Tema 5: Enzims, cinètica enzimàtica i regulació (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 1º curso
Asignatura Bioquímica
Año del apunte 2015
Páginas 8
Fecha de subida 20/03/2015
Descargas 4
Subido por

Vista previa del texto

Tema 5: Enzims, cinètica enzimàtica i regulació Els enzims son els responsables de catalitzar les reaccions de les cèl·lules.
La producció de O2 al llarg del temps veiem que és molts lenta sense catalitzador.
Característiques generals dels enzims:     Gran especificitat de substrat. Podem discriminar entre molècules amb estructura similar.
Acceleren les reaccions químiques sense afectar l’equilibri químic de la reacció.
No pateixen canvis químic com a resultat de la seva activitat catalitzadora.
Funcionen en condicions de pH i Tº moderades.
Totes les reaccions del nostre organisme estan catalitzades per enzims:      Intervenen en tots els processos bioquímics.
Catalitzen centenar de reaccions per degradar nutrients.
Conserven i transformen energia.
Construeixen macromolècules a partir de precursors.
Coordinen vies metabòliques.
A nivell biomèdic ens podem aprofitar de les seves característiques:    Deficiències o excés d’enzims que causen malalties genètiques Marcador de malalties: mesura de l’activitat enzimàtica en plasma o teixits.
Hi ha fàrmacs que actuen contra l’activitat enzimàtica (aspirina) Catalitzadors biològics No nomes tenim enzims (proteïnes) sinó que també hi ha riboenzims (RNA).
 Enzims (proteics): poden unir cofactors. Aquests cofactors poden ser be coenzims (molècules orgàniques com el Coenzim A) o be ions inorgànics. La majoria dels coenzims orgànics provenen de proteïnes. Quan els coenzims estan units covalentment parlem de Grups prostètics. Quan el grup prostètic s’uneix a la cadena lineal de aa (apoenzim) es forma el Holoenzim.
Classificació dels enzims 1.
OXIDOREDUCTASES Les oxidoreductases catalitzen reaccions d'oxidació-reducció. Per exemple la catalasa redueix el peròxid de hidrogen a oxigen i aigua.
En aquest grup trobem deshidrogenases, reductases, oxidases, peroxidases, catalases i oxigenases.
2.
TRANSFERASES Catalitzen la transferència de grups funcionals entre diferents molècules. Dins d'aquest grup trobem: - Aminotransferasa (o transaminases; transfereixen un grup amino i participen activament en el metabolisme de aminoàcids) - Quinases (transfereixen grups fosfat; el seu contrari serien les fosfatases) - Glucosiltransferases (transfereixen un grup glicosil o carbohidrat) Per exemple la fosforilació de la glucosa per la hexoquinasa cap a glucosa-6-fosfat. El grup fosfat està contingut inicialment en un ATP, per tant es transfereix a la glucosa.
3.
HIDROLASES Catalitzen el trencament d'enllaços hidrolítics del tipus C-O, C-N, O-P, C-S Una hidrolasa molt comuna que trenca pèptids és una peptidasa.
4.
LIASES Catalitzen l'eliminació o addició d'un grup a partir d'un doble enllaç.
Per exemple, en el cicle de Krebs, la fumarasa catalitza el pas de fumarat a malat (o de malat a fumarat).
5.
ISOMERASES Catalitzen reaccions que impliquen una reorganització intramolecular. Passem a tenir un isòmer de la molècula inicial.
Per exemple, la fosfogliceromutasa catalitza el pas de 2-fosfoglicerat a 3-fosfoglicerat. O bé la epimerasa, que catalitza el pas de D-xilulosa-5-fosfat a D-ribulosa-5-fosfat. O bé la racemasa, que passa de àcid D-làctic a àcid L-làctic.
6.
LLIGASES Catalitzen reaccions on s'uneixen dues molècules. Estan acoblades a la hidròlisi d'ATP.
Per exemple la piruvat carboxilasa, amb ATP i HCO3, passa de piruvat a oxalacetat i ADP+Pi.
Com funcionen els enzims? Els enzims proporcionen al substrat l'entorn ideal per què tingui lloc una reacció ràpidament. El centre actiu és una butxaca específica on té lloc la catàlisi. El substrat s'orienta correctament al centre actiu per facilitar al màxim la reacció.
A vegades cal un aportament extra d'energia, o la formació prèvia de molècules intermediàries inestables.
El pas de substrat a producte té una constant d'equilibri (K' eq), i una energia lliure associada a la reacció (ΔGº') que depèn de la constant d'equilibri.
Les condicions estàndard bioquímiques son: - T = 298K P = 1 atm Concentració = 1M pH = 7 Les molècules que participen en una reacció química han de passar per un estat de transició per generar els productes. L'ΔG de l'estat de transició és major que el de l'estat inicial.
L'energia d'activació correspon a l'energia lliure que ha d'adquirir el sistema per arribar a l'estat de transició. La velocitat d'una reacció química pot variar en funció de si hi ha o no un catalitzador.
La velocitat dependrà de la proporció de molècules de substrat que aconsegueixin l'estat de transició.
Els enzims disminueixen l'energia d'activació, per tant, augmenten la velocitat de la reacció. Alguns enzims augmenten la velocitat de reacció fins a 1017 vegades.
El poder catalític dels enzims prové principalment de la ΔG alliberada al formar enllaços febles (interaccions no covalents) amb el substrat. Les interaccions febles són òptimes en l'estat de transició (l'estat de transició és quan el substrat adopta la orientació adequada per passar a producte). Els centres actius dels enzims són complementaris al substrat en l'estat de transició.
Característiques dels centres actius dels enzims La complementarietat enzim-substrat depèn de la forma del centre actiu. Al centre actiu hi ha els aminoàcids amb es residus que toca amb les orientacions de les càrregues elèctriques adequades de manera que nomes deixa entrar un sol substrat i amb una sola orientació. La proximitat dels substrats, junt amb la tensió a la qual estan sotmesos, facilitarà la catàlisi enzimàtica.
Hi ha dos models per explicar la interacció enzim-substrat: - Model pany i clau. El substrat té una forma especifica i el centre actiu té també la mateixa forma exacta complementària, de manera que encaixen únicament com un pany i una clau.
- Model d'acoblament induït. El substrat té una forma determinada, però el centre actiu de l'enzim no té exactament la mateixa forma. Quan es posen en contacte, es produeix un canvi conformacional a l'enzim que fa que el seu centre actiu passi a tenir la forma exacta. De fet, s'ha aconseguit per cristal·lografia determinar l'estructura de l'hexoquinasa amb i sense substrat, i s'ha vist que són lleugerament diferents.
Mecanismes catalítics Mecanisme de catàlisi àcid-base Hi ha una transferència de protons. Les cadenes laterals d'aminoàcids en el centre actiu poden cedir o captar protons, estabilitzant la formació d'intermediaris necessaris per la reacció enzimàtica. Els grups de les cadenes laterals dels aminoàcids participen molt activament en aquests mecanismes.
Per exemple la quimiotripsina (és una peptidasa). El mecanisme de la reacció és una combinació de catàlisi àcid-base i catàlisi covalent. En el centre actiu de la quimiotripsina, tenim un nucleòfil (grup químic capaç de captar un protó) i una serina (té un –OH que participa en la catàlisi àcid-base). El nucleòfil ataca el protó del –OH de la serina, i la serina ataca el carboni del electròfil (que cedirà un electró al –OH de la serina per formar un enllaç covalent transitori). El nucleòfil es queda amb el protó de la serina, i es forma un enllaç covalent transitori amb el O del –OH de la serina i una meitat del substrat (la meitat de l'enllaç peptídic que té el C). Després hi ha una hidròlisi de l'enllaç covalent aquest i s'allibera l'altra meitat de la cadena.
Un altre exemple de catàlisi és la que hi intervenen ions metàl·lics. Són importants en reaccions redox gràcies a canvis reversibles en l'estat d'oxidació del metall. Es poden unir als substrats, afavorint l'alineació correcta en el centre actiu. Estabilitzen electrostàticament o neutralitzen càrregues iòniques, facilitant el procés de catàlisi.
Per exemple la enolasa. Per donar el fosfoenolpiruvat, s'ha d'oxidar el 2-fosfoglicerat. En el centre actiu de la enolasa, hi ha dos ions Mg2+. Els Mg estabilitzen els dos oxígens del grup carboxílic de el 2fosfoglicerat. Participen també dos aminoàcids del centre actiu de la enolasa. Un és la lisina, que ataca un dels protons del 2-fosfoglicerat i fa que es formi un doble enllaç entre els seus carbonis, i es desfà el doble enllaç de el O del carboxílic. L'altre aminoàcid és el glutàmic, que ataca el –OH del 2-fosfoglicerat (s'allibera una aigua), de manera que el doble enllaç es traspassa als dos altres carbonis i al grup carboxílic es pot tornar a crear el doble enllaç amb el oxigen (fa que deixi d'haver càrrega al grup carboxílic i es desenganxa dels ions Mg).
Cinètica enzimàtica Estudia la velocitat del procés enzimàtic en determina de condicions experimentals. És important per conèixer el mecanisme d'acció i regulació dels enzims. Al principi de la reacció, la concentració de substrat és molt més elevada que la concentració de enzim; de manera que assumim que la concentració de substrat és constant. A temps inicial, la quantitat de producte que es forma és exponencial (el pendent a temps inicial és la velocitat inicial de la reacció).
La velocitat la podem representar en un gràfic velocitat-concentració de substrat (assumint que la concentració de l'enzim és constant). A baixa quantitat de substrat, tenim moltes molècules d'enzim lliures, però si augmentem la concentració de substrat, l'enzim s'anirà saturant i la velocitat s'estabilitza.
Hipòtesis de l’estat estacionari Quan s'inicia la reacció enzimàtica, la concentració del complex enzim-substrat augmenta ràpidament, però arriba de seguida a un estat estacionari que es manté pràcticament constant.
Això passa ja que la velocitat de formació del complex enzim-substrat, és la mateixa que la velocitat de desaparició d'aquest complex (suma de la velocitat de dissociació del complex i la velocitat de formació del producte. Pensem que el complex enzimsubstrat pot desaparèixer per dos motius: o bé per què es dissocia el enzim del substrat, o bé perquè ha format el producte. Per tant la velocitat de desaparició del complex enzim-substrat és la suma d'aquests dos).
Quan la concentració enzim-substrat és estacionària, una altra condició que es compleix és que el pas limitant és k2 (k2 és la constant de formació del producte). Això es diu que els enzims segueixen una cinètica hiperbòlica rectangular. L'equació de la hipèrbole rectangular és l'equació de Michaelis-Menten.
Km és la constant de Michaelis, que relaciona k1, k-1 i k2.
A més, la Km es veu representada en el gràfic dels enzims que segueixen una cinètica Michaeliana; on l Km correspon a la concentració de substrat a la qual la seva velocitat equival a la meitat de la velocitat màxima.
La Km i la Vmax son característiques intrínseques de cada enzim (sempre que segueixin una cinètica Michaeliana). Km té unitats de concentració (mM per exemple).
Com més baixa és la Km pel seu substrat, més afinitat té per ell. En el cas de reaccions de dos passos, i quan k2 és el pas limitant (k2<<<k1), menysprearem k2, de manera que Km = k-1/k1 = Kd (constant de dissociació del complex-substrat).
Un exemple d’enzim que no segueix una cinètica enzimàtica Michaeliana son els enzims reguladors.
L'equació de Michaelis-Menten es pot convertir en una altra (anomenada representació LineweaverBurk o dels dobles recíproc) si invertim els diferents factors i simplifiquem: Això és anàleg a l'equació d'una recta y = a·x + b, de manera que hem aconseguit representar l'equació de Michaelis-Menten en una recta. La gràfica talla OY en un punt que és l'invers a la Vmax. Quan talla l'eix OX, obtenim la inversa de Km. Així doncs, podem trobar molt fàcilment la Vmax i Km amb aquesta representació lineal mirant on talla els eixos. Recordem que les dades s'obtenen sempre de forma experimental.
Constant catalítica (Kcat) Recordem que k2 era la constant del pas limitant (limita la velocitat de l'enzim). Pot haver-hi reaccions que es forma un complex enzim-producte, amb una k3 (limitant en el cas, ara ja no és k2). Per això generalitzem i diem que la constant limitant de la reacció serà kcat. Kcat ens diu simplement la constant del pas limitant (velocitat límit de una reacció catalitzada per un enzim determinat). Kcat també s'anomena nombre de recanvi, que és el nombre de molècules de substrat transformades per unitat de temps i per molècula d'enzim, en condicions de saturació.
Per exemple la kcat de la catalasa és de 40.000.000 seg-1 . La eficiència catalítica és la divisió entre kcat/Km. Les unitats de l'eficiència catalítica són s-1 · M-1 . Si relacionem conceptes, obtenim aquesta nova equació: Parlem de perfecció catalítica quan tenim valors d'eficiència catalítica entre 108 i 109 .
Experimentalment, els valors de Km reflecteixen la [S] real dins l cèl·lula.
Factors que alteren l’activitat enzimàtica Altres factors que alteren l'activitat enzimàtica són la temperatura. La majoria d'enzims, el seu pic d'activitat màxima es troba a temperatura de 37ºC (temperatura de condicions fisiològiques). El pH també afecta; ja que condiciona les carregues iòniques (són molt importants) dels aminoàcids que es troben al centre actiu de l'enzim. Normalment, el pH òptim és el fisiològic.
Els inhibidors són molècules que interfereixen amb la catàlisi enzimàtica. S'utilitzen com a fàrmacs, i també per definir mecanismes enzimàtics o vies metabòliques senceres. Hi ha 2 tipus d'inhibidors segons la unió amb l'enzim:  Reversibles: s’uneixen per interacció no covalent.
- Competitius: competeixen amb el substrat. S’hi assemblen.
L’inhibidor es pot unir al enzim  formarà el complex enzim-inhibidor. Tenim que al reacció de formació del complex esta regulada per un Ki que depèn de la concentració d’enzim i de inhibidor així com també de la del complex enzim-inhibidor.
Sense inhibidor tenim una cinètica de Michaelis-Menten. Amb l’inhibidor competitiu hi haurà una competició entre el substrat i l’inhibidor per unir-se al lloc d’unió del enzim. A mida que augmenti la concentració de substrat, al final es podrà acabar unint al enzim perquè es desplaçarà l’inhibidor i es podrà arribar a la velocitat màxima. La Km però, serà diferent. Per tant, l’inhibidor no modifica la velocitat màxima però si la Km.
- No competitius: s’uneixen a un centre diferent del substrat.
Quan l’inhibidor s’uneix al lloc d’unió de l’enzim impedeix que el substrat s’uneixi. La afinitat de l’enzim pel substrat no es veu afectada per la presencia del inhibidor per tant la Km no varia.
 Irreversibles: destrueixen un grup funcional essencial per l’activitat enzimàtica Regulació enzimàtica L’activitat enzimàtica es veurà modulada en funció de les necessitats de la cèl·lula. Hi ha diferents sistemes que controlen aquesta activitat: Compartimentació subcel·lular dels enzims Dues vies metabòliques contraposades es realitzen en compartiments cel·lulars diferenciats. Per exemple, la síntesi de lípids i la seva degradació es fan en compartiments de la cèl·lula diferents.
Es pot modificar també a nivell de transcripció del DNA, traducció del mRNA i degradació del propi enzim.
Control de la concentració dels enzims Sabem que: Vmax= Kcat · [Et] Les cèl·lules del fetge tindran un metabolisme diferents que les neurones, per exemple. Tot i que totes tenen el mateix contingut de DNA, en funció de l’estat metabòlic una cèl·lula tindrà un metabolisme diferent a una altre.
A més, no nomes es pot modificar la [Et] sinó també la traducció de les proteïnes.
Modulació al·lostèrica Tot el procés de síntesis de RNA i proteïnes, es un procés lent. Però, en un moment determinat podem necessitar un enzim molts ràpidament o que un determinat enzim sigui actiu en un moment precís (enzims de la digestió). Per això, aquests enzims es poden regular de manera al·lostèrica: •  L’activitat d’alguns enzims pot ser modulada per la interacció amb lligands, efectors o moduladors al·lostèrics, en un lloc diferent del centre actiu d’aquell enzim (centre al·lostèric).
•  La unió de l’efector al·lostèric provoca un canvi conformacional de l’enzim, modificant: –  l’afinitat pel substrat o per un altre lligand –  l’eficiència catalítica (Kcat/Km) •  Els enzims al·lostèrics, principalment oligomèrics, solen presentar comportament cooperatiu: la unió d’un lligand influeix sobre la fixació d’una altra molècula del mateix lligand.
Son enzims que normalment estan inactius y en un moment determinat cal activar-los. No nomes es regularà doncs la concentració de l’enzim sinó també la seva activitat. Exemple: la hemoglobina y no la mioglobina que depenia de la [O2] y [CO2]. Seguint aquest exemple, es recolza el primer punt del quadre de dalt. La hemoglobina te la mateixa cinètica que el enzims reguladors.
*Enzims regulador: regulen una via metabòlica però al mateix temps es regulat de manera al·lostèrica.
En la imatge observem un enzim format per dos subunitats: blava (subunitat catalíticaunirà el substrat i el transformarà en producte) i part rosa (subunitat reguladoraunirà un modulador positiu i quan aquest s’uneixi causarà un canvi conformacional a ambdues subunitats i la subunitat catalítica que farà que variï l’estructura del centre actiu perquè el substrat es pugui unir a la subunitat catalítica).
Primera corba: amb modulador positiu  desplaça la recta cap a la l’esquerra. Km es mes petita ara i cal menys concentració de substrat per poder arribar a ocupa la meitat dels llocs  augmenta l’afinitat de l’enzim pel substrat i l’eficiència de la reacció.
Segona corba: enzims al·lostèrics  cinètica sigmoïdal semblant a la de la hemoglobina que permetrà una regulació mes precisa i permetrà augmentar en un moment determinat augmentar la activitat d’aquell enzim. L’enzim arribarà a la velocitat màxima però dependrà dels modeladors al·lostèrics que arribarà mes o menys ràpidament a aquesta vel màxima.
Tercera corba: quan hi ha moduladors al·lostèrics negatius dreta   desplacen la corba cap a la Retroinhibició de vies metabòliques · La velocitat de les vies metabòliques està controlada per enzims reguladors modulats al·lostèricament: · Inhibició per producte final Regulació covalent de l’activitat enzimàtica (exemple: fosforilació) •  Modificació covalent reversible: Activitat de l’enzim afectada per una modificació covalent transitòria: unió/ separació d’un grup químic unit a l’enzim per enllaç covalent (ex: fosforilació).
enzim anomenat fosforilasa b. Es poc activa quan les seves serines no estan fosforilades. Si no esta fosforilat sintetitza poc glicogen. Quan esta fosforilat (blau) la fosforilasa b es transforma en fosforilasa a i ja es activa. Un altre enzim s’encarregarà després de desfosforilar-la. L’enzim que fosforila (fosforilasa kinasa) es diferent del que desfosforila (fosforilasa fosfatasa).
•  Modificació covalent irreversible: Activació de l’enzim per escissió proteolítica. El precursor (zimogen), sol ser inactiu.
es el cas d’enzim de la digestió de proteïnes. Aquests nomes cal que siguin actius quan els necessitem (exemple: enzims del pàncreas). El zimogen (tripsinogen) quan es alliberat al intestí gracies a l’acció d’un altre enzim talla en un lloc determinat alliberant els primer aa del tripsinogen inactiu y ara si es converteix en la tripsina  per la digestió. Això evita que no es degradi el pàncreas.
Aquesst irreversibles, tenen una vida curta. Quan han acabat la seva acció es degraden.
...