Tema 3. (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Complutense de Madrid (UCM)
Grado Farmacia - 3º curso
Asignatura Microbiologia I
Año del apunte 2016
Páginas 4
Fecha de subida 20/06/2017
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Profesor Víctor, María Molina

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    Tema  3:  Microscopía  y  observación  de  microorganismos     Morfología  de  bacterias  y  arqueas  (procariotas)   Los  cocos  tienen  forma  de  esferas.     Los  diplococos  se  forman  a  través  de  multiplicación  asexual  de  un  coco.  Algunos  cocos  siempre  están   individuales,  separados.  A  veces  están  juntos.  Son  células  independientes,  son  organismos  distintos,  pero  se   quedan  pegados.     Los  estreptococos  se  forman  por  varios  cocos  en  cadena.     Las  tétradas  están  formadas  por  4  cocos.   Las  sarcinas  son  cubos  de  cocos.     A  veces  son  racimos  (estafilococos).     Los  bacilos  son  alargados.  Pueden  estar   aislados  o  estar  en  parejas  (diplobacilos),   cadenas  (estreptobacilos),  empalizada,  letras   chinas,  etc.   Los  cocobacilos  son  más  cortos,  pero  son   bacilos.     Los  vibrios  tienen  forma  de  coma.     Los  pleomórficos  son  el  mismo  microorganismo   con  distintas  formas.  Pueden  aparecer  de   muchas  formas  diferentes.     Las  bacterias  filamentosas  no  se  separan  en  la   multiplicación  y  tienen  un  crecimiento   diferente  al  resto  de  bacterias.     Los  espirilos  tienen  forma  helicoidal,  como  las   espiroquetas.       Hay  microorganismos  con  formas  distintas  a  las  demás,  sobre  todo  en  las  arqueas.  Un  ejemplo  es  Haloarcula   quadrata,  que  es  cuadrada.     Los  hongos  se  dividen  en  levaduras  y  mohos.   Levaduras  son  unicelulares,  se  multiplican  por  gemación.   Los  mohos  con  pluricelulares,  las  células  que  se  van  formando  no  se  separan.  También  pueden  formar   esporas.  Hay  algunos  dimórficos,  pueden  crecer  como  levaduras  (individuales)  o  puede  producir  micelios.       Los  virus  pueden  ser  icosaédricos,  helicoidales  o  complejos.  Tienen  aspecto  cristalino.  Están  formados  por  una   cápsida.     Microscopía   Un  microscopio  simple  tiene  una  sola  lente.  Antoni  van  Leeuwenhoek  fue  el  primero  en  visualizar  la   morfología  de  los  microorganismos.     En  un  microscopio  óptico  compuesto,  la  imagen  del  objetivo  es  magnificada  por  la  lente  de  los  oculares.       1       Aumento  total  =  lente  objetivo  x  lente  ocular   La  resolución  no  se  puede  aumentar  mucho  aunque  aumentemos  las  lentes  porque  depende  de  las   propiedades  de  la  luz.     El  poder  de  resolución  de  un  microscopio  es  la  propiedad  que  permite  observar  dos  puntos  adyacentes  como   separados  y  depende  de  características  propias  de  la  lente  y  de  la  longitud  de  onda  de  la  radiación  empleada   para  iluminar  la  muestra.   Un  microscopio  con  un  poder  de  resolución  de  0,4nm  puede  distinguir  dos  puntos  separados  si  están  al   menos  a  0,4nm  de  distancia  (d).  A  menor  distancia,  mayor  poder  de  resolución.     Longitudes  de  onda  de  luz  más  cortas  proporcionan  mayor  poder  de  resolución.  Luz  blanca:  límite  de   resolución  (0,2µm)   La  apertura  numérica  (AN=  n  senq)  índice  la  capacidad  de  captación  de  la  luz  por  el  objetivo.     N  à  índice  de  refracción  (normalmente  aire)   q  à  mitad  del  ángulo  del  cono  de  luz  que  entra  en  el  objetivo     Tipos  de  objetivos:   Seco:  n=1  (aire)   Aceite  de  inmersión:  n=1,2-­‐1,5  (100x)   Si  hay  aire,  hay  muchos  rayos  que  no  son  captados,  con  aceite  se   captan  todos.       El  microscopio  óptico  depende  de  las  propiedades  de  la  luz,  por  eso  su  poder  de  resolución  no  se  puede   aumentar  demasiado.       Microscopios  ópticos:   •  Luz  visible:     o  Campo  claro   o  Campo  oscuro   o  Contraste  de  fases:  se  visualiza  mejor  la  muestra   •  Luz  UV:   o  Microscopio  fluorescencia   Microscopio  confocal:  láser   Microscopio  electrónico:  electrones   •  Transmisión   •  Barrido     Microscopio  de  campo  claro   Fuente  de  luz  visible:  bombilla  o  solar   Poder  de  resolución:  0,2  µm   Amplificación:  1000-­‐1200x   Contraste:  bajo   Aplicaciones:  observación  de  microorganismos  vivos  en  fresco  o  por  tinción  (mejora  el  contraste)   Su  inconveniente  es  que  poder  ver  muy  poco  contraste.  Se  ven  los  microorganismos  frescos  o  se  hace  tinción.       Tinción  y  preparación  de  muestras:   Fijación  (calor  o  fijadores  químicos).  Para  que  los  microorganismos  no  se  vayan  del  porta.     -­‐  Tinción  simple  (morfología).  Colorantes  básicos:  se  unen  a  superficies  bacterianas:  azul  de  metileno,  cristal   violeta,  safranina,  verde  malaquita.   -­‐  Tinción  negativa  (morfología):  nigrosina,  tinta  china.   -­‐  Tinciones  diferenciales:  gram,  ácido-­‐alcohol  resistentes.  Dan  una  propiedad  de  los  microorganismos,   dependiendo  de  la  pared  celular  o  de  otras  características.     -­‐  Tinciones  estructurales:  negativa  (para  cápsulas),  esporas,  flagelos.  Permiten  ver  ciertas  partes  de  los   microorganismos.         2       La  tinción  de  Gram  diferencia  entre  2  tipos  de  paredes  de  microorganismos.     Fijación  –  colorante  inicial  –  mordiente  –  decolorante  –  colorante  de  contraste   El  decolorante  afecta  o  no  a  los  microorganismos  según  su  tipo  de  pared  celular.       Microscopio  de  campo  oscuro   Condensador  y  objetivo  especial   Iluminación  tangencial   Contraste  mayor   Aplicaciones:  observación  de  microorganismos  vivos  sin  teñir.       Microscopio  de  contraste  de  fases   Condensador  y  objetivo  especial  controla  la  iluminación   Contraste  mayor   Aplicaciones:  observación  de  microorganismos  vivos  sin  teñir.   Fundamento:  se  forma  una  imagen  sobre  fondo  claro  con  diferentes  grados  de   brillo  (material  denso)  y  oscuridad  (material  menos  denso=  debido  a  cambios  en  la   velocidad  de  la  luz  cuando  esta  pasa  a  través  de  objetos  con  distinto  índice  de   refracción.   Microscopio  de  fluorescencia   Utiliza  una  fuente  de  luz  ultravioleta  para  excitar  fluoróforos  que  presentan  afinidad  por   regiones  del  microorganismo,  pudiéndose  poner  de  manifiesto  estructuras  subcelulares.   Su  utilización  combinada  (fluorocromos  de  diferente  rango  espectral)  así  como  su   acoplamiento  a  anticuerpos  específicos  es  una  herramienta  muy  útil  en  investigación  y   diagnóstico.   Microscopio  confocal   Utiliza  un  sistema  de  iluminación  por  láser  que  permite  a  la  vez  excitar  y   detectar  la  luz  en  un  único  plano  focal.  La  producción  de  múltiples   imágenes  en  diferentes  planos  focales  y  la  utilización  de  software   adecuado  permite  reconstruir  imágenes  tridimensionales.   Debe  haber  fluorocromos.   Microscopía  electrónica   Utiliza  haces  de  electrones  como  fuente  de  iluminación  de  la  muestra  aumentando  el  poder  de  resolución   hasta  una  ``d´´  de  1nm,  consiguiendo  aumentos  de  hasta  100.000.  Permite  la  observación  de  virus,  que  tienen   tamaños  típicos  de  10  a  100nm,  y  estructuras  subcelulares  de  bacterias.   Hay  dos  tipos:  de  transmisión  y  de  barrido.   En  el  primero  se  prepara  la  muestra,  se  hacen  cortes  y  se  ven  estructuras.   En  el  de  barrido  se  hace  una  preparación,  se  incluye  en  una  resina  y  se  ve  la   superficie  del  microorganismo.   •  Transmisión:  detecta  que  los  electrones  atraviesan  una  muestra  de  escaso   grosor.   •  Barrido:  detecta  los  electrones  emitidos  al  excitar  la  muestra  y  proporciona   imágenes  con  perspectiva  tridimensional.     Preparación  y  tinción  de  muestras:   •  Transmisión:   1.   Fijación  (glutaraldehído)  y  deshidratación   2.   Inclusión  en  resina  epoxi   3.   Cortes  ultrafinos:  micrótomo   4.   Métodos  de  inciones:  sales  de  metales  pesados,  tinción  negativa,  sombreado  con  platino…   5.   Montaje  sobre  rejillas  de  cobre   •  Barrido:     3       1.   Filtrado   2.   Fijación  (glutaraldehído)   3.   Deshidratación   4.   Baño  metálico  (Au/Pt)   5.   Scanning     Criofractura   Técnica  de  criosublimación:  en  los   pasos  a)  y  b)  una  célula  eucariota   congelada  se  fractura  con  una   cuchilla  fría.  En  la  figura  c)  se  muestra   el  grabado  por  sublimación.  El   sombreado  con  platino  y  carbono  y  la   formación  de  la  réplica  se  muestran   en  d)  y  e).   Se  hace  un  molde  de  la  estructura   celular.  Quedan  al  descubierto  los   orgánulos.       4   ...

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