Técnicas de siembra y aislamiento (2013)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 1º curso
Asignatura Microbiologia
Año del apunte 2013
Páginas 9
Fecha de subida 20/10/2014
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CLASE DE PROBLEMAS DE MICROBIOLOGIA: SESION II. Técnica de sembra i d'aillamentt.
(ddiapositivas estas) estuvimos viendo lo de las técnicas microscópicas. Vemos imágenes estáticas pero por mucho entrenados que estemos, tampoco podemos saber mucho. No hay sificiente para identificar miroorganismos. La micrografia es lo primero pero luego van los cultivos , poder manipularlos hacerlos crecer y observarlos.
Estuvimos hablando del metabolismo . Para trabajar con los microorga en los laboratorios tenemos que hacer que se multipliquen, qe aumente el número de bacterias . Tenemos que reproducir en el lab las condiciones para que el microorganismo esté como en su propio medio con sus condiciones para que se desarrolle bien. Tenemos que aportarle nutrientes, fuente de carbono , de materia orgánica etc, para que tengan metabolismo y funcionen y todo eso. Cuando vamos a hacer un cultivo lo que se trata es de poner estos microorga a creer en un medio que es artifficial, en una mezcl artificial con nutrientes y esto para meterelos allí. Cuando estamos decidiendo los nutrientes tenemos que pensar que hay unos que son macronutrientes que se necesitan en grandes cantidades porque son la base de la estructura celular, la base de las macromokléculas ( HON) pero tmbien hay cosas queosn secundarias en cantidad pero tmbie son importantes ( PS) . Tmbién hay micronutrientes o elements traça que son en baja concentraciónm echarlo en poca cantidad , no es que sea un gran componente sde las estructuras cellares pero son utilizados en determinados enximas, cofactores, fotosintemas... vamos, que se necesita.
Diapositiva de factores de creixement. No lo sintetizan y hay que dárselo .
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO (ver diapositiva) Según la consistencia: se claseifican en: - medios de cultivos liquidos (caldo donde están todas las sustancias que hemos pensado que tenían que estar allí pero están en la superficiie, conmo un redbull) solidos (tienen consistencia. Es un medio liquido en realidad al que se le han metido un solidificante, un espesante de manera que el medio solido tiene consistencia como de membrillo, gelatinosa, un poco más sólido que eso . De manera que si ponemos los microorganismos crecen por encima de esto sólido) El agar agar es un polímero que viene de las algas y esto es el solidificante.) aquí vemos que sobre la superficie se forman colonias bacterianas. Una colonia no deja de ser más que una montaña de bacterias que proviene de una bacteria que cayó ahí. Aquí vemos el crecimient porque se ven las colonias semisolidos (solido pero con menos solidificante) permite que el bicho se mueva un poco por el medio , el crecimiento en profundidad, pero también la formaci´ón de colonias.
TECNICA ASEPTICA para hacer la siembre para pasar de la muestra a la plaza de petri necesitamos algo que haga ese traspase.
En microbiología está la nansa de cultivo, de siembra. (lanza de cultivo) tiene un mango de plástico y punto de hierro . Con esto cogeremos una poco de muestrra y lo pasaremos al medio de cultivo.. Esta lanza, el extremo tiene que estar estéril. No puede haber ningun tipo de microorganismo porque si esta nansa la piso etc etc lo que acabará creciendo en la placa no será solo lo que hay en la muestra biologica sino tmbien todo lo que se le ha puesto por el camino. (potipoti de cosas hahaha). Cómo la esterilizamos? Dos posibilidades: nansas todo de plastico de un solo uso, que ya viene estéril y la tiras o también lanzas metálicas y las esterilizas al fuego purificador!! con la llama. Esta flama pone incaldeciente la lanza y ahora es estéril. Cuando la tenemos estéril pasamos a poner la llama en el borde del tubo, cogemos muestra, quemamos, y tapamos (mirar la diapositiva con dibujitos y todo).
Esta muestra que hemos cogido podemos sembrarla en un medio líquido O en un medio sólido (sembrar de esta muestra sobre al superficie del medio sólido, de la placa) , será fácil rajar esto asi que tener cuidado.
Hay diferentes técnicas para sembrar sobre la placa esta (otra diapositiva) Siembra por agotamiento: hacemos estrías y saldrán uchas bacterias y empezarán a crecer y a hacer colonias veremos un magma baceriano que se va solapando... porque había muchas bacterias. Lo que nos interesa en un medio sólido es ver las colonias bien. Es por eso que lo que se hace e suna primera estria, con una segunda lanza estéril hacemos una segunda estría (2), cogemos una tercera y otra estría (3) y van quedando menos y la cuarta (4) y ya las últimas las ves separadas y perfectamente claras.
(diapositiva de la bacteria solita) 18 horas de cultivo y vemos una montaa de bacterias y el primero no lo veías pero lo segundo sí (dipositiva de la sembra en estría) si nos acercamos mucho mucho a esa colonia del paso cuarto llegamso a la diapositia de las dos fotos grandes (diapo) lode la derecha son montañas de bacterias que provienen de una quees´ta abajo de todo.
Siembra en superficie: cogiendo con una pipeta un volune determinado, escamparla por toda la superficie y luego se ven las colonias Siembra en profundidad o en masa : sobre una placa de petri pones la muestra y luego metes el medio (que es sólido) , ya qe al prepararse es líquido muy caliente y cuando se enfría se solidifica c. Cuando está liquido es cuando lo echamos pero cuando se solidifica y el microorganismo crece no crece solamente en superficie, algunas suben arriba pero hay muchas colonias que quedan dentro del medio (n el mazacote).
Esto tiene ventaja porque permite recuperar bacterias que son anaeróbicas etc.
(diapositiva de polaca verde) siembra en superficie. Se pueden ver ya no solo colonias sino diferenciar los diferentes tipos de colonias.
Cada colonia proviene de una bacteria por lo que se pueden contar cuántas bacterias había en la muestra original.
(diapositiva asi mas amarilla) siembra en profundiad: colonias que muchas están dentro del medio. Otra cosa muy interesante es que cada bacteria hace o un tipo de colonias diferentes, colonias caracteríasticas de manera qe en función del asectto de la colonia se puede ver el tipo de bacteria que es. (igual que medio se podia imaginar con el microscopio).
Para determinadas tecnicas nos puede interesar cuántas bacterias o moléculas hay . Un método es el de calcular el numero de bacteias que hay en la muestra original haciendo un aillament per dilució (diapositiva de aillanent per dilució) un numero de bacterias super elevada coge sun ml y lo pones en una placa y hay tantasbacterias que sobrecrecen y no las puedes contar, tienes que hacer disoluciones . Un banco de disoluciones con 9 ml del medio de cultivo y pasas un ml del frasco inicial .
Con esto sí que se puede hacer siembra en placa ya que se coge un ml y s epasa a una placa y así sucesivamente.. .se incuba y se vuelve a mirar. Si hay 0, mal, si hay 2, malo tmbien, y si hay demasiadas tmpocom pero en eeste caso habrá dos disoluciones en las que se pueden contar (en este caso 17 y 159).
No se puede decir que haya entoncecs 159 , ya que esto está mil veces diluído. De manera que ahí abajo hay mil veces menos de lo que hay en el tubo de arriba (el original). Si hubiésemos cogido el de 17...
x10000... no da igual! La ciencia biológica es como imposible que hagas dos disoluciones y que salgan iguales, lo quesí importa es que sigan el mismo orden(la misma proporción). (proporción que hay en la u´ltima fila de cosas de la diapositiva).
Esto es un ejemplo pero podría ser que el expterimento n ose pasara un ml, sino 7 microlitros. Si lo pasas así entonces cuando salen 159 no es por ml sino en cien microlitros, eso hay que tenerlo en cuenta.
(diapositia de disenny de medis de cultiu) cuando tu formulas o preparas un medio de cultivo par ahacer un cultivo tienes que tenr en cuenta los nutrientes, qué pones para que le miroorga encuentre los nutrientes que necesita pero este caldo que preparas tienes que vigilar queee tenga el PH y la humedad adecuados. (si es emasiado ácido por ejemplo habrá bacterias que no puedan crecer y que queramos. ) , la temperatura a la que pnemos a crecer estos microorganismos, los incubas y luego miras las colonias. Depende del tipo del microorganismo lo tencremos que tenr una tmperatura o a otra. Incubar puede decir poner una estufa por ejemplo a 36 grados (cosas a¡patógenas en las que está metío este hombre). Pero habrá otras que necesiten más o menos grados, dependerá y habra que tenerlo en cuenta. La iluminación, (microorganismos fotoutótrofos, tienes que ponerles con luz porqu eno tienen energía, no pueden crecer), el tipo respiratorio, en presencia de oxigeno o en ausencia? (condicines aeróbicas o anaeróbicas) . Después las condiciones tienen que ser de esterilidad, componenetes estériles como hemos dicho de la lanza antes. Y después puede ser necesario otros requerimientos, en función del grupo microbiano con el que estés trbaajando puede ser que necesites algo específico (Halófilos nececsitamos mucha concentraciones de sal).
CONDICIONES AMBIENTALES DEL CULTIU hay estufas para la incubación de las placas (lo de la izquiera de la diapositiv), esto en condiciones aeróbicas y las bacterias van creciendo. Y lo de la derecha e suna campana de anaerobiosis, que es como una jarra hermética que cogen todo el exceso d oxígeno. No están en el vacío , sino queu están en una atmósfera que no tiene oxigeno (en el caso de la foto de la derecha).
1/11(2013(diapo) SEGONS LA SEVA FORMULACIO Dos tipos de medios : definidos y complexos. Los definidos son aquellos medios que nosotor spreparamos de manera muy sinteética y en el cual nsootros metemos los componentes quimicos que necesita este microorgamismo. (medio minimo de composición quimica conocida).
Los complexos son medios en los cuales ya no metemos las sales que contienen los nutrietes o los azúcares o... sino que están constituídos de estractos de productos naturales , más complejos. Es un medio mucho mas rico , con más nutrientes (metemos carne, sangre etc) .
(diapo) medio mínimo, no crecen muchos microorganismos, . En cambio en medio rico, donde hay más nutrientes ymás variados y en más cantidad, el hacer crecer microorganismos, crecen de una forma más vigorosa. Son capaces de hallar microorganismos. Serán más delicados estos (diapositiva: Segons les seves aplicaciones) Medios diferenciales (diapositiva de fotos rojas) en un mismo medio de sangre podemos ver microorganismos que hemolitzan totalmente la san y ya no la vemos roja sino transparente, o microorganismos que hacen una hemólisis parcial (trancament de lasangre pero no total9, y queda de tono verde, ) o microor que no hemolitzan o no trencan (?) la s.angre. (la alfa es la hemólisis parcial).
Medios selectivos.: permite el crecimiento de unos microor pero tmbién impiden el crecimiento de otros.
Ponemos un inhibidor de algún tipo de microorg, pero qe no afectan al crecimiento de otros. Ejemplo: medio que es selectivo porque selecciona el crecimiento de bacilos gramnegatios. (no sé cómo se llama este medio, me he perdido). De ma conqui creo. (luego lo pongo) Cuando tenemos un medio de cultuvo que permite el crecimiento de todo tendremos uchas colonias pero si lo hacemos en medios diferenciales o medios selectivos podremos ver qué tipo de microor ccrecen o no etc, las colonias y eso.
(diapos: ) Medios seltivos i diferenciales: sólo deja crecer los staphylococus, es selectivo porque sólo deja crecer eso. Pero en función del a especie microbiana , es capaz de diferenciarlo. Por ejemplo los aureus que cuando crecen hace un viratge de PH y los otros no. Por eso son selectivos y diferenciales. Este se llama Medi de Chapman.
Dato de repente: (El medio de ante de los bacilos es selectivo y sel llama de Mk Conkey. Es selectivo porque permite el crecimiento de los bacilos GN , pero dentro e eso hay muchas especies y géneros y hace una pequeña diferenciación entre los que fermentan la lactosa y los que no ) (diapo) Media d'enriquiment Medios que afavorecen el crecimiento de un tipo de microosgarmismo determinado. El selectivo inhibia uno y permitia a otro. Pero estos que normalmente son medios liquidos, favorecen a un grupo determinado para que aumente su proporción denro de total de la población bacteriana. Por ejemplo: en el caso de diagnosticar una salmonelosis (gastroenteritis svera). Tienes que buscar microorgaismos en la caca, y ahí lacantidad de microorga es inmenso y la proporción de la samonelosis seria pequeña. Para un medio de cultivo tenemos que hacer que se llegue a ver a pqueña salmonella . Hace falta este tipo de medio por tal de que aumente su nombre, la cantidad e salnonelas que hay. Cuando pasamos del medio liquido a la placa, ahora habrá más salmonella y será más fácil detectarla.
->IDENTIFICACION MICROBIANA (segunda parte de la sessión ) (cre oqehemos cambiado e diapositiva) TECNICA DE SEMBRA Y DeaiLLAMENT DetEccio I IDENTIFICACION PROBLEMES SESSIO 3 tendremos que una ver que lo hemso visto, el tipo de microorhanismo que es y suscaractreísticas etc.
IDENTIFICACION: para identificar un microorg hay dierentes metodologías (diapo) TECNIQUES .microscopio(no definitov) .caracrerísticas del cultivo(no definitvo) .cararteristicas fisiologiques y bioquimicas (en función de qué nutrientes utiliza de las enzima de las que dispone). Es posible definir una lista de cosas por asi decirlo que usa o que no usa para diferenciarlos .
Podemos deifnir un patrón de sustancias que usan y que no y qu es diferente a lo que hacen otros microorganismos.
(diapo fotos rosas) lo primero tenemos que conseguir hacer una siembre, cultivo que permite aislar colonias , obtener colonias aisladas. Esto es importantes( (diapositiva identificacion bacteriana) si no cogemos una colonia sola y hacemos un cultivo puro, si no lo hacemos, y queremos hacer lasp ruebas bioquimicas, no obtendríamos un patrón de un microorganismo para ver qué microorga es, sino el de todas las que hemos cogido. Lo que queremos e spara cda especie, conocer el patrón por lo que tenemos que cger uno solo y de una única especie no de varias especies microbianas . Es muy importante haacer cultivo puro por eso. Todas las colonias de la foto de abajo del todo son iguales porque vinieron del mismo microorganismo. Una vez tenemos el cutivo puro ya podemos enfrontarlo a diferentes sustancias (diapo de tubos) y ver si utilizan esas sustanias o no las usan. En el caso de la urea, usamos algun tipo de indicador como se hace siempre de ph o de lo mil cosas más. En este caso ponemos la bcteira y la dejamos incuvar, pasadas 18 horas si sigue gual es que no lo ha usado pero si ha cambiado decimos que ha utilizado esta sstancia, ha fermentado y ha hecho un cabio de color en la muestra.
En lafoto de abajo a la derecha, agua oxigenada y una bacteria y comienza a aparecer burbujas e oxigeno es que usa la catalasa, si no pasa nada es porque no utiliza esta enzima . Si queremos un patrón neeiamos cuantas más sustancias mejor porque una sustancia lo pueden usar muchos microorganismos.
(diapo de muchas cosas como dedos) esto es una tira de api, reacicones quiimca miniaturizadas y cada tubo que es peque contiene la sustncia deshidratada, las echams, dejamos incuvar y al dia siguiente vemos si la ha usado o no. de manera que aquí tenemos una formula un numero más complejo y podemos hacer un patrón (usa no usa no usa usa usa no usa...) (hay otra diapositiva con otro tipo de api) tampoco tiene mucha importancia.
(diapositiva) SISTEMES AUTOMATICS mirar el esquema DIAGNOSTIC DIRECTE (diapo) hay metodos de identi y de deteccion de la presencia de microorga que lo llamamos métodos directos.
Estos permiten detectar deterinadas estructuras del microorganismo . No se basan en ver si fermenta el azucar o lo que sea, sino en la deteccion de algun metabolic que produzca el microorga y de algunos componentes microbianos, los metabolics los libera al medio la bacteria, o de componentes que tiene la bacteria. Estos son estructuras proteicas, antigénicas de la pared bacteriana o de agun componente bacteriano o tmbién de fragmentos de su material genómico.
La primera en explicar es una metodologia que se basa en la cromatografía de gases. Se puede aplicar de diferentes maneras y permite detectar determinads componentes quimicos de las bacteriaas por ejemplo, es posible mediante eso determinar compoentnes de carbono de su pared celular. Cada especie tiene una cokmposicion determinada, o cantidad (es específica). Cada pico corresponde a un determinado tipo de ácido graso, y amb un determinado numero de carbono. Para cada microorga podemos tener un cromatograma específico. Esto no es universal , se usa sobretodo para microbacterias (que tienen una pared más grosuda de lípidos) .
(diapositvo de colores a la derecha) otro metodo directo son las técnicas inmunológicas de detección de antígenos. Son metodos directos porque son tecnicas que directamente están detectando algún componente microbiano, alguna estructura del microbiano. Son técnicas que se basan en utilizar anticuerpos (inmunologicas), que obtenemos de hibridomas o animales, para la detección de antígens bacterianos (estructras bacterianas de su pared, del flagelo, de la cápsula, que generaban mucha respuesta inmunologica) . Se basan entonces en la reaccion antigeno-anticuerpo, en la afinidad antigeno.nticuerpo. Nosotros disponemos de anticosos y detectamos los antigenos microbianos. Si usamos un anticos, como son especificos de un antigeno determinado, estamos buscando un antigeno determinado, sirve para determinar la presencia de un antigeno determinado (no como pasa en un cultivo de eh a ver qué pasa) . Son técnicasque permiten estudiar muchas muestras a la vez simultaneamente, veremos cómo permeten a la misma vez la presencia de microorganismo en muchas muestrasbiológicas diferentes. Son muy rápidas, cuando hablabamos de los cultivos era mucho más lento, coger, sembrar, y esperar horas y horas, semanas, meses... Las tecnicas inmunologicas, las reacciones se pueden ver desde pocas horas a pocos minutos, son rápidas. Y después , es útil en pacientes tratados. Esto para micro médica: para infeccion urinaria, cogemos una muestra de orina y la sembramos y la ponemos a la estufa y al dia siguiente encontramos un microo.... y haemos identificación.
Si estapersna con la infección ya lleva un par de dias que le molesta y otra vez le pasó y le dieron antibiotico que le fue bien, y se tomó dos dosis, no le ha curado pero es suficiente para que los microorganismos estén tocdos, y el microorganismo esta alterado y el cultivo sea negativo. No se ha curado y no le podemos decir q´´e microorganismo es porque no crece. Las tecnicas de antigen anticos no se necesita que esté vivo el microorga, porque sólo se quiere ver la presencia del antigeno. Si cogió antibioticos el cultivo lo mismo no funciona pero una tecnica de antigeno puede que si, porquesolo requiere que haya antigeno.
DIAGNOSTICO DIRECTO: (D) Técnicas de bases inmunológicas. Creo que nos quedamos por aquí. No es que podamos ver todo lo qe hay en la muestra pero si la presencia de un microorganismo determinado.
(D) Ventajas (diapositiva.) Diría que todo esto ya lo hemos dicho.
En los cultivos además de aislar el microorganismo podemos hacer estudios de cuál es su sensibilidad antibiótica, a qué antibiótico es resistente y con esta técnica no puede ver esa sensibilidad (explicación de lo que pone ahí) (D) Cuatro métodos diferentes CIE; EIA; ICT; LATEX... que son diferentes pero que tienen la misma base, fundamento, que es launión antígeno, anticuerpo, la afinidad “”” La CIE foresis, que se desplaza en gel, contra porquue va unos en un ldo y otros hacia el otro .
(D) la cosa gris es un polímeto que e su p oco gelatinoso y que permite el desplazamiento por ella. En esa superficie o placa podemos practicas unos agujeros . En uno el anicos que teníamos y en el cargaríamos aquel microorganismoq ue no sabemos cual es, o a muestra biologia que queremos ver la presencia del antígeno. Estos son ejemplos. Electro foresis, tenemos polo negativo y polo positivi. Los antígenos tienen negativo y corren para derechaa través de los poros y los anticuerpos hacia la izquierda, en sentido contrario. Como este anticuerpo es especifico del antigeo, cuando se encuentran se unen . Si el antígeno no fuera ese sino hemofilos influenza eso continuaría para la derecha ya otra pa izauierda porqueno se conocen. Todos suelen ir a la misma velocidad, llegan e interaccionan y hacen una macromolécula. Se van uniedo y frma una macromolécula, eso ya no se puede mover de ahi porque es demasiado gran y no pasa por los poros y lo que pasa es qque precipira. De manera que una vez que tenemos reaccion de elctroforesis (1 h) para ver si ha habido reacción hay que mirar si entre los dos poros se ha formado una banda de precipitación (DIAPOSITIVA OTRA) (D) de círculos Técnica de enzimo inmuno ansae . ( EIA).
En esta técnica, la reacción tiee lugar en estas placas que son de plástico y tienen 95 oyuelos, y en casa una se puede poner una muestra . (D) los puets y lo de arriba una pipeta multicanal.
Anticos que se ha unido covalentemente a la superficie del plástico muy fuertemente. Este es el que hemos puesto el que detectara el antigeno que estamos buscando *1., la *2 es el antígeno, y si no es de ahí se queda flotando, pero si nom se unen. Como son pequeños no lo vemos y para ver esta unión, hace falta anticuerpos conjugados. Estos es anticuerpos que hemos hecho nosotros que tmbien es pecifico de este antigeno, y esta reacción de sandwich tmpoco lo vemos. Este anticos conjugat lo es porque lleva enganchado unos enzimas. Esto tmpoc lo vemos. Para eso se mete el substrato cromogénico. Si tiene lugar esa producción de productos (D) ponemos dos pouets, pondremos una uestra que es positiva, que tiene el antigeno que buscamos y la otra no está el antígeno que queremos. Por eso salen cosas rojas y en la derecha no habrá nada. Ahora viene un paso de rentat, de limpieza. (1) en la derecano quedará nada y en la izquierda los antigenos que se han engnanchado (2) hemos metido ahora el conjugado pero como no hay antigeno en la derecha pues no se engancha pero en la izquierda sí.
(3) Lavado porque si no se quedan los conjugados y si metemos otro substrato puede que salga positivo, pero como seguimos sin verlo tenemos que meter el cromógeno (4) l,ometemos en los dos lados, en la derecha no pasa nada porque nohay ningún anticu conjugado pero en la izquierda se une, reacción enzimática y cambia de color de manera que al ojo podemos ver entre dos pouets cual es positivo y cual es negativo. Y tmbien podemos ver la cantidad de luz (5) con esta gráfica.
Otra técnica de detección antígeno (D) fila gris con hoyuelos, otra menra de verlo (D) otra manera de ejemplo (D) es relacionada pero no es lo mismo. Cuando desarrollamos técnica de ELISA tmbién se puede ver si nosotrs hemos producido anticuerpos . Cuando desarrollas el ELIS no es lo mism odetectar antigenos o anticuerpos, lo qur tienes que fijas a l a placa no es lo mismo. En la izaquierda si quires ver si has producido anticuerpos sobre la hepatitis B tienes qe meter antígenos. Y ahora el conjugado será contra el anticuerpo no cntra el antígeno, siempre para lo que bscas (D) se trata de una imnumocromatrografía. ICT pones la gota esperas cinco minutos y miras si sale la barra . Un tipo de carcasa y pones la gota, esperas, y pueden pasar dos cosas, que salga solo a banda de control , que quiere decir qu eha salido bien pero que es negativa o que te salga la de control y la banda de detección y que e spositiva. (izqui y derecha respectiv). Pero esta cosacómo funciona (DI) dentro de la carcasa o que hay es una tira de microcelulosa (papel), tiene diferentes áreas, superficies. Por un lado hay la linea de muestra , la control, para que salga para saber que ha salido bien, luego el soporte donde está el anticuerpo conjugado y después un sitio donde pupones la muestra y un sitio arriba que lo que hace que la muestra fluya para la arriba. (lo amarillo es lo que lo hace). Ahora veremos cómo tiene lugar, cuál es el procedimiento (DII) Esto es la carcasa, pero es un ejemplo. Tanto lo s de las dos líneas, están fijados. Y los anticuerpos conkugados no están fijados. Esto es antes de empezar. Donde ponen la letra opnemos la muestra. Como esto es fluido y e sun papel, por capilaridad sube para arriba por la cosa absorbente. En el 2 com on oestá fijado siguen arrrastrandose y llegan a la control y a la linea de muestra pero los antigenos quedan retenidos por los anticuerpos de la linea de muestra y el anticuerpo cojugado queda retenido en su paso por la linea control. Por eso siempre sale la linea control, porque para qe salga no tienes que hacer nada, todo está puesto y fijado ya. No necesita antígeno o no. esto tmién sirve para saber si todo esto ha pasado por encima de la linea control, de la linea de muestra. Si no, no sabemos si es negativo o es que no halllegado a producirse la reacción..
Lo que lleva los conjugados es molécula de oro coloidal y lo que pasa es que cuando se acumulan , pigmentan. Y por eso vemos la banda de color rosa o magenta... (por el oro coloidal). Esto son técnicas rápidas en comparación con los cultivos de antes (todas las dichas y esta) (DIII) MUESTRA NEGATIVA...aglutinación de partículas látex. Lo que tenemos en una suspención homogénea, de partículas de micro bolas de este molímero. No las vemos, son micro, tienen adheridas a su superficie anticuerpos, todos iguales, que detectan el mismo antígeno. Si cohemos una gota de esta suspensión y una gota de agua y no estám las ponemos juntas y eso queda así , porque no se ha detectado nada.
(DIV) Ahora bien, si en la suspensión si hay antigeno que buscamos en reconocido por los anticuerpos , si se quedase asi tmpoco lo veríamos asi que o que sucede es que se forman (DV) este tipo de acumulos antiuerpos de particulas diferentes reconocen el antigeno por extremos diferentes y se forma esa macropartícula, aglutinadas (MUESTRA POSTIIVA) ya no son micro y podemos verlas, son macro. Si la uestra e spositiva lo que vemos es que en esa suspensión que era homogeénea ya no lo es porque aparecen grumos, visualmente podemos ver si es positiva o no. -y este tipo de reacción de acumulación tiene lygar en dos o tres minutos y esto es muy poco.
(DVI) Hemos pasado unas cuantas diapositivas.
(DVII) DIAPOSITIVA DE LA ONDA *7. en todas las reaccions antige.anticuerpo. Para que se de la reaccion tiene que haber un area de equivalencia, de igualdad entre la cantidad de anigeno y cantidad de anticuerpo. El más habitual es que haya poco antígeno. También se da paradojicamente , que cuando hay demasiados antígenos tmbién es negativo el resultado y si ay demasiado poco tmbién. Poruqe tiene que haber una equivalencia. Este defecto de da negatio porque me he pasado de antigenose llama efecto prozona.
15/10/2013 hoy acabaremos con esta parte.
(DVIII) (DIAGNOSTICO DIRECTO PUESTO EN HOJA FECHA) Técnica que detecta un componente estructural, proteína o polisacárido etc que están en su DNA. Son técnicas de detección genética. Detectan fragmentos ESPECIFICOS de Dna. Igual que los bacterios tienen estructuras que son especificas de aquest microorganismo y podemos ir abuscarlo al anticuerpo específico, tmbién lo podemos hacer cin la secunecia del Dna, porque hay fragmentos y genes que pueden ser comunes, compartidas, y esto no nos sirve porque si detectamos parte de DNA que es comun en el mundo bacteriano solo podemos decir que hemos encontrado una bacteria pero no el microorganismo, y como queremos saber el especifico.... fragmento que no encontremos en otros.
(DIX) Si teneoms que hablar de deteccion genetica tenemos que dar una pincelada de lo qoue tenemos que buscar caracteristicas del Dna y en funcion de como es ese Dna y como se replica, nosotros hemos desarrollado las técnicas de diagnóstico. Es una cadena de doble hélice que son dos cadenas de pentosas con bases nitrogenadas, y estas últimas (A, T, C, G), son complementarias, de manra que las hebras de Dna hibridan por complementariedad. Una va en un sentido y el otro en el contrario. Por lo que en una hay extremo 5' y en el otro radical 3' y en la otra hebra queda al revés. De manera que si dibujamos o escribimos la secuencia de Dna tendríamos que escribir las dos hebras que son complementarias y cada uno ira en la dirección que hemos dicho (dibujos de latabla de la derecha) . El Dna se duplica replica cada vez que se divide la célula. Cada tres bases, codifica para un aminoácido. Este código es degenerativo, porque pueden haber combinaciones diferentes que codifiquen el mismo aminoácido.
(DX) REPLICACION Esto nos interesa. El Dna se replica, quiere decir que hay una copia mediante la polimerasa (enzima), de una hebra sintetizando la otra. Es ecir, que esta hebra, doble hebra en algún momento tiene que abrirse para pemitir a ADN polimerasa, copiar esta hebra. Tmbién que la DNA polimersa para empeizar a trabajar necesita unos primeros nucleótidos donde engancharse y empezar a copiar. (parte naranja de RNA de arriba). Se llamará RNA primer. Si una hebra es copia , quiere decir que la replicación ex semiconservativa, que de una hebra de doble DNA cuando se replica hay una hebra que proviene del DNA de la molecula inicial y la otra es de nueva síntesis, siempre hay una que es el molde. Cuando copiamos el DNA, como es de doble hélice, la doble hebra setienen que separar para poder copiarla, hay algunos enzimas que actúan a estr nivel , la HELICASA que abre la doble cadena ara permitir que encaje la la DNApolimerasa. Hay una hebra que se copia en el sentido correcto, seguido, de manera que va pasando pero la otra hebra la coge a cntrapelo, as´i que tiene que ir haciendose a trozos, habrá pequeños fragmentos de RNA, haciendo una hebra discontiua.
(DXI) El cromosoma bacteirano, el DNA, es una molécula circuular cerrada. Y normalmente tiene un origen de replicación: un sitio por el cual ula molécula empieza a duplicarse. (dibujo izquierda).
Esto quiere decir que en el origen de replicación va hacia los dos costats. *4(D). Si coges dos hebras que están enlazadas, si las quieres separar esto no es fácil , en el caso del circulahr hay unos enzimas que son las TOPOISOMERASAS , que tallan unas de las hebras y liberan la tensión de la fuerza torsional. Las TOPOISOMERAS son las dianas de las quinolonas (antibióticos) que actúan a nivel de DNA. Las que usan para replicarse son tmbieén DNA polimerasas.
(DXII) PRIMER METODO: SONDAS GENETICAS Una sonda genética se refiere a un fragmento corto de DNA que nosotros sintetizamos en el laboratorio que es complementario de ua secuencia específica del DNA microbiano. Ahora tenemos un frag de DNA que es complementario de un trozo de DNA que solo sintetiza este bacterio. Si sintetizas un frag de DNA del grn que codifica esto, es específico de este bicho. Esto sirve para conocer la presencia de este frag y por tanto de este microrganismo. Por ello fijariamos sobre superficie inerte, que puede ser filtro de papel, plastico , vidrio, la bacteria que queremos saber si es este miroorga. Lo primero es trencar esta bacteria (romperla)de manra que el DNA que está en el interior microbiano quede libre, expuesto (pero fijado). Edspues aplicamos algun metodo que normalmente s ehace por calor para que la doble hélice se separe y ha y una desnatralización de este DNA. (normalmente a calor elevado, 90 grados, se vuelve de una sola hebra) por lo que ahora tenems sobre esta superficie tenemos fijado el DNA libre y fijado de una sola hebra. Por eso ahora podemos poner la sonda, si este miroorga es el que creemos, el que es coomplementario de nuestra sonda, como solo esta de una sola hebra bajamos la temerpatura, ponemos la sonda y por complementairedad se unirá e hibridará con el DNA microbiano en esa secuencia que sea específica. Si n oes el que pensamos, la sonda no se uniría y con el limpiado , se iría y solo quedaría el DNA fijado. Ahroa esto no lo vemos, por lo que hay que hacer comolos anticuerpos conjugados. La sonda tiene que levar alguna molecula enganchada, sonda marcada, con molécula fluorescente o colorinétrica, o radioactiva, de anera que puedas evidenciar esta union por la presencia de est emisión de florescencia, luz, o radioactividad. SI no se da la cosa, cuando limpias la zona no habrá emisión .
(DXIII) Diapositiva 8 (marcada ) Para que funcine la sodna tiene que tener mucho DNA, por lo que está gay cuando tenemos la colina aislada, y tienes sustancia pero a veces nos insteresará como en la detección antígeno, directamente de la muestra biológica (sin pasar por el cultiv), por lo que si no hay suficiente cantidad de microorganismo, las sondas no emitirán suficiente fluprescencia.
(D) (9) en este caso utilizamos las tecnicas de amplificación necesitamos separar las hebras, una unión de “primers” (secuencia inicial que neccesitamos que se una), una polimerasa(enzima), unos aparatos automaticos para llevar a cabo esta rección y un método de detección (DI) lo mismo Por qué es importante los primers especificos? Porque nosotoros lo que queremos es n oaumentar todo el cromosoma, el nunero de veces que está el cromosoma presnete en esta muesta, sólo necesitamos aumentar el numeoero de copias de la secuencia especifica wue nos servirá para decidir si este microorgaismo es el qu e creeemos. Necesitamos la sencuencia concreta que queremos detectar. Estos primers o cebadores, son una senciencia complementaria a un trozo de la sencuencia específica.
(DII) (DIII) A yB Primero lisis del microorganismo, liberación del DNA, y en esta termmomix metemos los primers, nucleótidos (elementos de la cadena) que hará falta usar la polimerasa, para poder hacer la síntesis de nueva hebra, de nueva cadena.
Un ciclo de PCR es un proceso en 95 grados de separación de las hebras. Una vez separadas bajamos la temperatura, y los primers (explicado en la diapositiva a lápiz.) Había un problema inicial la polimerasa se desnaturaliza a 95 grados. De manera que las primeras PCR cada veces que se acababab un ciclo, debías de meterla tu porque al pasar del ultimo al primero se desnaturalizaba.
“ ahora usaremos lo de antes de la Tap polimerasa, termus acuática), son resistentes a altas temperaturas (hipertérmicas), que no se desnaturalizan.” (DIV) (mirar solo) (DV) PCR convencional hay diferentes metodos de ver el RNA, el (PCR ELISA) que sería como la sonda que hems visto antes o mediante un GEL de electroforesis.
(DVI) DIAPOSITIVA ASI GRIS CON LOS TUBOS-se forma una banda del DNA amontonado, porque lo has hecho correr por una banda dee electroforesis, el DNA se va aucmulando en la franja donde lo hacemos correr y entonces esto es lo que vemos . Esto sirve para no hacer amplificación. Cuando más pequeño es el fragmento que has amplificado, más lejos llega, más tiempo tarda en parar, y cuando más grande es más poco tarda . En este gel hay 6 muestras, 3 son positivas y 3 son negatias y los palos de alrededor son marcadores de peso mlecular. Fragmentos de Dna que conoces y miras el peso de cada fragemos y tienes una idea del tamaño que tiene lo que has amplificado.
(DVII) SYBR.green.
Se añade para obtener fluorescencia durante el ciclo de la PCR.
(DVIII) Aquí es posible ver el proceso de amplificación, requiere de unos termocicladors, en tiempo real quw tienen acoplado un sofware. UY estos aparatos permiten ver cómo va amplificando el material, va viendo en tiempo real si hay amplificación o si no. (ejemplo en diapositiva de *ahora dos o tres despues, gráfica) Ahora no hay manipulación, ni gel ni nada, ni sólo ver el resultado, sino tmbién todo el proceso. Cómo es que vemos esta curva? La base es DNA, polimerasa , primers,... todo eso es igual. Pero cómo se ve?Hay diferents sistemas (DIX) utilización de sondas específicas. Tienen un emisor de fluorescencia o de quimioluminiscencia y un receptor (Q y R respctivamente). Nos fijamos en las A. Esta orma es tancada y la luz que mete el emisor queda retingut por aquet receptor. No vemos fluorescencia porqu la energia que emite l coge el otro. Por lo que is no hy amplificación esto queda así. Pero si está el microorga que estmaos buscando, la sonda se une abajo por complementariedad, y con que se separan el emisor y el receptor, esta distancia es suficiente como para que la luz que emite el emisor no quede retiguda la luz en el receptor. Cada vez habrás más luz más emisión. En el portaitl vemoscomo cada vez ay más producción de luz, que quiere deicr más cantida de DNA sintetizado.
Hay otros metidos que usan sondas pero cortas, tanto que la luz del emisor qeda retinguida en el receptor (aunque estén estiradas) pero que cuando pasa la polimerasa por arriba, va degradando eso, separándool y al quedar separados y libres en el medio quedan sufciciente separads y emitiendo luz . Poor lo que esta luz la veremos cuando hay amplificación. Y esta luz lo veremos en estas gráficas Son diapositivas de tipo de microscopía para ver virus.
Si htenemos que trabajar con virus y hacer siempre electrónica, pues no vamos bien porque la electrónica está en mássitio, es un servicio técnico al que tu vas , no es algo fácil . Lo ideal sería verlos con óptico de Cam Clar, pero son demasiado pequeños (DX) VISUALITZACION DEL VIRUS Lo que podemos es no verls así super bien pero con óptico podemos ver grandes acumulaciones de material vírico intracelular . Cuando están en fase de síntesis, maduración etc nosotros esta cantidad de material vírico si que podemos verla, mediante tinciones . Podemos ver los cosus de inclusió. (contenido vírico intracelular). El virus no lo vemos pero si vemos cosus estás visualizando material vírico. Y cómo nos vemos? Lo podemos hacer mediante tinción , colorantes, o mediante anticuerpos, marcados o conjugados con una fluorescente de manera que se une al material vírico y podemos ver fluorescencia.
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