Tema 3 - Cultius Cel·lulars (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2016
Páginas 32
Fecha de subida 19/03/2016
Descargas 2
Subido por

Vista previa del texto

Tema 3. Bioseguretat (CLASSE) És o no és necessari aplicar o posar-nos d’acord en un conjunt de normes per poder manipular els productes biològics? Bioseguretat en la manipulació de agents biològics (de risc) Perquè mesures de seguretat? Per protegir: - Ens hem de protegir a nosaltres mateixos, Protegir el que estem fabricant.
- Als col·laboradors Al personal de manteniment i neteja, que no saben el que s’està fent allà, doncs s’ha d’impedir que puguin tenir contacte amb material de risc.
Al medi ambient.
Farem doncs estratègies que s’anomenen barreres: - - Barrera primària: entre l’agent biològic i l’usuari, com cabines, guants...
Estratègies de neteja i desinfecció: evitar que l’agent es propagui. Utilitzant la làmpada germicida, l’autoclau...
Barreres secundaries, terciàries i quaternàries: com aïllem l’agent biològic del medi ambient. Dependran doncs del les instal·lacions (com és el laboratori), terciàries on trobem el laboratori en l’edifici i quaternàries és on posem l’edifici dins d’una ciutat, no s’hauria de posar un laboratori de molta seguretat al mig de la ciutat.
Evaluació dels problemes de Bioseguretat en la manipulació dels agents biològics (de risc) Identificació del Risc: - Per poder abordar això hem de tractar amb el problema real, és a dir, el risc real que podem adquirir en el laboratori: IAL (Infecció adquirida al laboratori).
Epidemiologia Mecanismes de transmissió Avaluació del Risc: - Factors humans Factors microbians Grups de risc de microorganismes Control del Risc: - Barreres primàries: entre AB i persones i ambient del laboratori Barreres secundàries(3º i 4º): entre AB i l’ambient extern Normativa i llibres de referencia en Bioseguretat en EEUU i Europa Dos llibres: - Exposición agentes biológicos.
Biosafety in Mi Infecció adquirida en el laboratori: IAL Malaltia produïda com a conseqüència del treball directe en el laboratori: per exemple una infermera que es contamina pel pacient. És fàcil de reconèixer si l’agent és molt estrany, però si és comú és difícil. Per exemple si treballem amb malalties tropicals, i tenim febre groga, fàcilment podem demostrar que s’ha produït en el laboratori. Però si és alguna malaltia més comú, com la pneumònia, doncs difícilment es pot demostrar.
Quan s’aconsegueix identificar la causa de la infecció, la major part de les infeccions que es provoquen en el laboratori, degut a accidents que la gent no comunica (al supervisor), ja que no volem explicar que hem fet alguna cosa malament. És important saber perquè s’està produint, doncs es demana que si es produeix cap tipus de contaminació es registri.
El 82% d’aquestes infeccions no se sap la causa, ja que no s’ha declarat. El 18% si que se sap la causa, produït en centrifugues o pipetes, pinxazos amb agulles, mossegades...
Es poden prevenir si controlem les vies de transmissió. 4 vies de transmissió: - Via parental: per la sang, per agulles, talls, mossegades... s’evita no acostant-nos a agents contaminants amb les mans, tot i tenir molts guants. No acostar-nos a res contaminant que pugui tallar, i es tira qualsevol cosa que talli a una caixa especial.
- Via digestiva: utilitzen habitualment els enteropatògens, normalment oportunistes, que entren al sistema digestiu per la boca, doncs si en el laboratori hi ha, normalment les infeccions degut a que ens posem les mans a la boca, o bolígrafs a la boca. Com evitar aquest tipus d’infeccions? Seguint les normes bàsiques de comportament del laboratori.
- La via respiratòria: és la més perillosa, ja que els agents que es transmeten per via aerosol o aèria són les més difícils de contenir. Per evitar que això tingui lloc s’ha d’evitar la formació de aerosols com a conseqüència de vertidos, centrifugació, vortex i sonicadors, salpicadures, obertura de tubs, incineració de ases de sembra...
- Via dèrmica: és una via que solament la utilitzen fongs i algun tipus de bacteris que destrueixen la barrera o patògens oportunistes, el problema és quan tenim la pell agrietada, doncs hem de cobrir les lesions. Hem de protegir-nos i col·locar alguna barrera.
Avaluació del Risc Classificades les vies, parlem dels grups de risc.
Risc: probabilitat de que es produeixi un dany, lesió o malaltia Abans de iniciar qualsevol projecte o activitat el Director de laboratori o del projecte ha de: EVALUAR EL RISC. Finalitat: Reduir al mínim el risc derivat de la exposició a agents biològics.
Factors a tenir en compte en la evaluació: - - Factors humans: nivell de salut.
o Coneixements del investigador.
o Tipus de treball a realitzar (tipus d’exposició) Factors microbians: característiques dels agents biològics.
Tipus d’exposició - Treball directe amb l’agent biològic: o Laboratori Microbiologia o Laboratori Investigació o Laboratori Farmacèutic (producció d’antibiòtics, enzims) o Indústria alimentària (cervesa, formatges, iogurts...) - - Sense manipulació directe de l’agent biològic o Treball amb animals o productes d’origen animal o Treball en laboratoris d’anàlisi, veterinaris, investigació o Eliminació de residus o Depuració d’aigües No derivada de l’activitat laboral o Malaltia infecciosa contagiada per un altre treballador Característiques dels agents biològics Les característiques que es tenen en compte per agrupar als agents biològics en els grups de risc són: - Capacitat de provocar malalties Perillositat per els treballadors Capacitat de contagi Existència de profilaxis o tractament eficaç CDC: forma de transmissió El treball amb aquests agents estan regulats per lleis, taula on es parla dels quatre grups d’agents biològics, tenim pàgines amb llistes d’espècies on al costat hi ha la classificació amb la qual s’ha de treballar (els nivells). Per tant, tenim un bolletí oficial de l’estat on podem consultar el nivell de risc de l’espècie que treballem.
Hem de tenir en compte que s’ha fet pels següents paràmetres: - - - És una classificació feta per individus sans, si hi ha una caiguda del sistema immunitari, persona embarassada... doncs aquesta agents són molt més perillosos, doncs hem d’evitar acostar-nos.
De alguns agents es disposa de informació addicional (pot existir vacunes V, toxina T).
La no inclusió d’un agent el tractem amb el màxim de precaucions, no el classifiquem com a GR-1, sinó que: o S’ha d’identificar i classificar d’acord als grups de risc.
o Davant el dubte, tractar-lo com del màxim grup de risc possible.
Es virus són com a mínim del grup 2.
Les soques atenuades ben caracteritzades no han de ser manipulades amb el mateix nivell de contenció que la soca mare.
- Si es realitza una modificació genètica amb inserció automàticament aquest agent puja un nivell fins que es demostri que no és més tòxic del que ja ho era, ja que la inserció aleatòria pot activar patògens latents.
Normes i nivells de Bioseguretat Això porta a 3 principis bàsics de bioseguretat: 1. Si es fa un experiment amb dos agents diferents, utilitzem aquell que suposi menor risc. Sustitución de Agentes Biológicos de Riesgo por los de un Riesgo Inferior 2. Revisar els processos en el laboratori avaluant els riscos. Tenir present fer un procés “com sempre” no és necessàriament segur. Doncs podem fer sugerències, hem d’avaluar els processos.
3. Davant qualsevol dubte aplicar sempre les màximes precaucions.
Criteris de Nivell de Bioseguretat dels laboratoris Conjunt de normes que han de complir els laboratoris en els que es manipulen microorganismes infecciosos, mostres de teixit humans o animals de laboratori. Defineixen les combinacions de: equips de protecció (barreres primàries), instal·lacions del laboratori (barreres secundàries) i de contenció de l’edifici (barreres terciàries), més adequades per la manipulació dels agents biològics de risc.
Definirem els quatre tipus de laboratori, del nivell 1 al 4, LSB (labosafty...). En cadascun trobarem una fixa, amb el tipus d’agents que podem trobar, els procediments de treball que s’apliquen i les barreres. Doncs el color indica el nivell que trobem. La normativa diu que hi ha 4 nivells: - Nivell 1: manipulació d’agents que no produeixen malaltia en adults sans.
Nivell 2: agents patògens en l’home (risc: dany percutàni, ingestió, mucoses).
Nivell 3: agents patogènics amb potencial de transmissió per aerosol.
Nivell 4: agents perillosos o patogènics amb un alt risc de malaltia, amb transmissió per aerosol o per medis desconeguts.
Nivell 1 Laboratori aquell en el qual els estudiants de pràctiques acostumem a treballar, laboratori en que els agents que treballem no suposa risc per individus sans, si tenim per exemple tractament quimioteràpic no es pot utiltizar.
Procediment de treball: - Responsable.
Investigadors.
Accés limitat durant les hores de treballar.
Procediments No existeix cap tipus de equip de protecció personal obligatori, es recomana utiltizar bata (per la brutícia...) I els riscos associats al laboratori estan restringits als bunsens, el problema de les agulles, el problema de les pipetes, ja que formen aerosols, i perquè són agents punxants. I les centrífugues, que han de tenir certes característiques.
Instal·lació de nivell 1, instal·lació on fem les pràctiques, equipaments, instal·lacions i procediments.
Nivell 2 És un nivell en el qual es poden manipular agents biològics els quals poden causar malalties, doncs necessitem algun tipus de protecció, per exemple cabines que protegeixen el laboratori, no es poden manipular en cabines sense seguretat biològica, només per preparar medis, però no per l’agent biològic. A nivell 2 correspon qualsevol agent per punció, oral i dèrmica.
Procediment de treball: 1.
2.
3.
4.
Responsable Investigadors Accés Procediments: sempre són els del nivell anterior més uns quants més, treballa en cabina en seguretat biològica... POWER..
Barreres primàries: en aquest cas ja són obligatòries.
Barreres secundaries. Important una mirilla, per veure què és el que passa en aquell laboratori, si no està passant res perillós podem entrar.
Es poden manipular agents que tenen risc, però existeix tractament i és poc probable que es transmeti a la comunitat.
Equips de protecció individual, es comencen a aplicar perquè pot haver-hi risc. El primer sistema de protecció que hem de tenir en compte són les mascares (cirúrgiques), que no serveixen per res, només pensat perquè no passi del metge al pacient. La mascara que necessitem és una que s’ajusti bé a la cara, i que l’aire passi pel filtre, no per dalt i baix.
Respecte els guanys, normalment utilitzem guants de làtex que quan ens netegem les mans, doncs ens mullem les mans, doncs tenen forats, ens posem més guants, diferents capes, o bé utilitzant els guants adequats, són més gruixuts de lo habitual.
Per treballar en la instal·lació de cultius nivell dos solament utilitzem cabines biològiques (taronja), les altres no ens serveixen.
Exemple 3: es troba en el parc científic, dissenyat al 2001, col·locat en un soterrani profund, per la part de dalt arriben els camions per descarregar. Cada caixa de color és una sala diferent, cada caixa verda és una casella de flux laminar. La idea bàsica és que tota la zona està formada per caixes de plàstic segellades, de manera que el manteniment es fa des de l’exterior, els endolls i tot és a l’exterior. La sala de baix és una sala amb molta maquinaria per preparar medis... el usuari ha d’entrar a treballar, passa per l’habitació que té menys pressió, de manera que quan entrem l’aire surt, solament podem tenir una de les portes obertes, l’aire de l’interior pot sortir. Res de les sales pot sortir al passadís tampoc, degut a un petit canvi de pressió. De manera que es poden aïllar. Al mig es poden activar dutxes de manera que poden entrar i sortir, ja que la part del final estava pensada ser de instal·lació 3.
Fotografies, en el interior de l’exclusa, on tenim un rellotge i posem les hores d’entrada i sortida. Mascara i protecció que protegeix la mostra de l’usuari. En la part interior de la sala de cultius, no hi ha aigua, per descontaminar posem la mà dins d’un lloc que vaporitza. Com traiem el material contaminat? A través d’un autoclau que té dos punts, un on posem el material contaminat, i es recull per l’altre costat net.
Nivell 3 Els agents poden provocar danys greus, ja que poden expandir-se a la població tot i que existeixen tractament. Els procediments de treball: 1. Responsable.
2. Investigadors: se’ls sotmet a simulacions, abans de treballar amb agents biològics, l’operari que els està supervisant els provocarà accidents, per demostrar que poden corregir errors: MANUAL DE SEGURETAT i tot operari s’ha de mantenir a SEGUIMENT DE L’ESTAT DE SALUT (cada 6 mesos o cada any).
Barreres!! Es poden treballar agents biològics cada vegada més perillosos.
Exemple 4: laboratori 2001, les sales de cultiu que eren caixes de plàstic dins de caixes de plàstic, que tenia exclusses de pressió, solament es podia obrir una de les 3 portes sempre a pressió positiva. Tenim un indicar de la diferencia de pressió, de manera que l’operari abans de començar a manipular comprovava que es trobava a pressió negativa, doncs aleshores era segur el treball en aquella instal·lació, s’havia d’apuntar en el check list.
Procediments implementats, són també importants, com la gent els segueix és molt més important que les instal·lacions. Si la gent no segueix estrictament els procediments i no comunica els problemes, doncs no serveix de res.
S’han de comunicar els problemes per poden fer les mesures adequades.
D’instal·lacions de nivell tres hi ha poques, una per exemple a Girona. Una instal·lació que si que es pot visitar, que és el CReSA a la UAB, tenim una cabina de classe 3, tenim guants inflats on a l’interior tenim pollets, ja que estudien sanitat animal, els tenien infectats, i els tenen en una zona que els poden manipular.
Nivell 4 Els agents que hi ha dins són molt perillosos, i per treballar dins has de tenir un entrenament especial.
Procediment de treball: POWER Barreres: s’apliquen totes les imaginables. Terciàries: solen estar molt aïllades i les quaternàries, estan en llocs del país molt separat.
Instal·lacions molt sofisticades.
Els agents biològics són del grup 4 per exemple Bacillus anthracis i productes amb agents perillosos però desconeguts. Èbola és nivell 4, però va ser tractat com van poder.
CSIRO: un dels edificis mes sofisticats (sanitat animal i impacte en humans), en Australia.
Instal·lació molt gran amb animals dins.
Tenim un resum dels diferents nivells. En tot això, en ningun moment surten fibroblasts, osteoblasts, on està el perill de les cèl·lules en tot això? En la càrrega patogènica, en la pròpia cèl·lula, conjunt d’organismes que poden contaminar el cultiu cel·lular. En qualsevol laboratori, tenim una fulla tècnica de seguretat, és electrònica de manera que qualsevol treballador pot consultar-la.
Riscs en l’ús de cèl·lules eucariotes (en cultiu) - “Reinheinsgebot” (Ley de pureza, S. XVI): manteniment de poblacions mixtes de llevats que garanteixen la qualitat de la cervesa produïda.
Microscopi (S. XVII)  cèl·lules Microorganismes com patògens  Koch (tuberculosis) / Pasteur (antrax).
Vacunació (Jenser)  virola Progrés civilització: avanços  nous riscs Mirant les fulles tècniques del seu equip de l’últim any, mirava productes i el lloc on parlava de seguretat: - - MatTEK: cèl·lules d’epiteli, hi ha empreses que fabriquen teixits humans. Aquest producte està creixen sobre un plàstic, formen un epiteli pseudostratificat. Hi ha una part que posava Screening for pathogens, les cèl·lules han estat analitzades per HIV, hepatitis B/C. Però no sabem si tenen herpes o sarcoma... Hem mirat una cosa, però de totes les altres coses no en tenim ni idea.
ATCC: banc de cèl·lules que subministra cèl·lules quan les necessitem. Diu que quan la línia és de nivell 1 no mirem ni si està contaminada. Si la línia és de nivell 2, diu que no ha estat analitzada de hepatitis B ni HIV, doncs el perill està en la carrega patogènica (microorganismes que poden acompanyar al cultiu cel·lular i que donen perill).
Hi ha situacions en que el risc no es troba a la càrrega patogènica, però és una línia que forma un producte que forma al·lèrgia a una persona en concret. Una altre possibilitat és que la línia cel·lular faci un producte tòxic, doncs és més general. Perill de capacitat oncogènica, és difícil, però si arriba a la sang és perilloses. Hi ha una última possibilitat que és la capacitat tòxica intrínseca, molt estrany.
Càrrega patogènica - Bacteris i fongs - Microplasmes - Virus Capacitat alergènica  alèrgens Capacitat tòxica  toxines Capacitat oncogènica (GMO’s) i capacitat tòxica intrínseca Exemple personal de la capacitat tòxica intrínseca: mirava certes proteïnes, i quan les trobava en una persona, pinxava a tota la família. Feia aleshores tècniques de seqüenciació, per aquesta raó necessita un DNA control perfecte. Doncs el DNA del mateix professor era el control que ha utilitzat sempre. Quan en un moment determinat li interessava fer cultius de macròfags, doncs també utilitzava les seves pròpies cèl·lules. Això de cultivar les nostres pròpies cèl·lules no s’ha de fer mai, ja que posem en cultiu les nostres pròpies cèl·lules i estem seleccionant aquelles que són les més oncogèniques, ja que seleccionem les més proliferants, doncs si aconsegueixen tornar a la sang, formarà un tumor. Doncs la capacitat tòxica intrínseca és el risc associat a que cèl·lules oncogèniques tornin al seu sistema i puguin generar un tumor.
Com es pot controlar? - Càrrega patogènica de bacteris i fongs: quan volem controlar si en un medi de cultiu hi ha bacteris o fongs, es posa una mica de cultiu en el medi, si després d’uns dies hi ha turbidesa es perquè hi havia bacteris o fongs. Es compara amb el medi LB normal. Hem de triar el cultiu i descontaminar, caldrà afegir nous antibiòtics. Hi ha un tipus de bacteris que són bastant punyeteres, són bacteris sense paret, paràsits estrictes, corresponen al grup dels microplasmes. Aquests contaminen una enorme quantitat de línies cel·lulars 60%. Aquests són una font de problemes. Poden determinar la presència d’aquests utilitzant PCR. Hi ha una altre estratègia que és tenyir els cultius. Si no està contaminat veiem el nucli, si ho està veiem un punt que significa que hi ha microplasmes. No és una tècnica fàcil per una persona no entrenada. Ha de viure sobre una cèl·lula eucariota, un microplasma és com una escama de peix sobre la cèl·lula. Si nosaltres estem estudiant el comportament d’una cèl·lula, els receptors, i tenim microplamsa sobre, doncs difícilment podrem investigar-ho. El que hem de fer és tirar el cultiu i descontaminar la sala.
- Si el cultiu és molt important, existeixen alguns productes que les cases comercials diuen que eliminen els microplasmes, però ell els que ha provat no funcionen. L’única manera de treure un microplasma d’un cultiu és passar-lo per un animal, si li pinxem a un ratolí a l’abdomen i després recuperem líquid d’aquest al cap d’unes setmanes, i aïllem les cèl·lules, doncs les cèl·lules quedaran lliures de microplasmes (difícil). Si hi ha aquest problema millor tirar el cultiu.
Càrrega patogènica amb virus.
En la pràctica com determinem el risc que té un cultiu, hem de tenir en compte: A la pràctica farem servir l’arbre de decisió, un sistema que el primer que ens fa preguntar-nos és si les cèl·lules són humanes o de primats, ja que hi ha més perillós com més pròxim filogenèticament, ja que pot ser que si està contaminat per un patogen es contamini a tu també: virus de peix difícilment es pot atacar a tu també.
Les línies estan mal identificades, tenim una taula que es va publicar en un llibre clàssic, en la taula, recull 3 estudis per 3 equips diferents, analitzava bancs de cèl·lules (emmagatzemem cèl·lules per tal de després facilitar l’excés de la línia), realitzats sobre les línies rebudes en diferents bancs.
Contaminació creuada: De 446 línies rebudes (que els científics consideraven que estaven bé), 75 estaven mal identificades  s’han equivocat al enviar la fixa, on hem de posar l’espècie i el teixit. Hem dit per exemple que és de humà i realment és de gos. Això és molt important, ja que després quan les volem utilitzar i volem estudiar per exemple el comportament hepàtic i resulta que no treballem amb les cèl·lules que necessitem, doncs és un gran problema perquè investiguem amb cèl·lules que no toquen. Doncs hem acceptat el problema, hem de trobar solució, perquè s’ha produït el problema? Degut a la contaminació creuada.
La contaminació creuada és un fenomen de contaminació que es produeix entre cultius cel·lulars, degut a una mala etiquetació o una mala manipulació. Una de les raons més comuns és què hem contaminat un cultiu que creix lentament, i per un problema de manipulació ho hem contaminat per una línia que creix més ràpidament.
Com evitar la contaminació creuada o els errors de identificació?  No acceptar cultius no-segurs, poc caracteritzats o sense referència o tractar-los en consonància. Si acceptem paquets o línies cel·lulars de persones que no identifiquen, doncs s’ha de notificar.
 Obtenir sempre els stocks semilla dels cultius de fons reconeguts que certifiquen l’origen.
o Col·leccions internacionals de línies cel·lulars (ATCC, ECACC, NIH...) o Bancs locals o regionals.
 Cultivar les cèl·lules correctament: o Manipular solament una línia cel·lular cada vegada.
o No compartir medis de cultius entre diferents línies cel·lulars.
o Manipular les línies cel·lulars amb major capacitat de proliferació les últimes.
o En el cas de cultius de llarga duració: verificar periòdicament les propietats del cultiu.
o Establir un programa adequat d’emmagatzemament de la línia: molt important sobretot en laboratoris amb molt de moviment de línies.
En el seu equip, com ho solucionen? Quan es rep una línia cel·lular nova, els envien congelada en forma d’un tub, solament té autorització d’obrir aquella línia la persona que sap més de cultiu, aleshores replica aquella línia fent moltísimes alíquotes, aquests tubs s’anomenen llavor stock. Quan li donen a un doctorant el primer que ha de fer quan li donen la llavor stock, ha de fer moltes alíquotes que s’anomenen stock utilitzant. Qualsevol usuari que necessita una línia no se la pot demanar, sinó que ha d’estar al la llavor stock, quan el doctorant acaba, ha de destruir la seva línia utilitzant.
D’aquesta manera s’assegura la traçabilitat.
Això resol amb sistemes de bases de dades, perquè hi ha moltíssims tubs.
S’emmagatzemen totes les alíquotes, quan s’ha congelat, si es tira o no... això permet traçabilitat.
Resum: 1. El registre de cultius cel·lulars és degut essencialment en la seva càrrega patogènica, que poden determinar-se en la major part dels casos.
2. El nivell de contenció i de manipulació dependrà del risc del cultiu i per tant, per la seva carrega patogènica. Com a mínim serà del tipus 2, excepte cultius molt ben caracteritzats i de curta duració.
3. El risc es minimitza seguint estrictament els procediments establerts en la instal·lació de seguretat biològica, des de la manipulació, la neteja, el manteniment i la descontaminació.
4. És de enorme transcendència la correcte traçabilitat dels cultius, el registre dels processos i dels incidents.
5. Tot el personal que utilitza cultius cel·lulars ha de conèixer en detall, acceptar i aplicar els procediments establerts que garanteixen la seva seguretat i la de l’entorn.
6. La determinació del nivell de seguretat i contenció d’un cultiu és en últim extrem responsabilitat de l’investigador responsable del projecte que és qui millor ha de conèixer la naturalesa del cultiu utilitzat i els riscs associats.
...