TEMA 2 BIOLOGIA MOLECULAR (BIOMOL) (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 28
Fecha de subida 01/07/2017
Descargas 1
Subido por

Descripción

Inclou els apunts corresponents al tema 2 de l'assignatura Biologia Molecular: Organització interna d’un genoma.

Vista previa del texto

Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) TEMA 2: Organització interna d’un genoma Com estan organitzats els genomes? Contingut de cromosomes de diferents espècies.
Normalment, la major part de procariotes hi ha un sol cromosoma i és circular. DNA genòmic. Però pot haver altres molècules de DNA circular que sigui extracromosomal, les quals reben el nom de plasmidis. Repliquen de forma autònoma respecte el cromosoma bacterià. Aquests plasmidis seran molt importants en processos de clonatge.
La major part o una part important de procariotes tenen una part important de cromosomes. Agrobacterium té 3 cromosomes circulars i 1 lineal. EXCEPCIÓ.
Els cromosomes eucariotes tots són lineals. L’únic DNA circular en eucariotes és el present en mitocondris i cloroplasts. Informació genètica no mitocondrial ni cloroplast és lineal. Hi ha casos com els llevats que poden tenir una o dos còpies del cromosoma. Protozou als macronuclis poden tenir entre 10 i 10.000 còpies de cada un dels cromosomes. Depenent de l’espècie el número varia.
Aquest 2 màgic que sempre hem assignat a les cèl·lules eucariotes no sempre es així (23 cromosomes, sempre emparellats).
Una altre cosa que va sorprendre i als anys 70 no s’entenia perquè és el contingut de DNA que hi havia en les diferents espècies. Eucariotes i procariotes, cada cop anava pujant més en l’escala evolutiva. Un picogram equival aproximadament a 1000 mega bases. El valor C és el contingut de DNA d’aquests organismes.
Un procariota està menys evolucionat que els eucariotes i s’esperaria que el contingut en DNA fos inferior. Dos organismes diferents que estan més o menys en la mateixa escala evolutiva al mateix lloc s’esperaria que tinguessin el mateix contingut.
Sorpreses: ocells, mamífers i rèptils tenen un contingut de DNA inferior que en algunes plantes, protozous i algues i això no s’entenia. Com un organisme que podia fer funcions superiors podia tenir menys contingut de DNA. D’altre banda, quan es van comparar dos organismes com la mosca (5000 Mb) i el saltamartí (180 Mb) i era 25 cops més gran i tots dos es troben al mateix lloc de la escala evolutiva. Nosaltres tenim un contingut inferior que altres animals. C-value paradox  paradoxa del valor C. Això porta molts mals de cap a la gent que estudiava el genoma.
1 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Contingut de gens de diferents espècies: Es va entendre què va passar. Tenim una comparativa del nombre de gens diferents.
El nombre de gens és similar a procariotes, no tenia gaire sentit. Pujant a l’escala evolutiva veiem com els homes tenien els mateixos gens que un cuc o una mosca del vinagre. Hi ha plantes que tenen més gens que els humans. Això ens permetia calcular un altre paràmetre que és la densitat gènica.
Densitat gènica: valor del quocient entre la part del genoma que conté els gens respecte la mida total del genoma. Aquesta densitat gènica és relativament elevada en els procariotes i propera al nombre de gens. En organismes procariotes la major part del genoma està dedicada a gens que codifiquen per proteïnes i seqüències que regulen per aquestes proteïnes. Procariotes: Expressió dels mateixos elements reguladors (operons). Als procariotes el que es transcriu és policistrònic (operons) i en eucariotes no hi ha ni un que sigui policistrònic.
Si passem de procariotes (part majoritària de material genètic codificant i seqüències reguladores) a eucariotes, cada cop hi ha menys part codificant del genoma. Genomes molt grans però una part molt petita correspon pròpiament a regions que codifiquen per proteïnes. Tenim una manera d’explicar aquesta paradoxa del valor C.
Perquè realment hi ha una disminució de la densitat gènica comparant els genomes.
La disminució d’aquesta densitat gènica (poca part del genoma que codifica respecte tot el genoma) té dos causes: 1. Genoma fragmentat. Regions codificants (exons) i regions no codificants (introns). Això va començar a permetre entendre perquè els genomes són més grans. A procariotes no hi ha introns. Als humans hi ha alguns gens que un 95% del gen correspon a l’intró.  els introns són cada cop més llargs (95% en humans) 2. Cada vegada, a mesura que pugem per l’escala evolutiva, hi ha seqüències intergèniques que cada cop són més llargues.
A la imatge comparem parts del genoma d’un procariota i d’una eucariota inferior, Drosophila i humans. La part del genoma que codifica o conté el gen que codifica per la polimerasa (taronja). En el cas d’E. coli el genoma tot és codificant, RNA polimerasa 2 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) no té introns. Poques seqüències intergèniques i tota la resta ón gens. Pràcticament tot el genoma procariota és codificant.
Eucariotes inferiors  RNA polimerasa no té introns però les seqüències intergèniques comencen a ser més amples. Gens. Algun intró. Seqüències intergèniques més grans.
Drosophila  RNA polimerasa o gen que codifica per ella té tres regions intròniques.
Seqüències intergèniques més llargues. Seqüències repetides que poden estar a introns o seqüències intergèniques.
Humans  més llargs els introns que no pas la part codificant. Seqüències repetides.
Seqüències intergèniques cada cop més grans.
Organització i contingut del genoma humà: Tot aquest DNA que no codifica per proteïnes al genoma humà?  La part codificant és un 1.5% del total del genoma, quin sentit té que la cèl·lula per dividir-se gasti tanta energia per poder replicar tot aquest material genètic. A la cèl·lula li es menys costós anar replicant el genoma que no establir mecanismes per eliminar aquest “DNA brossa”. Avui dia sabem que aquest “DNA brossa” no és brossa.
Genoma humà conté aproximadament 320.000 megabases que es separen en seqüències que codifiquen per gens i seqüències que estan relacionades amb els gens i seqüències intergèniques. Aquestes últimes representen un 60% aproximadament. Gens en sí  transcrit i traduït en proteïna i correspon com a molt a 1.5% del total del genoma humà.
A banda del pròpiament codificant, les seqüències relacionades amb la part codificant es separa en introns i després tot el conjunt de regions no traduïdes (UTR).
3 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Si jo tinc un determinat gen, si tinc un procés de transcripció i el passem a mRNA, en 5’ no començo mai la traducció per l’extrem 5’ ni acabo exactament a la regió 3’ sinó que hi ha regions que no es transcriuen anomenades regions UTR.
Dins de les seqüències relacionades amb els gens, a banda de introns i UTR trobem els fragments gènics, els quals surten del que algun dia van ser gens codificants.
Poden ser gens que s’han inactivat per una mutació o que han quedat truncats per un procés de replicació que no ha funcionat correctament...
Per últim, dins d’aquesta part de seqüències relacionades amb gens tenim els pseudogens. Fragments de DNA que provenen de còpies de RNA o pas de RNA a DNA (transcriptasa inversa). Tot un seguit de parts d’aquest genoma que provenen de copies de RNA que tenen la cèl·lula i s’han integrat al genoma (transcriptasa inversa).
El DNA que codifica pròpiament pels gens s’anomena DNA de còpia única. Aquest ens està dient que de cada un dels gens normalment tenim una sola còpia al genoma (genoma haploide). Sempre hi ha excepcions i hi ha gens que no són de còpia única, sinó que presenten còpies múltiples (gens de proteïnes ribosomals, perquè a la divisió cel·lular necessitem molts ribosomes i molta producció de proteïnes ribosomals).
De DNA de còpia única no en tenim només l’exclusivament la part que correspon als gens traduïts a proteïna. En trobem seqüències intergèniques. Aquestes es poden dividir en el que són o s’anomenen DNA repetitiu i altres regions intergèniques. En aquestes últimes trobem DNA de còpia única i codifica per 1 sola còpia, normalment per RNA que regula l’expressió dels gens que tenim en aquesta part del genoma. Tot allò que es coneixia i era batejat com “DNA brossa” moltes parts d’aquestes no codifiquen per proteïnes sinó per diferents RNA que tenen funció reguladora en la expressió gènica.
No tenim DNA de còpia única només als gens, sinó que també a seqüències intergèniques. Aquestes, es poden dividir en el que s’anomena “DNA moderadament repetitiu” i aquest està format per seqüències que tenen aproximadament 100 o 200 pb. D’aquestes seqüències, hi ha moltes còpies o varies còpies i estan escampades per tot el genoma, d’aquí el seu nom. Aquestes còpies disperses pel genoma tenen una particularitat i és que poden saltar d’un lloc a un altre del genoma mitjançant el procés de transposició.  mobilitat.
A banda d’aquest DNA repetitiu, dins les seqüències intergèniques trobem el DNA altament repetitiu. Aquest, molt més repetit que el moderadament, són seqüències més curtes de 10-20 pb i estan repetides en tàndem (una al costat de l’altre) o microsatèl·lits. Aquest normalment es localitza en posicions concretes del cromosomes. Centròmers, telòmers. Fa més aviat una funció estructural, ajuda a l’estructuració dels cromosomes. Senyalitza certa expressió dels cromosomes.  funció estructural.
Aquests genomes tenen altres característiques, i és que no són elements estàtics.
Poden experimentar tot un seguit de reordenacions. Aquestes, intercanvis de material genètic es duu a terme a traves de 4 processos: 4 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 1. Dos tipus de recombinació a) Recombinació general o homòloga: necessitem que els fragments que s’intercanviïn tinguin molta homologia. Cromosomes homòlegs. Mecanisme de reparació del DNA.
b) Recombinació centro-especifica o no homòloga: les seqüències no presenten homologia, seqüències concretes contingudes a regions de llocs de recombinació. En aquest tipus de recombinació té molta més importància el reconeixement que es dóna entre proteïnes que participen en aquest procés i les seqüències d’aquest DNA que no pas la homologia d’aquestes seqüències.
2. Transposició: reordenacions que consisteixen en un tipus particular de recombinació no homòloga. És un moviment d’un gen o fragment de DNA des d’un lloc del genoma cap a altre. D’un cromosoma a un altre o diferents llocs d’un mateix cromosoma. No es requereix cap tipus d’homologia. DNA moderadament repetitiu està relacionat amb aquest procés.
3. Amplificació gènica: un fragment de DNA o concretament un gen que fa moltes còpies i aquestes van a parar a un altre lloc del genoma. A diferència dels altres 3 processos, és dóna en eucariotes majoritàriament. Els altres es donen tant a procariotes com a eucariotes. Té molta importància perquè es un dels mecanismes responsable de l’adquisició de resistència en les cèl·lules tumorals als fàrmacs.
Reordenació i intercanvi del material genètic: processos que permeten la mobilitat de gens o fragments de DNA dins d’un genoma Recombinació a) General o homòloga: té lloc un intercanvi de segments homòlegs entre dos cromosomes (dues molècules de DNA homòlogues).
b) Centre-específica o no homòloga: té un intercanvi de dues seqüències de DNA específiques però no necessàriament homòlogues.
Transposició: És el desplaçament d’un gen o un fragment de DNA d’un cromosoma a un altre o d’un a una altre dins el mateix cromosoma. La transposició no requereix homologies de seqüència.
Amplificació gènica: Consisteix en una amplificació selectiva de regions específiques del genoma.
Funcions de la recombinació homòloga: - Reparació del DNA. És un dels mecanismes que ho permet. Si tenim dos copies de cada cromosoma i s’han fet malbé totes dues. Per recuperar la informació es 5 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) - - pot trobar al cromosoma homòleg. Quan es muten les dues cadenes d’un dúplex, la informació es pot recuperar de les cadenes del cromosoma homòleg Pot originar noves combinacions dels gens. Si aquests nous gens que he aconseguit mitjançant recombinació homologa presenten propietats millorades per una determinada proteïna la selecció natural els seleccionarà. Generació de noves immunoglobulines. Important per l’evolució. S’amplia el repertori de gens sobre els quals la selecció natural pot triar.
La reordenació dels gens pot afectar a la seva expressió. Mecanisme de regulació de la expressió de determinats gens (regulació de l’expressió gènica).
RECOMBINACIÓ HOMÒLOGA Comença quan tenim dos cromosomes homòlegs i un d’aquests queden tallats a les dues cadenes. Molts cops es dóna de manera espontània en procariotes i en eucariotes es produeix per enzims. Això que tenim malmès es pot recuperar a partir del cromosoma homòleg.
De manera espontània es dona un doble tall i un cop tallat, del doble tall s’ha d’aconseguir ADN de cadena senzilla en sentit 5’  3’ i deixen un extrem 3’ que sobresurt. Aquest ADN de cadena senzilla l’envaeix el dúplex complementari per recuperar la informació a partir de l’aparellament de bases: invasió de cadena. Es genera un ADN de cadena senzilla que torna a la cadena inicial trencada i, mitjançant la polimerasa, es pot anar reconstruint el tall. Genero DNA de cadena senzilla. És important, és necessari, perquè vagi envaint el dúplex complementari. Es provoca una separació de la doble cadena.
Invasió de cadena. Un cop s’ha produït una invasió de doble cadena, estem generant DNA de cadena senzilla. Aquest va a envair el dúplex trencat inicial i com ens havíem menjat trossos, mitjançant la DNA polimerasa podem anar copiant de la cadena que no tenim malmesa. Reconstrucció del tall que s’havia fet inicialment.
La cadena va creixent i es va unint amb la cadena del dúplex de dalt, formant un entrecreuament. Es generen dos intermediaris de Holiday. Un cop s’han format, 6 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) uneixo una cadena amb el dúplex de dalt i una amb el dúplex de baix. La cadena de dalt amb la de dalt però amb una part de la de baix i lo mateix per la altra. Aquests intermediaris de Holiday no queden quiets. Poden migrar per anar desfent la doble hèlix i poden migrar en les dues direccions. Major quantitat de DNA per recombinar. Si no es mogués, la quantitat de cadenes recombinades serien inferiors. Això no es pot quedar així, sinó que s’han de resoldre perquè puguem tenir dos cromosomes homòlegs, s’han de resoldre els intermediaris de Holiday. Em quedo amb la meitat d’un intermediari i el que passa aquí també esta passant a l’altre cantó.
Per recuperar els dos cromosomes, resolem aquest entrecreuament.
La meitat de la estructura d’abans. Aquest intermediari el puc dibuixar, ho puc girar 180º la de dalt quedarà exactament igual però la de baix... es pot resoldre de dues maneres: - - Puc tallar directament les cadenes que tenen la mateixa polaritat. Puc tallar les cadenes que estan recombinades. Unir altre vegada. Si faig això em resulta un producte de tot el procés de recombinació 2 cromosomes homòlegs on 1 cadena s’ha recombinat i l’altre no.
En canvi, si tallo per les cadenes no recombinades i enganxo, el resultat és que els dos cromosomes en recombinació a totes dues cadenes. Això seria el procés vist de manera esquemàtica de la recombinació homòloga.
7 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Necessitem un cert grau d’homologia per poder fer la recombinació homòloga.
Reparar DNA en procariotes: RECOMBINACIÓ HOMÒLOGA EN DNAs CIRCULARS Es pot donar entre dos DNA procariotes o entre plasmidis: Esquematitzat procés de recombinació homòloga en DNA circulars, sense extrems 3’ i 5’ lliures. Es produeix un doble tall i es produeix un tall en una cadena del dúplex i en una cadena de l’altre, no es tallen les dues cadenes del mateix dúplex. Una cadena senzilla envairà un dúplex i l’altre farà el mateix. Invasió completa i es tanca. Es forma una estructura en forma de 8  intermediari de Holiday. Aquesta estructura en forma de 8 en el procés de recombinació va permetre obtenir informació de que aquesta unió que es produïa el intermediari era una unió covalent. Aquesta estructura en forma de 8 es veu exactament això, un 8 envolcallat de proteïnes... una de les coses que va permetre demostrar utilitzar els DNA circulars per la recombinació homòloga és la unió covalent. Això vist al microscopi electrònic podria ser dues molècules superposades i que no hi hagués unió covalent o una molècula més gran replegada. Per demostrar la unió covalent va ser aïllar la estructura i tallar-la per dos punts. Si realment són cadenes concatenades això donaria DNA lineals. Si fos un DNA doble (cargolat sobre si mateix) obtindria DNA lineals. Quan van fer el tall es van obtenir com una estrella de mar amb 4 potes i això demostrava la unió covalent. L’intermediari de Holiday també es pot dibuixar girat i resoldre tallant o per A o per B. Si tallo per A estic tallant les cadenes ja entrecreuades, un cop tallades es tornen a tancar i donen dos DNA circulars on una de les dues cadenes no ha experimentat recombinació i l’altre si. En canvi, si tallo per les cadenes no entrecreuades inicialment i després les ajunto obtinc un plasmidi on totes dues cadenes han estat recombinades. La probabilitat de que es doni un tall o l’altre és exactament la mateixa.
La recombinació serveix per recuperar informació d’un DNA malmès, tant a cromosomes circulars procariotes com a DNA lineal eucariota.
En aquest cas, es permet reparar el DNA NO QUAN S’HAN TALLAT LES DUES CADENES, sinó una de les dues cadenes tallades. Això s’anomena DNA coscat 8 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) (Mellado) o que s’ha produït un nick a una de les dues cadenes. Si es produís un tall en les dues cadenes no es pot trobar informació homòloga en cap lloc.
REPARACIÓ PER RECOMBINACIÓ HOMÒLOGA Imaginem, per tant, que això es un DNA circular que està coscat. Es comença a replicar la cadena de dalt (parental) i la de sota es sintetitza de forma discontinua amb fragments d’Okazaki. Arribem al punt on s’ha tallat, el motlle es para i no pot continuar el procés de replicació. Una cadena queda replicada totalment i l’altre parcialment. En el fons estic tenint dues molècules de DNA de doble cadena i una és equivalent al cromosoma homòleg. A partir d’aquí, té lloc el procés de recombinació homòloga i anem a buscar la informació de la cadena de sota. Genero DNA de cadena senzilla i és el que envaeix el dúplex de sota, busco la regió de tall i sintetitzo el DNA copiant de la cadena que si s’ha pogut replicar. La que no s’ha pogut acabar de replicar va a buscar la informació a la cadena que s’ha pogut replicar sencera. Es produeix la invasió d’una cadena senzilla en un dúplex i paral·lelament genero DNA de cadena senzilla, el qual servirà per envair el dúplex de sota. Es genera un intermediari de Holiday i s’ha de resoldre com si fossin dos cromosomes homòlegs. S’aconsegueix que la cadena de dalt pugui continuar el procés de replicació.
MECANISME MOLECULAR DE RECOMBINACIÓ HOMÒLOGA Via del RecBCD es dóna a E. coli. (El més estudiat és la via RecBCD a E. coli).
Participen com a proteïnes específiques de recombinació homòloga: RecB, RecC, RecD. Permeten obtenir DNA de cadena senzilla (el qual envaeix el dúplex complementari).
RecBCD  Processa el DNA a partir del punt de doble tall per tal de generar ssDNA.
Rec A  participa de forma complementària, estabilitza DNA de cadena senzilla i envaeix la cadena homòloga. Promou l’intercanvi de cadenes.
Ruv A i Ruv B  permeten/promouen la migració de cadenes.
Ruv C  resol l’intermediari de Holiday.
ACCIÓ DEL COMPLEX RecBCD 9 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) A la part de dalt tenim un dúplex amb un doble tall a totes dues cadenes tallades. Em quedo amb la meitat del dibuix que tinc, la meitat de la cadena grisa (dalt) i el procés comença quan es dona el doble tall, en aquest punt s’uneix el complex RecBCD. Té com a funció generar el DNA d’aquest dúplex en forma de cadena senzilla.
Necessitem activitat nucleasa i helicasa: RecB té activitat helicasa i nucleasa (3’  5’) i RecD té activitat helicasa (5’  3’). Degraden les cadenes i les mantenen.
RecC acosta l’extrem 3’ cap a B i l’extrem 5’ cap a C. Desfaig la doble hèlix i la vaig degradant tant de 3’  5’ com de 5’  3’. Va avançant i això m’acosta als enzims on tinc activitat nucleasa. Aquest procés continua i anem degradant les dues cadenes fins que es reconeix una seqüència especifica: seqüència Chi (fa referència a Crossover hotspot instigator, és una seqüència específica (GCTGGTGG) però molt comuna: (1000 cops en comptes de 80). No incorporarà DNA d’altres espècies) la particularitat que té és que si aquesta seqüència la busqués per probabilitat la trobaria unes 80 vegades al genoma de E. coli. En aquest cas el trobo unes 1000 vegades.
Cada espècie o organisme procariota té una seqüència Chi diferent. Tots tenen una seqüència chi. Perquè són diferents?  Perquè un DNA que arribi de diferent espècie no es pugui recombinar.
Què passa quan el RecBCD interacciona i reconeix la seqüència Chi?  de les dues cadenes que s’estaven degradant NOMÉS es degrada la que va de 5’  3’. L’altre 10 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) deixa de degradar-se, amb la qual cosa només degrado una cadena i aconseguiré un extrem 3’ de cadena senzilla lliure.
ACCIÓ DE RecA A partir d’aquí, aconseguit aquest DNA de cadena senzilla, aquest no pot envair el nucli complementari tot sol. Necessita la proteïna RecA per poder fer-ho. Aquesta permet que el DNA de cadena senzilla pugui envair el dúplex complementari i trobar les seqüències de complementarietat. RecA va formant (subunitats múltiples) una hèlix dextrogira al voltant de l’ADN, l’envolcalla. Cada monòmer de RecA reconeix 4 nucleòtids. Tinc 6 subunitats de RecA per cada volta d’hèlix, es forma una cadena que s’està envaint i quan troba el lloc on pot fer aparellament de bases es trenca el que ja hi ha i se’n forma un de nou.
Sota tindríem el dúplex complementari i de forma transitòria es genera una cadena de DNA senzilla envolcallada per RecA. Aquesta té un lloc d’unió o reconeixement de cadena de DNA senzilla i un lloc de reconeixement d’un altre nucleòtid que corresponen als de la cadena que ha envaït. Consisteix en anar trencant els enllaços d’aquesta doble hèlix (base flipping) i quan realment troba una seqüència d’unes 15 bases, es trenca l’aparellament de bases i es forma un nou aparellament de bases.
11 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Triple hèlix que quan troba una seqüència complementària es bescanvia la cadena del dúplex amb la cadena invasora. A mesura que anem trobant la parella complementària la cadena de DNA està dibuixada de color clar i el dúplex és de color vermell.
Bescanvia la cadena i genera una cadena senzilla. Momentàniament he aconseguit la hèlix triple i vaig trencant l’aparellament de bases i formant nou aparellament de bases.
Genero cadena senzilla de DNA.
Primer dúplex unit a RecA. Hèlix triple i per base flipping miro si són complementaris.
Quan el trobo faig nous aparellaments. Canvio una de les cadenes vermella per la cadena senzilla que tenia inicialment i envairà l’altre.
Necessitem aport d’energia amb hidròlisi d’ATP. A banda d’això, el dúplex envaït per DNA de cadena senzilla, estem obrint la doble hèlix.
L = T – W. Si no trenco cap de les cadenes del dúplex la L no canvia, aquesta només canvia quan es produeix un tall en una de les dues cadenes. En canvi, estic desfent la doble hèlix i per tant T està disminuint. Per mantenir aquesta igualtat, T es fa més petit i W ha d’augmentar (estic eliminant superenrotllaments negatius). Això es una forma de conservar energia per poder conservar la doble hèlix.
ACCIÓ DE Ruv AB Un cop s’ha produït això, com ens hem menjat un tros de doble hèlix necessitem fer síntesi de ADN. Finalment, lliguem les cadenes i formem els intermediaris de Holiday. Un cop fet, s’obté el que hi ha a la figura: 4 cadenes entrecreuades amb un intermediari de Holiday. Es dóna el procés de migració de branques. Ja he aconseguit lligar una cadena amb altra i per aconseguir més tros de molècules recombinades es forma un moviment de l’intermediari desfent i tornant a fer les hèlix (migració de les hèlix). Proteïnes Ruv A i Ruv B.  Un cop format l’intermediari de Holliday, la migració de cadenes augmenta la quantitat de material bescanviat.
Ara només en tenim 1 intermediari però hi ha 2.
Ruv A és un tetràmer que reconeix els intermediaris i és reconeguda per Ruv B.  Ruv A s’uneix específicament a intermediaris de Holliday.
12 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Ruv B té activitat helicasa (pot girar les cadenes en el sentit que indiquen les fletxes) i anem desplaçant l’intermediari de Holiday. Necessita desfer la doble hèlix. ATPasa: sintetitzar ATP i obtenir energia.  Ruv B té activitat helicasa i promou l’avançament.
ACCIÓ DE RuvC Un cop s’ha produït aquesta migració de branques necessitem resoldre l’intermediari de Holiday. Per fer-ho, intervé Ruv C. Té activitat nucleasa. Reconeix l’intermediari de Holiday i talla les dues cadenes amb la mateixa polaritat.  Ruv C té activitat endonucleasa i funciona en combinació amb RuvAB. RuvC reconeix el complex DNA-RuvAB, talla les dues cadenes de DNA amb la mateixa polaritat i els extrems 5’ i 3’ són units per la lligasa.
A banda de reconèixer el complex format per Ruv A i Ruv B a l’intermediari de Holiday, en E. coli reconeix una seqüència específica. Aquesta marca el punt on Ruv C farà el tall. Totes dues tenen la mateixa polaritat, mateix sentit. Les cadenes seran unides per la DNA lligasa en aquest punt del procés.
Permet que hi hagi més quantitat de cadena recombinada  migració de cadenes.
RECOMBINACIÓ NO HOMÒLOGA O CENTRE-ESPECÍFICA ELEMENTS que participen en aquest procés: Recombinasa  proteïna que té capacitat per reconèixer seqüències especifiques anomenades llocs de recombinació, son seqüències relativament curtes que es troben a canto i cantó de la regió que serà recombinada per aquesta proteïna. Regió d’entrecreuament. Recombinasa  reconeix les regions específiques a recombinar, les uneix i catalitza el trencament i relligament de les cadenes Llocs de recombinació  segments reconeguts per la recombinasa que flanquegen una regió asimètrica (regió d’entrecreuament) on té lloc la recombinació centreespecífica.
Proteïnes auxiliars  regulen en quin moment es dóna el procés de recombinació i influeixen en el resultat del procés de recombinació.  regulen el moment de la recombinació o l’efecte produït per aquesta reacció.
En aquest procés és més important el reconeixement proteïna-DNA que l’homologia de seqüències entre el DNA que es recombina. No es necessiten graus d’homologia elevat, sinó el reconeixement proteïna-DNA. (On la proteïna és la recombinasa i el DNA són els llocs de recombinació).
LLOCS DE RECOMBINACIÓ La recombinació la podríem esquematitzar d’aquesta manera: color vermell i color blau son de doble hèlix. Els llocs vermells i blaus són les seqüències de recombinació que flanquegen la regió d’entrecreuament. Les recombinases normalment son tetràmers i reconeixen 4 llocs de recombinació. Hamburgueses simbolitzen les recombinases i cada lloc de recombinació te una recombinasa. El tall té lloc a la regió 13 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) d’entrecreuament i es produeix un canvi d’una cadena per una altre. Estem enganxant un fragment vermell amb un blau, gir de 180 graus.
Tipus de recombinases en funció de com són o com estan orientats aquests llocs de recombinació com són els talls.
Els llocs de recombinació estan a cantó i cantó, coneguts com regió d’entrecreuament. Depenent de quina sigui la orientació d’aquests, el resultat del procés de recombinació és diferent.
POSSIBLES RESULTATS DE LA RECOMBINACIÓ ESPECÍFICA DE LLOC SEGONS LA LOCALITZACIÓ I ORIENTACIÓ DELS LLOCS DE RECOMBINACIÓ Anem a suposar que tenim dos llocs de recombinació que estan dins la mateixa cadena (fletxes de l’esquema), la recombinació es pot donar també quan les regions de recombinació es troben a la mateixa cadena. Quan aquests llocs de recombinació tenen una seqüència oposada, el resultat del procés de recombinació no és res més que una inversió de la seqüència entre els llocs de recombinació.
14 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Això es dóna quan les seqüències de lloc de recombinació estan en orientacions oposades. Quan aquesta mateixa cadena té els llocs de recombinació en seqüències oposades es com si tingués dues cadenes que poden experimentar recombinació però els llocs de recombinació estan en la mateixa cadena. El resultat és una inversió de la zona central, canvia la orientació d’aquest segment i s’enganxa girat.
En canvi, quan tinc els llocs de recombinació dins la mateixa cadena però estan en la mateixa direcció, el resultat del procés de recombinació és una deleció, una pèrdua de la regió central.
El procés de recombinació no homòloga pot tenir lloc quan les regions de recombinació es troben en cadenes separades i les regions de recombinació es troben en la mateixa direcció. Inserció del segment i recuperem l’estructura.
Sempre impliquen dos dúplex de DNA que es recombinen, però els llocs de recombinació poden estar en la mateixa cadena, pot passar el una cosa o una altre dependent de la orientació dels segments de recombinació.
Aquest procés, comparant els llocs de recombinació dins d’una mateixa cadena. Si la orientació és la mateixa el que faig és invertir el procés i ara s’insereix. En dos cadenes diferents.
Quan hi ha deleció crees dos cadenes diferents. Es produeix una recombinació no homòloga i es pot donar una eliminació de fragments.
Reordenacions significatives del genoma. Provoquen deleció o inserció.
RECOMBINACIÓ PER UNA SERINA RECOMBINASA Perquè tingui lloc aquest procés de recombinació hi ha recombinases: - Serines recombinases Suposem que tenim dues cadenes de DNA en els quals hi ha llocs de recombinació (indicat per blau o vermell) en cada una de les dues cadenes. Entre mig dels llocs de recombinació hi ha llocs de reconeixement, recombinases respectives o tetràmer de recombinases reconeixen proteïna-DNA i es catalitza el tall de totes dues cadenes de 15 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) cadascun dels dúplex. Es generen extrems 3’ lliure i els extrems 5’ que haurien de quedar lliures esta formant un enllaç fosfoèster amb el centre actiu de les recombinases. Sempre tindrem un extrem 3’ amb grup OH lliure i el extrem 5’ unit al centre actiu de les recombinases. Això per un dúplex i passa el mateix per l’altre dúplex. L’enzim té una serina al centre actiu i les serines recombinases necessiten l’unió d’una serina en cada un dels 4 llocs d’unió.
Amb les topoisomerases passava el mateix. Es tracta d’un procés conservatiu. 4 enllaços fosfodièster (DNA-P) que per no perdre aquesta energia es trenquen i es formen i 4 enllaços fosfoèster (enzim-P). Més tard, es tornaran a trencar aquest tipus d’enllaç i es tornaran a formar els fosfodièster entre DNA-P.
Trenco 4 enllaços fosfoèster i estic formant 4 enllaços de ester fosfat entre extrem 5’ i la serina recombinasa. Des de punt de vista energètic és car. Perquè no sigui tan car es vol conservar l’energia d’aquest enllaç  es conserva energia en forma d’enllaç extrem 5’ amb el centre actiu de l’enzim.
Un cop s’ha produït el punt de tall es forma un intercanvi de parelles. El fragment blau tirarà cap amunt i quedarà unit al fragment vermell. Un cop s’ha produït l’intercanvi de cadenes es tallen les cadenes. Els grups OH lliure a l’extrem 3’ provoquen un atac 16 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) nucleofílic als 4 llocs i és més fàcil que es produeixin quan conservo energia formant la unió covalent entre extrem 5’ i l’enzim, és a dir, formant enllaç fosfoèster.
Passa per una cadena, per l’altre cadena... quan es produeix l’atac s’alliberen les recombinases i es tornen a formar els enllaços fosfodièster. Haurem bescanviat un extrem amb un altre.
Es trenca el enllaç fosfoèster entre el P i l’enzim i es formen enllaços fosfodièster entre grup fosfat i la cadena de DNA (unió dels extrems), tot alliberant la serina recombinasa (enzim).
- Tirosines recombinases Cas concret. Val pel funcionament de totes les tirosines recombinases. L’enzim té l’aminoàcid tirosina al centre actiu.
Recombinasa cre que es troba en el fag P1. Aquesta reconeix uns llocs de recombinació que reben el nom de loxP.
Dues cadenes de DNA, dos dúplex i 4 llocs loxP (de recombinació). Aquests són reconeguts, cadascun per una recombinasa. En aquest cas, cada recombinasa que s’uneix a un loxP no són actives totes alhora, sinó que s’activen per parelles. Verd  actives. Sempre hi ha una unida a un loxP de la cadena i una altre unida a la altre cadena. Lila  no actiu. Actiu vol dir que tenen una conformació i les lila tenen una altra conformació que de moment no les fa actives. Passem d’estat activat a no activat.
La tirosina del centre actiu té un enllaç OH (hidroxil) que provoca un atac nucleofílic a només una cadena dels dúplex. A la primera etapa només tallem una de les cadenes i abans tallàvem 2 cadenes. L’extrem 3’ queda unit al mitjançant un enllaç fosfoèster i al centre actiu de la recombinasa.
Al dúplex de dalt queda l’extrem 3’ unit a l’enzim i el grup OH lliure a la cadena de sota. El mateix succeeix a l’altre cadena però a la inversa.
17 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Aquest intermediari que s’ha format quan tallem una de les cadenes del dúplex es diu intermediari cre-DNA. A aquest es promou un atac nucleofílic per part del grup hidroxil sobre l’enllaç fosfoèster que esta unint el grup fosfat amb la tirosina del centre actiu de l’enzim i, posteriorment, es promou la unió d’una de les cadenes del dúplex de sota amb una de les cadenes del dúplex de dalt (enllaç fosfodièster), és a dir, es comença a recombinar. Passem d’un intermediari cre-DNA a un intermediari de Holiday.
Les tirosines recombinases en el procés de recombinació passen per un estadi que permet la formació d’un intermediari de Holiday. Les dues recombinases actives canvien de conformació i esdevenen inactives i les inactives passen a actives.
A aquestes recombinases que ara són actives ara la tirosina promou un atac nucleofílic sobre aquella cadena que no s’havia tallat. Altre cop tornem a tenir el mateix. Torno a trencar un enllaç fosfoèster, es genera un extrem 3’ amb unió al centre actiu mitjançant un enllaç fosfoèster amb la recombinasa, tant per una cadena com per l’altre, i queda un extrem 5’ lliure.
Un cop format el trencament, torno a estar a intermediari de cre-DNA i torno a tancar les cadenes, torno a repetir el procediment anterior. El grup OH promou un atac nucleofílic a l’enllaç fosfoèster entre el grup P i el centre actiu de l’enzim, tot alliberant la recombinasa unida al DNA. Tallem les cadenes i recombinem.
Resultats de la recombinació: en funció de quina sigui la orientació dels llocs de recombinació el resultat del procés de recombinació pot ser un o altre i depèn de si estan a la mateixa cadena o no.
FUNCIONS RECOMBINACIÓ CENTRE-ESPECÍFICA 1. Regulació de l’expressió de determinats gens 2. Producció de reordenacions en el DNA programades, que tenen lloc durant el desenvolupament d’organismes o bé reordenacions lligades al cicle de replicació de certs DNAs vírics o de plasmidis.
La recombinació homòloga és molt útil perquè permet recuperar el DNA malmès.
En el cas de centre-especifica a part de produir reordenacions permet regular l’expressió de determinats gens. Les flagelines A i B es troben als flagels d’espècies de salmonel·la. Aquest cas, els gens que codifiquen per proteïnes flagelina A i B estan sota el control del promotor i aquest promotor està situat dins del lloc d’entrecreuament d’una regió que experimenta recombinació no homòloga. És a 18 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) dir, més amunt dels gens de les flagelines hi ha dues regions, dos llocs de recombinació que estan situats en orientacions oposades. Quan les seqüències tenen orientació oposada i estan en la mateixa cadena hi ha una inversió. De tant en tant, expressa aquests gens que codifiquen per aquestes proteïnes dels flagels. Com son proteïnes molt exposades, el cos reacciona justament contra aquestes proteïnes i crea anticossos que reconeixen aquestes flagelines. Si ens tornem a infectar tindrem defenses i no la enganxarem tan forta però la salmonel·la té la capacitat d’experimentar recombinació no homòloga. Concretament de la regió d’entrecreuament, situada entre els dos llocs de recombinació. Si el genoma d’aquesta salmonel·la experimenta recombinació no homòloga amb aquesta d’aquí es provoca una inversió i el promotor controla l’expressió dels dos gens. El promotor queda orientat just en sentit contrari i ara no controla l’expressió d’aquests gens. Els flagels no tenen les proteïnes codificades per a aquests gens i les salmonel·les no seran reconegudes pels nostres anticossos, tornaran a infectar el nostre cos amb facilitat.
Bàsicament intervenen els llocs de recombinació anomenats hixL i hixR, el gen de la recombinasa i el promotor que controla l’expressió d’aquest gen.
Les reordenacions poden estar programades al llarg del desenvolupament d’un organisme en funció de les necessitats. Es pot donar lligat al cicle de replicació de determinats plasmidis de bacteris, es poden produir en tots els organismes que puguem imaginar.
TRANSPOSONS DE DNA A banda de la recombinació homòloga i la no homòloga també hi ha un altre mecanisme que permetia la reordenació dins el genoma. Aquest mecanisme s’anomena transposició. Els transposons, durant tot el seu cicle de transposició estan en forma de DNA.
La transposició no és res més que un tipus particular de recombinació no homologa. La duen a terme uns elements que tenim presents al genoma que reben el nom de transposons. No són res més que fragments de DNA que tenen la capacitat de saltar d’un punt del genoma a un altre. D’un lloc del cromosoma a un altre lloc del mateix cromosoma o bé d’un altre cromosoma. No hi ha res que marqui el lloc on aniran a parar. No hi ha restriccions en quant al lloc on caurà aquest transposó, pot ser que vagi a parar a una regió del genoma que sigui codificant (gens que codifiquen per proteïnes). Si cau enmig d’un gen que codifica per una proteïna, pot ser que malmeti l’expressió d’aquesta proteïna. Hi ha malalties provocades perquè hi ha un determinat transposó. Neurofibromatosi (transposó que ha anat a parar enmig d’un gen anomenat NF1).
19 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Només un 1.5% del nostre genoma codifica per proteïnes i tinc molts números perquè els transposons vagin a parar a regions que no codifiquen per proteïnes però depenent on caigui poden provocar el que sigui perquè aquestes intervenen en zones reguladores.
Un 50% del nostre genoma esta format per transposons. Es produeixen més mutacions.
Els transposons de DNA  Quan aquest element genètic es mou d’un lloc a un altre del genoma sempre ho fa com una còpia de DNA. Al llarg de tot el seu cicle de moviment es mou en forma de DNA.
Aquests transposons de DNA hi ha de tres tipus principals però tots tres tenen la estructura que veiem en pantalla: el transposó va de blau a blau. Sempre trobem seqüències terminals repetides i invertides (verd fosc). Això marcarà el per on es tallarà aquest transposó. A banda d’aquestes seqüències terminals repetides i invertides, a l’interior del transposó es codifica l’enzim responsable del procés de transposició: transposasa, recombinasa o integrasa. La transposició és un cas particular de la recombinació no homòloga o centre-específica.
Hi ha diferents tipus de transposons: - Transposons simples: només codifiquen per la transposasa.
Dins d’aquests transposons de DNA aquells que només quantifiquen per l’enzim responsable del moviment del transposó són els simples.
- Transposons complexos: codifiquen també per altres gens.
Tenen gens que codifiquen o confereixen resistència a antibiòtics, altres gens que codifiquen per altres proteïnes que codifiquen per altres funcions + els propis de transposons.
- Transposons no autònoms: no codifiquen per la integrasa.
No codifiquen absolutament per res al seu interior, ni tan sols per la transposasa.
Necessiten la transposasa codificada per un altre transposó.
A banda d’aquesta estructura o classificació, a cantó i cantó del que es pròpiament el transposó trobem les seqüències o duplicacions del lloc on va a parar el transposó.
Contenen exactament a cantó i cantó la mateixa seqüència, son conseqüència del mecanisme pel qual aquests transposons es mouen.
Aquests transposons de DNA sempre els tindrem en forma de DNA. Aquests es poden moure o saltar d’un lloc a altre del genoma mitjançant dos mecanismes: - TRANSPOSICIÓ SIMPLE o CUT & PASTE A dalt de tot tenim el transposó del DNA amb les seqüències repetides invertides a cantó i cantó. S’expressarà la transposasa i provoca un tall a totes dues cadenes dels transposons del DNA. Deixarà extrems 5’ i 3’ lliures en totes dues cadenes. A aquests extrems generats quedarà fixada la transposasa formant un complex anomenat 20 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) transposoma o complex sinàptic. Aquest complex format per la transposasa i el transposó permet que es produeixin atacs nucleofílics en el punt del DNA on inserirem el transposó. A l’extrem 3’ de la cadena tallada es produeixen atacs nucleofílics d’enllaç OH (hidroxil). L’altre està tallat al biaix (no és completament vertical). Aquestes cadenes que estan en contacte amb la cadena del transposó tornen a formar l’enllaç fosfodièster i a les altres tenen un forat però com estan aparellades inicialment podrem saber la seqüència que falta. Una de les cadenes ja queda unida però queda un forat. Aquest forat no es pot deixar així, s’ha de reomplir i per això es fa servir la DNA polimerasa i tota la maquinària de replicació de la cèl·lula. Amb la qual, cosa ens queden a cantó i cantó del transposoma seqüències idèntiques, duplicacions de la mateixa seqüència. El transposó s’ha mogut del lloc inicial i ha anat a parar on sigui. El DNA inicial ha perdut el transposó i el DNA pot ser reparat per mecanismes de reparació de DNA o si és un plasmidi serà degradat. Es tanca la cadena però s’ha perdut el transposó.
- TRANSPOSICIÓ REPLICATIVA (dreta): Mecanisme de transposició replicativa no es perd el transposó de la molècula donadora. El mecanisme pel qual el transposó es mou és diferent del de transposició simple. Un altre cop comencem amb una molècula donadora amb un transposó i seqüències que reconeix la transposasa, però en comptes de tallar les dues cadenes només talla una de les dues cadenes de cada extrem. Ens torna a passar el mateix: els grups OH lliures a l’extrem 3’ promouen un atac nucleofílic sobre el DNA receptor.
En aquest cas, però, se’ns forma una molècula que és una barreja del transposó i del DNA receptor. (De fet, això es va descobrir perquè quan s’estudiaven els mecanismes de transposició a bacteris es va veure que hi havia bacteris que portaven plasmidis amb transposons. Després d’n replicacions trobaven bacteris amb dues còpies de transposons. Després de n divisions cada plasmidi hi havia un transposó.
S’havia duplicat. Per poder explicar això, reprenem):  l’extrem A queda unit 21 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) covalentment amb una de les dues cadenes de DNA receptor i aquest fragment forma aparellament de bases amb aquest cantó. Què ha passat? Tenim un extrem 5’ i un altre 3’. Altre 5’ i altre 3’. Són dues forques de replicació. Aquesta cadena creix cap a la dreta i l’altre creix cap a l’esquerra. Dupliquem el meu transposó i per això es diu transposició replicativa. (5’  3’). Un cop formada aquesta estructura i s’ha replicat, s’obté una molècula que té una part del DNA receptor amb el transposó, conegut com cointegrat (el que es veia al bacteri, plasmidi de mida doble).
Dues còpies del transposó en una sola molècula. A partir d’aquí, com la transposició és un cas de transposició no homòloga o centro-específica la molècula que porta el transposó experimenta una separació de molècula donadora i de la receptora. No perdo la molècula originària sinó que realitzo una còpia. Es com si un cop tinc el cointegrat estigués passant el que vèiem a la imatge de l’apartat “possibles resultats de la recombinació específica de lloc segons la localització i orientació dels llocs de recombinació”. Deleció del transposó de la molècula original i el transposó copiat en l’altre molècula. Hi ha una recombinació centro-específica. En aquest cas, el resultat és la separació o procés de deleció de les dues molècules que estaven unides en el cointegrat. El transposó s’ha replicat i després no es perd de la molècula donadora.
- RETROTRANPOSONS: Aquests, a diferència dels transposons de DNA, es mouen d’un lloc a altre del genoma a través d’una còpia de RNA. Hi ha una etapa de formació de RNA, transcripció d’aquest retrotransposó. Aquest RNA passa a cDNA i s’integra al DNA receptor.
22 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) D’entrada, aquests retrotransposons tenen la estructura que veiem aquí.
Seqüències terminals invertides i repetides, reconegudes per la retrotransposasa.
A cantó i cantó tenen les repeticions terminals llargues (LTR) juguen un paper important en el moment de passar el RNA d’un transposó a cDNA. A més a més, si he de passar de RNA a cDNA aquests retrotransposons sintetitzen per un enzim transposasa i per la transcriptasa inversa (enzim que permet passar de RNA a DNA primer fent una còpia senzilla i més tard passem a una còpia de DNA de doble cadena).  codifiquen la transposasa i la transcriptasa inversa. En els extremes també tenen les seqüències invertides necessàries per a l’acció de la transposasa.
TRANSPOSICIÓ DE RETROTRANSPOSONS En aquest cas, el moviment dels retrontransposons és el següent: suposem que estem en una cèl·lula eucariota amb un nucli i tenim a l’interior un transposó. Aquest, es pot transcriure i donar lloc a n cadenes de mRNA corresponents al transposó sencer o els enzims. Aquest mRNA surt del nucli i és captat pels ribosomes per sintetitzar les proteïnes codificades al transposó. Un cop sintetitzades les proteïnes, aquestes contenen el que es coneix com seqüències de localització nuclear. (Dins d’una seqüència d’aminoàcids d’una proteïna (en aquest cas una transposasa) hi ha una petita seqüència normalment rica en aminoàcids bàsics coneguts com a seqüències de localització nuclear i serveix perquè qualsevol tipus de proteïna (cèl·lules eucariotes) sintetitzada al citosol quedi etiquetada d’alguna manera i sigui reconeguda per seqüències de localització nuclear per la maquinària i fer-la anar cap al nucli. De vegades poden passar pels porus nuclears. Aquestes proteïnes etiquetades són reconegudes per altres proteïnes anomenades importines mitjançant una sèrie de processos passen a través de complexos de porus nuclears). Poden entrar dins del nucli i aquesta transcriptasa inversa un cop dins del nucli agafa seqüències de mRNA corresponents al transposó i les passa a cDNA. Un cop tinc aquest cDNA format anirà a parar al lloc que sigui del genoma mitjançant un mecanisme de tall i unió d’un transposó normal. Sempre passem abans de passar a DNA de doble cadena, passem per una còpia de RNA. Transposasa ha d’entrar dins del nucli i l’altre també. Lisines i arginines sobretot són els aminoàcids que dominen a les seqüències.
23 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Comparativa d’un moviment de transposó de DNA per transposó simple i amb un retrotransposó  Aïllo sempre el transposó amb un intermediari de DNA, que és el que va a parar al DNA receptor (transposó simple), i en el retrotransposó passem per un intermediari de RNA, amb una transcriptasa inversa pot passar a cDNA.
RETRORANSPOSONS AMB CUA DE POLI A Aquests es mouen fent una còpia de RNA però el mecanisme com van a parar a una altre part del genoma és diferent. La estructura és diferent també. Hem perdut del que es pròpiament el transposó (conservem seqüències repetides del DNA receptor) les seqüències repetides. Tenim una seqüència en 5’ no traduïda (UTR) i el mateix a l’extrem 3’. Al costat d’aquesta seqüència UTR a 3’ apareix una cua de poli A. Regió promotora a 5’. La primera seqüència codifica per una proteïna d’unió al DNA (Orf1) i l’altre per una activitat transcriptasa inversa i endonucleasa (orf2).
Dues famílies: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) i SINE (Short Intrespersed Nuclear Elements). Aquests LINEs i SINEs formen part dels genomes eucariotes  Famílies de seqüències  DNA moderadament repetitiu. Són seqüències disperses pel genoma que poden experimentar processos de transposició. Als genomes eucariotes.
LINE  DNA repetitiu (20% DNA total) i codifica RNA-binding protein (ORF1) i transcriptasa reversa/endonucleasa (ORF2).
SINE  13% genoma humà, longitud curta (100-400bp) i no codifiquen proteïnes però presenten la cua poliA.
LINE i SINE es diferencien per la mida i els SINEs (els més curts) presenten la cua de poli A però no codifiquen en absolut per les proteïnes necessàries per saltar d’un lloc a un altre del genoma, han d’aprofitar les proteïnes codificades al LINEs. Equivalent als transposons de DNA (no autònoms que no codificaven per la transposasa i havien d’aprofitar la transposasa codificada per un de simple o un de complex). Per poder saltar, malgrat conservin la cua de poliA, necessiten agafar els enzims expressats d’un line. Aproximadament al genoma humà els line ocupen un 17% del genoma codificant.
Tenim molt. Entren les proteïnes soles, sense arrossegar el tros d’ARN.
Com es mouen aquests retrotransposons amb cua de poli-A?  TRANSPOSICIÓ DE LINEs 24 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Sempre necessitem passar per un intermediari de RNA, la primera etapa en el procés de moviment és sintetitzar, transcriure aquest transposó en forma de RNA. En l’extrem 5’ tenim una regió UTR on hi ha un promotor que permetia transcriure el transposó. Un cop sintetitzar el RNA, en cas de cèl·lula eucariota és traduït a proteïna però en aquest cas les proteïnes queden unides a la cua de poli-A del mateix RNA que les està codificant i com aquestes proteïnes contenen també senyals de reconeixement nuclear i van a parar al nucli arrosegant el mateix RNA de les que les codificaven. Un cop ha traduït a proteïna s’enganxen al RNA i entren al nucli arrosegant el RNA. Un cop tinc el RNA amb les proteïnes al nucli es busca una regió rica en timines, serà complementària de la cua de poli A. Quan es troba la regió, es talla una de les dues cadenes del DNA receptor i la cua de timines s’aparella amb aquesta cua d’adenines (al punt on s’ha efectuat el tall) i es genera al punt del DNA receptor una cua de timines complementària a la cua de timines que es farà servir com a motlle de la cadena de RNA. La transcriptasa inversa sintetitzarà una cadena complementària. Farà d’encebador la cua poliA que ha fet aparellament de bases amb la cua de timines. La transcriptasa inversa el fa servir com encebador per fer una cadena complementària. Es degrada la cadena de RNA i sintetitzem la cadena complementària i per una sèrie de processos inserirem això a la cua de timines. Els passos per produir la segona cadena encara no es coneixen gaire. Es fa servir la primera cadena de cDNA per copiar la cadena de cDNA (la segona és degradada) i s’inserirà el transposó. Es copia la primera cadena fent servir com a motlle fent servir el RNA. Un cop tens l’híbrid de RNA i DNA el RNA es degrada i es fa servir la primera cadena sintetitzada de DNA per fer una còpia i el mecanisme amb el qual es fa en aquest moment no es coneix gaire.
Els genomes eucariòtics estan plens de relíquies de transposons: 25 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) En genomes eucariotes (en humans un 50% del genoma són transposons). En humans els transposons de DNA i els retrortransposons són inactius. Un 2% dels retrotransposons de cua de poliA es poden moure, són actius i són causa de mutacions. En ratolins, ambdós tipus de retrotransposons (simples i amb cua poliA) són encara actius i són responsables d’un 10% de les noves mutacions.
Comparació de dos genomes: humans i ratolins. La regió del genoma que codifica per globines. Les boletes i triangles no són res més que insercions de transposons. En ratolins, com dos tipus de retrotrasnposons són actius, el nombre de mutacions al genoma de ratolí (com més actius, més salten i més possibilitat de mutacions). Podem veure que hi ha molt més mutacions que no pas en humans. En humans un 2% dels retrotranspsoons amb cua de poli A van saltant, són actius. No es poden eliminar del genoma, són perfectes perquè són elements del genoma que es copien a si mateixos i van canviant de posició. Si codifiquen per algun gen perjudica és una manera de fer créixer el genoma.
IMPORTÀNCIA DE LA TRANSPOSICIÓ a) Responsable d’una part important de la reorganització genètica. Promouen inversions, delecions i reordenacions en el DNA hoste.
b) És important en l’evolució de cromosomes i plasmidis: Per exemple: - - La resistència d’alguns bacteris als antibiòtics és el resultat de l’acumulació en un plasmidi dels corresponents transposons que confereixen resistència als antibiòtics.
Transferència d’informació genètica no limitada a espècies properes (s’han trobat transposons idèntics en bacteris no relacionats).
Promou la formació de noves proteïnes per unió de segments de gens independents.
c) Les reordenacions promogudes per transposons poden ser responsables de la regulació en operons de gens originalment distants.
Igual que els altres mecanismes que hem anat comentant, és responsable de reorganitzacions del genoma. Segons quin sigui el seu mecanisme poden induir inversions, delecions... poden reordenar significativament el genoma. Aquestes reordenacions són importants a nivell de genoma i a nivell de plasmidis, tant a eucariotes com a procariotes.
S’ha vist que hi ha bacteris que han adquirit resistències a antibiòtics perquè s’han donat acumulacions als plasmidis de transposons que confereixen resistència a antibiòtics. Tot va a parar a un mateix plasmidi i hi ha resistències a diferents antibiòtics.
S’ha vist també que s’han trobat transposons entre bacteris no relacionats.
Informació genètica que passa d’un organisme a un altre i no són pas espècies properes.
26 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Per últim, si estic enganxant trossos junts d’un cantó a un altre puc originar nous gens i per tant, noves proteïnes. Si el resultat és una proteïna que permet sobreviure, una adaptació, el gen perdurarà. Serà seleccionat naturalment, afavorit.
A banda d’afectar les reordenacions al genoma aquests transposons permeten anar ajuntant fragments d’un organisme i un altre tindrem diferents gens que siguin regulats per un únic element. Regulacions de determinats operons. El que trobem en un operó amb un gen al costat de l’altre prové de transposons que estaven allunyats de bon començament.
AMPLIFICACIÓ GÈNICA Es tracta d’una amplificació selectiva de regions específiques del genoma (té lloc principalment en cèl·lules eucariotes).
Es dóna: - En processos normals del desenvolupament Com a conseqüència de situacions d’especial tensió metabòlica Tot els altres tipus de mecanismes es donen a eucariotes i procariotes. Aquest és més propi d’eucariotes. És una amplificació selectiva d’una part del genoma, regió específica. De vegades, d’un determinat gen.
Es dóna en processos normals del desenvolupament (cèl·lules embrionàries que necessiten una divisió més ràpida) i a més a més pot ser reversible. Quan no és necessària, l’amplificació es reverteix.
També es pot donar en cèl·lules que estan subjectes a una tensió metabòlica, és a dir, que estan sota estrès perquè les estem tractant amb alguna cosa (p. Ex. Un fàrmac).
27 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Cultiu al laboratori intentem veure si un determinat fàrmac mata a les cèl·lules o no.
Quan s’han fet aquests tractaments amb un fàrmac anomenat metotrexat (clínica pel tractament de pacients) inhibeix un enzim anomenat dihidrofolat reductasa (DHFR) és un enzim que participa en rutes metabòliques que en cèl·lules tumorals estan molt actives. Síntesi d’aminoàcids, de nucleòtids... rutes que en divisió cel·lular estan molt actives. Les cèl·lules es van morint conforme apliquem el tractament però arriba un punt que per més fàrmac que apliquem les cèl·lules no es moren i les cèl·lules s’han tornat resistents al fàrmac (això passa a la realitat, cèl·lules tumorals de pacients).
Això succeeix, en part, per l’amplificació gènica (és un dels mecanismes pels quals es torna resistent al fàrmac). Les cèl·lules tenen tendència a intentar respondre al tractament del fàrmac. Es fan moltes còpies del gen que codifica per l’enzim. A una zona molt llunyana del genoma, als extrems dels cromosomes i la regió on s’han acumulat n còpies del mateix gen apareix com una regió de tinció homogènia que es diferencia perfectament de la resta de bandes del cromosoma. De vegades apareixen com petits cromosomes que s’han desenganxat del cromosoma inicial i són còpies del gen amplificat anomenat cromosomes diminuts dobles. Arriba un punt que no et pots passar de la quantitat de fàrmac que pots subministrar, té efectes tòxics si sobrepasses un límit.
Malgrat que s’està estudiant molt, no es coneixen els mecanismes exactament que fan que es produeixi aquesta amplificació i pot tenir molta importància.
Un dels mecanismes que potser és més acceptat implica el següent: perquè es produeixi aquesta amplificació d’una regió concreta es que es doni un procés anòmal de replicació del genoma: Forca de replicació que va copiant cada una de les cadenes (fins aquí normal) i a partir d’aquí es formen forques de replicació addicionals, és a dir, exactament a cada una de les cadenes que s’estan replicant apareix una nova forca de replicació. Es torna a obrir i tornen a aparèixer forques de replicació. Hi ha fragments de replicació addicionals, i es creu que són els cromosomes diminuts dobles. Aquest tros petit que has copiat s’enganxa entre sí i forma els cromosomes diminuts dobles. (HIPÒTESI).
Es dóna una replicació de petits fragments (que no continuen amb la resta del genoma) alhora que es dóna la replicació normal.
Es creu que aquests cromosomes diminuts dobles (solen ser circulars) poden integrarse al cromosoma mitjançant recombinació centre-específica de lloc.
28 ...

Tags:
Comprar Previsualizar