Tema 1: Introducció (2015)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Tecnologia del DNA recombinant
Año del apunte 2015
Páginas 6
Fecha de subida 21/04/2016
Descargas 10
Subido por

Vista previa del texto

Tema 1. Introducció Tecnologia del DNA recombinant = enginyeria genètica: tecnologia de manipulació i transferència de DNA d’un organisme a un altre, que possibilita la creació de noves espècies, la correcció de defectes genètics i la fabricació de nombrosos compostos.
DNA recombinant: molècula de DNA creada artificialment amb fragments de DNA de diferent origen biològic Una miqueta d’història... aquesta tecnologia es va iniciar als anys 50 amb el descobriment de l’estructura de doble hèlix del DNA i als anys 60 amb el desxiframent del codi genètic.
1.
Conceptes bàsics de clonació: la clonació consisteix en l’obtenció in vitro d’una mostra pura en grans quantitats, de molècules idèntiques d’un mateix fragment de DNA (gen/s) aïllat dels altres gens de l’organisme del que procedeix.
Els passos clau resumits són: identificació del fragment que volem clonar  aïllament d’aquest (1)  amplificació (2)  identificació/anàlisi/caracterització d’aquest gen(3). Depenent de la tècnica, aquests passos poden alterar el seu ordre.
1.1.Estratègies per obtenir una mostra pura d’un DNA/gen aïllar en grans quantitats:   PCR: no implica la mescla de fragments de DNA, es fa in vitro, de forma que no requereix organismes vius. Es tracta de reaccions successives de la DNA polimerasa que no implica recombinació del DNA. Pot tractar-se d’un pas previ a la següent estratègia.
Clonació en vectors: implica la recombinació de DNA en un vector , després aquest vector s’inserirà en un organisme amfitrió (bacteris, llevats, eucariotes superiors) per tal de ser replicat  Tecnologia del DNA recombinant. Ens centrarem bàsicament en aquesta estratègia en els punts següents.
Es tracta d’una propagació de DNA recombinant (molècula de DNA creada artificialment, composta per seqüències de DNA que en la natura no s’acostumen a trobar unides) en una cèl·lula hoste per obtenir moltes còpies de la mateixa seqüència.
1.2.Vectors (es veurà amb més profunditat en el Tema 2): seqüències de DNA que es repliquen de forma autònoma i poden portar fragments de DNA. Ens serviran de vehicle durant el procés de clonació de forma que han de ser capaços de replicar-se dins la cèl·lula hoste. Els més comuns són els plasmidis (forma circular, provenen de bacteris) i els bacteriòfags (forma lineal, provenen de virus).
2.
Síntesi, tall i unió de molècules de DNA: formació del DNA recombinant (es veurà amb més profunditat en el Tema 3):  Endonucleases de restricció: reconeixen dianes de restricció (seqüències de 4 a 8 bp palindròmiques) i tallen per aquestes. Com a resultat del tall, poden generar extrems roms o extrems cohesius. S’anomenen amb tres lletres agafades el gènere i l’espècie del bacteri del que es van aïllar originalment, de vegades presenten una quarta lletra que identifica el serotip del bacteri i per últim trobem un nombre romà que les identifica en el cas que en una mateixa variant s’hagin trobar diversos enzims amb diferent especificitat.
o Extrems roms: no contenen bases desaparellades o Extrems cohesius: els extrems 5’ o 3’ presenten bases desaparellades. Aquests són molt útils, ja que si es tallen els dos fragments de restricció amb el mateix enzim de restricció, hi haurà complementarietat de bases i sol serà necessària una lligasa per unir les dues cadenes. Hi ha cops que no és possible que el vector i el fragment de DNA tinguin la mateixa diana, la solució són linkers, que s’expliquen 4 punts després.
Enzims de modificació (metilases): es tracta d’un mecanisme de defensa contra l’entrada de material genètic d’un bacteriòfag. Per cada enzim de restricció, una metilasa reconeix la mateixa seqüència que constitueix el lloc de restricció i uneix covalentment grups metil a determinades bases del DNA en aquesta seqüència. La metilació de les bases impedeix la unió de l’enzim de restricció, de forma que el DNA propi no és hidrolitzat. De forma contrària, si entra en la cèl·lula DNA d’un bacteriòfag, el qual no està metilat o presenta un patró de metilació diferent, pot ser degradat ja que manca dels grups metil en la seqüència diana DNA lligases, fosfatas i quinases: actuen sobre l’enllaç fosfodièster, les quinases fosforilen resius, les fosfatases eliminen els grups fosfat i les lligases uneixen fragments de DNA DNA polimerases (Klenow, Taq, ...): s’usen per obtenir una gran quantitat del fragment de DNA que volem inserir en el vector (PCR, esmentada anteriorment) Linkers i adaptadors: molècula de DNA sintètic que conté un extrem cohesiu equivalent as generats per enzims de restricció i un extrem rom per unir-se al DNA que volem clonar.
RNA polimerases (SP6, T7, T3, ...)      3. Incorporació de DNA en l’hoste (es veurà amb més profunditat en el Tema 4): un cop tenim el nostre insert unit a un vector: DNA recombinant, aquest s’haurà d’introduir a un organisme amfitrió.
Es tracta d’alterar la paret/membrana cel·lular per a que pugui entrar el vector recombinant, es pot fer mitjançant sals que permetin el pas de DNA forà.
3.1. Transformació: captació i expressió de DNA extern 3.2. Transfecció: introducció de material extern en cèl·lules eucariotes 4. Selecció (es veurà amb més profunditat en el Tema 4): l’eficiència d’aquesta incorporació és del 1-5%, de forma que s’han de seleccionar les cèl·lules que han incorporat el plasmidi amb el nostre fragment d’interès. Depenent de la tècnica anterior a la recombinació amb vector, caldrà fer una selecció o no: 4.1. Amplificació selectiva de DNA per PCR  recombinació amb vector: aquí no es duu a terme el procés de selecció perquè ja ens hem encarregat anteriorment d’amplificar el nostre fragment d’interès. En aquest cas obtenim un únic tipus de clon.
4.2. Fragmentació de DNA  recombinació amb vector  selecció del clon d’interès: en aquest cas, en canvi, cada colònia formada conté múltiples còpies d’una molècula de DNA recombinant, la qual és diferent en totes les colònies i és per aquest motiu que s’ha de seleccionar.
 El conjunt de clons de DNA recombinant que conté tot el genoma d’un organisme s’anomena genoteca o llibreria genòmica de DNA: aquesta s’obté mitjançant la fragmentació del DNA i inserint cada un dels fragments generats en bacteris, aquesta clonació permet aïllar i amplificar fragments de DNA. Per tal d’identificar o seleccionar un gen concret, es requereix un anàlisi posterior (seqüenciació, hibridació amb sondes homòlogues al segment de DNA, ...)  Biblioteca de cDNA: en aquesta es representa la col·lecció complerta dels mRNA que es sintetitzen en un moment donat en una cèl·lula.
Tenim un mRNA de cadena simple amb una cua de poli-A en l’extrem 5’, de forma que usem una cua de poli-T com encebador per a que la retrotranscriptasa pugui sintetitzar una cadena de DNA complementària, creant-se així un híbrid DNA-RNA, degradem el RNA de l’híbrid i amb una DNA polimerasa i dNTPs es sintetitza la doble cadena de DNA, passant de un cDNA monocatenari a un de bicatenari. L’avantatge d’aquestes biblioteques és que són més petites que les genòmiques, no contenen introns i ens donen informació del que s’està transcrivint en un moment determinat en la cèl·lula.
5. Tècniques per a la identificació d’un gen concret: en una llibreria o en el procés de clonació 5.1. Tècniques de transferència o “blotting”: s’usen per separar i caracteritzar DNA, RNA i proteïnes.
Presenten un protocol general: electroforesi (útil per crear mapes de restricció) en gel per separar en funció de la mida i la càrrega les molècules (hi ha gels d’agarosa: separa mescles de fragments de fins 20.000 bases, s’usa en Southern blot o de poliacrilamida: separa fragments de fins uns milers parells de bases, s’usa en seqüenciació)  transferència a una membrana  identificació específica de la molècula desitjada mitjançant la unió específica amb una sonda, aquesta sonda ha de ser un fragment petit de RNA, DNA o un anticòs, ha d’estar marcada i ha d’interactuar de forma complementària i específica amb el segment que es vol localitzar.
5.2. PCR (Reacció en cadena de la polimerasa):  Elements necessaris: DNA motlle, encebadors (20-30 nucleòtids) específics per a la seqüència que volem amplificar, dNTPs, tampó de pH en el rang de 7,4, DNA polimerasa termoestable i termociclador.
     Aplicacions biotecnològiques: construcció de genoteques, seqüenciació de DNA, anàlisi de l’expressió gènica (RT-PCR), clonació de vectors.
Passos de la PCR: aquests són cíclics. Augment de 2n de la quantitat de DNA original, on n és el nombre de cicles.
o Separació de la doble cadena: 95ºC durant 15 segons.
o Hibridació dels encebadors: 50-60ºC, cada encebador hibrida en els extrems 3’ en la cadena motlle i la complementària o Síntesi de DNA: 72ºC, Taq polimerasa catalitza l’elongació dels dos encebadors copiant la cadena motlle.
RT-PCR: els transcrits d’un teixit determinat poden ser usats com a motlle per a la transcriptasa inversa.
Es produeixen còpies de cDNA que no conté introns, usa com encebador una cua de poli-T.
PCR a temps real: serveix per quantificar la quantitat de DNA de la nostra mostra, es necessita un senyal fluorescent proporcional a la quantitat de DNA sintetitzat en cada cicle.
o Sybr Green: és simple, econòmic, fàcil d’usar, sensible i versàtil, però durant la PCR pot unir-se de forma inespecífica a dímers de primers i altres productes inespecífics i obtindríem una major quantitat de DNA diana inicial quan en realitat n’hi ha menys. Sol emet fluorescència quan està unit a DNA de doble cadena o Sondes TaqMan: solucionen el problema de les sondes anteriors però són més cares, els resultats són més fiables. Consisteix en una sonda que conté dues molècules unides: Reporter, la qual emet fluorescència i Quencher, aquesta apantalla la fluorescència de l’anterior quan es troben relativament properes, quan la DNA polimerasa arriba en aquesta sonda, trenca la sonda i s’allibera Reporter, el qual emetrà fluorescència ja que no és apantallada per Quencher. Com en el cas anterior, la quantitat de fluorescència també és proporcional a la quantitat de doble cadena que es va sintetitzant, i a més, no hi haurà Reporter lliure si no hi ha cadena sintetitzada.
RT-PCR a temps real: s’usa per estudiar l’expressió d’un determinat gen calcular la quantitat de RNAm que hi ha, per aquests estudis sempre és necessari un gen de referència (gen housekeeping), aquest s’expressarà de la mateixa forma independentment de les condicions experimentals aplicades, un dels més usats és l’actina i el correcte és usar com a mínim 2 housekeeping, mirar que els dos es mantenen constants o quedar-nos amb el que es manté al llarg de les mostres. Tot i així, s’ha de tenir en compte l’experiment a l’hora de triar un gen de referència.
o Quantificació absoluta: amb una recta patró extrapolem la concentració de les nostres mostres o Quantificació relativa: mètode de Δ ΔCt, és el més usat. El rati condició problema vs control ve donar per 2-ΔΔCt. Es tracta d’un mètode aproximatiu ja que s’assumeixen eficiències d’un 100% per al den problema i el de referència.
- ΔCt = Ct gen problema – Ct gen referència - Δ ΔCt = ΔCt condició problema – ΔCt control Per un mateix threshold, totes les corbes tenen la mateixa concentració de DNA de doble cadena, la diferència està en el cicle en el qual s’ha assolit aquesta concentració, com més aviat s’assoleix, més concentració de mostra inicial hi havia.
Passa de forma anàloga com més tard s’assoleix, on tindrem una concentració menor de DNA inicial.
Mirar problemes, tot està més explicat! 5.3.Seqüenciació de DNA: consisteix en obtenir la seqüència de nucleòtids exacta d’un fragment de DNA, això ens permetrà tenir un coneixement més complex de l’estructura i funció d’un gen. Entre les utilitats trobem: l’estudi de la base molecular de les mutacions, les seqüències de DNA han rebel·lat regions reguladores comuns en tots els gens, la comparació de seqüències de diferents espècies proporciona una estimació de les taxes d’evolució molecular i la seqüenciació de genomes ens permet conèixer l’estructura del genoma. Té utilitat en la investigació dels processos biològics fonamentals, en el diagnòstic de malalties hereditàries i en la investigació forense.
Es basa en el principi de que molècules de DNA de cadena simple que difereixen en longitud en un nucleòtid poden separar-se unes d’altres per electroforesi en gel de poliacrilamida: es possible separar una família de molècules en una sèrie de bandes.
Hi ha diferents mètodes de seqüenciació:  Seqüenciació manual o o  6.
Química (Maxam i Gilber 1977) Didesoxi (Sanger 1977): els didesoxinucleòtids acaben l’elongació de la cadena degut a la carència del grup 3’-OH que es necessita per la formació de l’enllaç fosfodièster entre dos nucleòtids durant l’elongació de la cadena de DNA. Es necessita un primer per a que la polimerasa pugui iniciar la síntesi de la cadena complementària a la que volem seqüenciar, de forma que hem de conèixer un tros de la cadena per tal de seqüenciar la resta de cadena desconeguda. Es tracta d’una mescla amb el motlle, un encebador, dNTPs i didesoxinucleòtids, on per el mateix atzar es donaran totes les combinacions diferenciant-se en mida per un únic nucleòtid. Es duen a terme quatre reaccions, cadascuna amb un desoxinucleòtid marcat radioactivament, de forma que es poden observar en una autoradiografia. L’encebador és una seqüència coneguda, el que ve després és desconegut.
Seqüenciació automatitzada (1986): automatització del mètode de Sanger, usant didesoxinucleòtids fluorescents, cada nucleòtid és d’un color diferent. Es duu a terme la reacció en un únic tub, on el senyal fluorescent es pot quantificar. La seqüenciació es duu a terme en una sola reacció.
Aplicacions DNA recombinant: 6.1.Farmàcia: antibiòtics, nous fàrmacs, vacunes, hormones i teràpies gèniques 6.2.Diagnòstic: salut humana, agricultura i ramaderia, qualitat d’aliments i qualitat ambiental 6.3.Aliments: millora de processos, obtenció de nous aliments, desenvolupament de nutricèutics i d’additius 6.4.Medi ambient: tractament de residus, bio-remediació i energies netes 6.5.Mèdiques: és la més important  Obtenció de vacunes recombinants: alternativa a l’ús d’organismes patògens inactius S’extreu del DNA del virus petites parts que ens són d’interès i es fusionen amb un plasmidi bacterià, el resultat és un plasmidi híbrid que s’integra en el nucli d’una cèl·lula de llevat, aquest llevat fabricarà proteïnes víriques amb poder immunològic, aquestes proteïnes s’injecten en l’animal per tal de prevenir-lo d’una possible infecció. Això elimina el risc que provocava injectar el patogen inactiu, de forma que a partir d’aquest mètode sol fem ús de les part del bacteri que són capaces d’activar una resposta immunològica.
Algunes de les proteïnes que s’obtenen a partir d’aquestes tècniques són les que trobem en les taules, les que ella va esmentar son la insulina i l’hormona de creixement, a banda de les vacunes recombinants.
Producte Anticoagulants, TPA Factors de coagulació, Factor VIII Factors estimulants de colònies (CSF) Eritropoyetina Factors de creixement Hormona de creixement humana (hGH) Insulina humana Interferons Interleuquines Anticossos monoclonals (mAbs) Superòxid dismutasa (SOD) Vacunes recombinants Usos Tractament afeccions cardíaques o circulatòries, ja que activa un enzim involucrat en la dissolució de trombus (plasmina) Promou coagulació en pacients amb hemofília, s’eliminen els riscs d’infecció generats per múltiples transfusions Estimulen la producció de leucòcits, usats per tractar deficiències immunològiques i contra infeccions Estimula la producció d’eritròcits, s’usa per tractar anèmies en pacients amb malalties hepàtiques Estimulen la diferenciació i creixement de diversos tipus cel·lulars, s’usa per promoure la curació de ferides S’usa per tractar l’enanisme S’usa per tractar la diabetis Interfereixen en la replicació vira, s’usen per al tractament d’alguns tumors S’usa en infeccions amb VIH, càncer i deficiències immunològiques, ja que activa i estimula diferents classes de leucòcits S’usen en tests de diagnòstics, transport dirigit de drogues/toxines/compostos radioactius com a teràpia anti-tumoral, ja que tenen especificitat d’unió Prevé el dany tissular de ROS quan el teixit es sotmet breument a baix oxigen per després augmentar de forma abrupta, això passa en cirugies Proteïnes derivades de la càpsida viral efectives per alertar al sistema immunitari i a la vegada més segures que el virus inactivat  Diagnòstic de malalties d’origen genètic Cal tenir en compte que s’ha de tenir un coneixement previ de la seqüència de DNA del fenotip malalt, es construirà una sonda de DNA marcada amb la seqüència complementària i mirarem si es produeix hibridació amb la mostra problema .
...

Comprar Previsualizar