tema 4 (2) (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Santiago de Compostela
Grado Biología - 4º curso
Asignatura evolución humana y diversidad molecular
Año del apunte 2017
Páginas 4
Fecha de subida 26/06/2017
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  Hot spot recombinación. Un mecanismo importante en la generación de los STR corresponde a la recombinación. Estos marcadores van a presentar una alta tasa de mutación.
Multiplex. Análisis múltiple de diferentes STR.
MULTIPLEX (estrategia analítica) El multiplex corresponde a una técnica de amplificación simultánea de STR Si yo tengo un marcador se puede hacer la amplificación mediante PCR y obtener una imagen electroforética; es un simgleplex. En un siguiente paso se puede analizar el STR1 y el STR2 y de los dos se pueden desarrollar primers específicos y amplificar ambos. A partir de aquí se efectúa una electroforesis y por lo tanto se va a tener una imagen electroforética; es un diplex.
Las diferentes bandas no se saben a que STR se corresponde. Si los tamaños de los diferentes STR son diferentes esto no lleva a confusión. Se puede incorporar un ligando fluorescente en cada STR de tal manera que los amplicones de cada STR va a venir marcado por un determinado color (imagen cromogénica) Corresponde a una técnica de amplificación simultánea de STR. Utilizamos marcadores de naturaleza fluorescente, que dan una imagen cromogénica dando lugar a diferentes colores específicos para cada STR. Utilizamos marcadores cromogénicos como TET, ROX o TAMRA.
Los productos amplificados de un STR vendrán marcados con el mismo color, y así para cada STR analizado. Estos marcadores son utilizados para la detección específica.
Tenemos que establecer una PCR-mix conjunta, en el que incorporamos los diferentes primers marcados con cada marcador cromogénico, de manera que la amplificación de cada STR vendrá marcado de una manera diferente. Los diferentes STR que tenemos co-amplificados van a venir identificados cromogénicamente. Tenemos que distinguir la variabilidad de cada STR. Lo que se desarrolla es una electroforesis capilar, que es una electroforesis en zona, que cambia el formato general. Los diferentes STRs amplificados se mueven por la acción de un campo eléctrico dependiendo del tamaño molecular. Los tamaños más pequeños migrarán más rápidamente, mientras que los más grandes migrarán más lentamente. Tenemos un recipiente aniótico y otro catiónico, en los que ambos se encuentran una solución buffer. En este caso, el gel no está repartido en una placa, sino que trabajamos con un capilar, que tiene un mm de sección y está relleno de gel, por consiguiente, la función que desarrolla es la misma que el gel en una placa normal de electroforesis. Vamos a diferenciar los fragmentos por carga y peso molecular. Esta solución se conecta a un generador de corriente. Los iones de la solución electrolítica transportan la corriente eléctrica hasta el gel, que tb tiene electrolitos y los transmiten por el gel, que llega al recipiente aniónico que la transmite por el buffer hasta el generador. Así, se establece un campo eléctrico. Cualquier molécula que presente carga puede ser desplazada por el capilar.
Se mueven en función de la magnitud de la carga eléctrica y según el tamaño de la molécula.
TEMA 4: STR (SHORT TANDEM REPEATS) MICROSATÉLITES 5 En proteómica, diferentes proteínas presentan diferente magnitud de carga, de manera que aquellas que tienen mayor carga migran más rápido, pero en el caso del DNA siempre tienen la misma carga eléctrica que le confieren los grupos COO- y los grupos OH-, lo que significa que el DNA siempre está cargado negativamente, de manera que migra hacia el polo positivo de menos a más.
Una proteína puede tener diferentes cargas proteínas en función de sus aminoácidos, de manera que puede migrar hacia ambos polos.
En el caso del ADN, la diferenciación se lleva a cabo por el tamaño molecular.
La migración se detecta mediante fluorescencia con un rayo láser. A lo largo del capilar, hay un rayo láser suave que irradia y detecta el paso de las diferentes moléculas que van pasando por el capilar y este paso va a determinar los diferentes tipos que nosotros detectamos. El láser registra la velocidad electroforética, de manera que los más pequeños pasan antes que los grandes. El láser detecta fluorescencia porque se marcan los STR con ligandos fluorescentes.
En este nivel, encontramos que los diferentes STR dan picos dependiendo del tamaño del amplicón del que hablemos en cada caso.
El análisis que da el láser puede haber solapamiento, por el solapamiento entre fragmentos, pero lo diferenciamos porque se marcan por diferentes colores, y sabemos que son STRs diferentes Electroferograma TEMA 4: STR (SHORT TANDEM REPEATS) MICROSATÉLITES 6 Tenemos que asignar tamaños para saber si son homocigotos o heterocigotos para los STRs.
Para ello incorporamos un marcador de tamaño con un fluoróforo con un color diferente a los marcadores de los STRs. Este marcador lo añadimos en la PCR-mix, pero no se amplifica.
Cuando efectuamos la carga de la PCR mix encontramos que junto a los diferentes STRs se incorpora y migran las bandas de la PCR mix. Así nos permite identificar el tamaño de los STRs.
Si podemos determinar el tamaño de los picos podemos determinar el tamaño de cada variante alélica. Para asignar el tamaño, aquí lo que se incorpora es un marcador de peso molecular de un fluoróforo diferente a los otros que correspondan a los STR. Este marcafor se va a incorporar en la PCR mix pero no se va a amplificar. Cuando se efectúa la carga de la PCR mix lo que nos vamos a encontrar es que junto a los diferentes STR migran también la banda de peso molecular. Si se puede asignar el tamaño de cada tipo se puede saber que variante alélica se tiene en cada uno de los casos.
El MULTIPLEX permite usar análisis masivo, porque interesa analizar varios STRs en la misma PCR-mix y en la misma electroforesis. Esto permite adecuación a estudios masivos (screening), identificación de grupos de riesgo.
El diseño del multiplex es más difícil o no dependiendo del STR que estemos analizando. La cuestión clave está en la PCR mix. No siempre es posible incorporan 8 o 10 STR en la misma PCR. El problema está en lo que se llama condiciones consenso. Los loci tienen que amplificar en condiciones semejantes (anneling, elongación y desnaturalización). Si yo analizo dos loci, los dos STR tienen que tener condiciones semejantes, el intervalo en los cuales los primers hibridan debe de hacer solapamiento, porque si no hay solapamiento no puede haber una amplificación conjunta. La temperatura de anneling va a depender a su vez de la composición C+G, los primers tienen que tener un contenido C+G mayor del 50%. Tengo que valorar la Tm (factor clave en lo que corresponde a la hibridación de los primers), por lo tanto es otro factor clave (tres condiciones: temperatura anneling, C+G y Tm, otra sería, pero en menor importancia, el cloruro de magnesio) La cuestión clave está en el diseño de los primers y en las condiciones consenso A mayores regiones de DNA que quiera amplificar más restrictivas son las condiciones consenso Se pueden diseñar primers con un amplio margen de diseño. Existen programas de diseño de primers Esas condiciones consenso van genial para un marcador pero para otro la eficacia de la PCR no es tan buena. Aunque se tiene una amplificación más baja aún se pueden ver las diferentes bandas En un tiempo de elongación tiene que ver el tamaño del STR, porque si tiene un tamaño muy grande puede ser que no se amplifique mientras que un pequeño si En una simple electroforesis se pueden analizar múltiples regiones TEMA 4: STR (SHORT TANDEM REPEATS) MICROSATÉLITES 7 MECANISMOS DE VARIABILIDAD ENTRECRUZAMIENTO MELÓTICO Los STRs se originan por dos mecanismos fundamentales: entrecruzamiento meiótico desigual y por el slipage de la polimerasa. Cuando hablamos de la meiosis, las cromátidas hermanas están perfectamente emparejadas, de manera que cuando se producen los fenómenos aleatorios de entrecruzamiento hay un apareamiento total y la longitud de ambas cromátidas se mantiene. Se pueden producir mutaciones, que dan lugar a procesos evolutivos, cuando entre ambas cromátidas hay un apareamiento meiótico desigual, porque ambas no están estrechamente emparentadas y en entrecruzamietno puede dar lugar a una cromátida con una longitud más larga y otra más corta. Es un mecanismo clave para entender la aparición de los STRs.
Si en una cromátida tenemos ATCG y en la otra, por apareamiento desigual encontramos un desalineamiento, origina que tengamos una secuencia que corresponde a una cromátida que lleva las dos secuencias ATCG, mientras que la otra cromátida no lleva esta secuencia. Esto puede originar una duplicación en tándem, que da lugar a un STR. Si hablamos de una secuencia más larga, el desapareamiento meiótico desigual origina una secuencia más larga que da lugar a un VNTR. La aparición de STR o VNTR se debe a la diferencia de longitud de la secuencia que se entrecruza.
Sean STR o VNTR son repeticiones en tándem y ambos pertenecen a la misma categoría de los Copy Number Repeticions, la esencia del mecanismo corresponde a la misma filosofía, que es un desapareamiento meiótico desigual y entrecruzamiento desigual.
En el caso de los STRs, si el desapareamiento es corto se puede desaparear un direpeat. Si aumenta la magnitud del desapareamiento, evolutivamente, son desajustes que pueden ocurrir en la meiosis y se convierten en eventos casuales. En una población donde tenemos el alelo ATCG en una única copia, cuando se produce el enfrentamiento de dos individuos con esta secuencia, se puede originar un segundo alelo que lleva dos repeticiones de la secuencia.
No ocurre para todos los individuos de la población, pero algún individuo por mutación puede producir esta mutación que transmite a la siguiente generación el alelo 2 de este STR. La población derivada de la población ancestral tendrán mayoritariamente el alelo 1, pero tendrán en un % pequeño el alelo 2, que identifica este camino evolutivo. Este STR se convierte en un alelo traza para identificar poblaciones derivadas de poblaciones ancestrales.
TEMA 4: STR (SHORT TANDEM REPEATS) MICROSATÉLITES 8 ...

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