteína fosfatasa PP2A que se encuentra asociada a esta región. De este modo, las cromátidas hermanas enlazadas por el centrómero pueden disponerse de forma ordenada en la placa metafásica.
La acción de la M-cdk permite tres procesos de forma simultánea que convergen en la anafase: favorecer la formación del huso mitótico, desvincular las condensinas que no se encuentran en el centrómero y disparar la separación del complejo securina-separasa para permitir que la separasa elimine al complejo Shugosina-PP2A, que mantenía los centrómeros unidos gracias a las cohesinas, y pueda comenzar la anafase.
Se ha descrito la acción de las condensinas y de las cohesinas por separado pero ambas actúan conjuntamente y de forma coordinada durante la división celular.
Estructura de los cromosomas mitóticos.
Centrómeros Los centrómeros son secciones cortas formadas por heterocromatina con DNA muy repetido, es decir, DNA satélite. Contiene histonas específicas (H3v) y no histonas que compactan los nucleosomas. El DNA que lo forma puede silenciar genes. Rodeando el centrómero se encuentran los cinetocoros, placas proteicas necesarias para que el cromosoma se pueda enganchar a los microtúbulos y se puedan separar las dos cromátidas hermanas. Cuando entra en metafase las cohesinas se degradan para poderse separar las cromátidas.
Telómeros Los telómeros se encuentran en los extremos del cromosoma, es donde termina la secuencia de DNA. Como distingue la celula entonces un DNA que ha sido cortado (DSB) para que lo repare de un final de la cadena? El extremo de la cadena es rico en guanina en los mamíferos y forma lo que se llama un extremo overhang, es decir, una de las hebras más larga que la otra. La hebra más larga se repliega formando un loop sobre la más corta, marcando así el final del cromosoma.
El ADN contenido en los telómeros no se replica completamente durante la duplicación del ADN, ya que los enzimas ADN polimerasa solo pueden trabajar en dirección 5'->3'. Para una de las dos 11 Biologia celular hebras (conductora) esto no supone problema, pero para poder duplicar simultáneamente la hebra retrasada (que se presenta en dirección 3'->5') deben formarse los fragmentos de Okazaki. El inicio de cada segmento está constituido por un primer de ARN. Estos son finalmente sustituidos por ADN, sin embargo, el primer del extremo 5' de la hebra no puede ser completado, ya que se requeriría trabajar en dirección 3'->5'. Como consecuencia, el telómero que se va haciendo cada vez más y más corto en cada replicación, llegando a un extremo en el que ya no se puede formar un loop y es reconocido como rotura por las proteínas reparadoras.
Las proteínas reparadoras unen un cromosoma sin telómeros con otro cromosoma (distinto o homologo) y los une, creando un único cromosoma hibrido, muy inestable, y entran en ciclos BFB (Breakage, fusion, breakage) donde se produce trencamiento, fusión y puentes. Los cromosomas unidos marcan el inicio de la carcinogénesis, es decir, de la producción de células cancerígenas.
Territorios cromosómicos durante la interfase Cuando los cromosomas no están todavía condensados ocupan un lugar determinado dentro del núcleo, tal y como muestra la imagen, tomada con microscopia de fluorescencia. Existen varias tesis de cómo se organizan los cromosomas. Algunas sostienen que es por el tamaño situándose los más grandes en la periferia y los más pequeños en el interior; mientras que otras optan por la densidad génica, donde los más densos se sitúan hacia el exterior y los menos densos son más internos.
Dentro de un mismo territorio, los propios genes se colocan de una determinada manera. Existen tesis que postulan que varía según la actividad transcripcional de la cromatina. Rodeando la cromatina encontramos los compartimentos intercromáticos cargados con numerosas proteínas necesarias para reparar, replicar y transcribir el DNA. Los genes que hay que reparar y que están activos se encuentran en la periferia para que las proteínas puedan actuar, mientras que los inactivos están en el interior del territorio. Dichos genes pueden formar parte de la heterocromatina, ya que esta no se transcribe, o de la eucromatina, ya que no todos los genes se transcriben continuamente, sino que siendo activos pueden estar en su forma no activa.
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