Tema 2: Vectores de clonaje2/4 (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnología del DNA recombinante
Año del apunte 2017
Páginas 12
Fecha de subida 03/10/2017
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Tema 1 de Tecnología del DNA recombinante

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1.
TEMA 2 VECTORES DE CLONAJE TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE.
María Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología.
Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Alternativamente al gradiente de CsCl se puede llevar a cabo una cromatografía de intercambio iónico, que es otro método de purificación del DNA plasmídico. Así, aseguramos que el DNA quede limpio: sin proteínas ni RNA, y, además, asegur la uniformidad topológica del DNA. La única manera de asegurarla incluso hoy en día es en presencia de bromuro de etidio.
Comentario adicional: el origen de replicación pMB1 junto con el gen originario de coli 1 nos da entre 25-35 copias de plásmido por célula. Una vez el cultivo llega poco antes de fase estacionaria se puede poner cloramfenicol, el cual inhibe la síntesis de proteínas. De esta forma las células ya no crecen más, pero continúan sintetizando plásmido. Es una manera de amplificar plásmidos de número de copias moderado hasta tener 200-300 o incluso más copias por célula e inhibir síntesis de proteínas. Si se pone tetraciclina en presencia de pbR322 no hacemos nada, se ha de poner un antibiótico que impida que crezcan las células.
VECTORES PLASMÍDICOS MEJORADOS.
Antes, para saber si una célula es portadora de inserto, es decir, para saber si una colonia original después de la reacción de ligación es portadora o no de vector + inserto hacen falta 48 h.
A mediados de los años 80, Bieira y Messing desarrollaron un método mediante el cual en 24 horas después de la reacción de transformación sabemos si las colonias son portadoras de vector con o sin inserto: produjeron la serie pUC18/19.
1. Clonaje de rutina.
2. El origen de replicación y el gen de resistencia a ampicilina está basado en el pBR322.
3. Durante la producción/clonaje de la serie pUC, les ha aparecido una mutación puntual en el gen rop, el cual es un estimulador negativo en la replicación, es decir, es un inhibidor de la síntesis del plásmido. La mutación no la buscaban y disminuye la eficacia de la proteína: entonces puede haber de 200 a 300 copias.
4. En vez de utilizar un gen de resistencia a antibiótico como marcador para determinar la presencia de inserto, utilizaron una enzima de la cual se disponía de una reacción colorimétrica barata y detectable: lacZ. Es una enzima que hidroliza la lactosa y entonces produce beta galactosidasa. Para caracterizar la presencia de galactosidasa en medio químico se ponen unas moléculas que cambian de color según haya o no.
1 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología 5. Presenta un lugar de clonaje múltiple (MSC)/ polycloning site o polilynker: agrupar el mayor número de dianas de restricción posibles dentro de la secuencia codificante del gen chivato/periodista/reporter (en una única zona del plásmido), habitualmente lacZ, el cual permite detectar la presencia de inserto sin necesidad de réplicas.
Así pues, el MCS está situado en la secuencia codificante de este gen reporter. Es el gen indicador que utilizaremos para indicar la presencia de inserto, así pues, agrupará gran cantidad de dianas de restricción al principio de la zona codificante de lacZ.
LacZ y α-COMPLEMENTACIÓN.
Jacob y Monod definieron en los años 60 el concepto de la alfa complementación.
La betagalactosidasa como monómero son 1000 aa y para que se forme una beta galactosidasa activa hace falta un tetrámero, cuatro monómeros de 1000 aa cada uno.
Describieron dos trozos para separar los monómeros de la betagalactosidasa: alfa y omega, son dos módulos de la enzima.
Son dos fragmentos producidos por dos ORF (cistrones) diferentes, es decir, por genes diferentes.
Dos fragmentos diferentes en posiciones del genoma diferentes. Cada uno de ellos puede producir dos productos génicos diferentes capaces de asociarse entre ellos.
Codificadas cada uno como polipéptidos diferentes en genes diferentes, son capaces de asociarse y producir un monómero activo para formar una betagalactosidasa activa.
En ausencia de alfa, omega no tiene actividad enzimática. La actividad enzimática solo se produce si el fragmento omega está asociado con alfa y viceversa, cada uno de los dos fragmentos por separado no tienen actividad, solo si se asocian.
En el vector se puede poner solo uno de los dos ORF’s que codifican para las dos subunidades.
El plásmido cuanto más pequeño mejor.
Si el plásmido produce alfa y el genoma omega, se juntan en una cepa de E. coli (la cual sirve como huésped) y producen beta galactosidasa activa. Es importante que la cepa de E. Coli debe ser ser laczAM15: una deleción en M15, que es el trozo que codifica para el lacZ de la beta galactosidasa y, de esta forma, sólo fabricamos omega.
2 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Si no tiene deleción siempre producirá beta-galactosidasa y no sabremos si hemos tenido éxito o no.
Si una cepa de E. Coli con una mutación incorpora el plásmido, alfa y omega se encuentran en el citosol, se acoplan y mermiten la actividad beta-galactosidasa: generan colonias azules.
Si el plásmido incorpora el inserto en la zona de clonaje se está destruyendo el péptido alfa y no se forma beta-galactosidasa: generan colonias blancas.
Se realizan dos selecciones al mismo tiempo y en la misma placa (medio + IPTG, inductor del operón lac): 1. Selección con resistencia a ampicilina: sólo las bacterias que contengan el plásmido crecerán.
2. Se introduce X-gal: las bacterias con plásmido sin inserto serán de color azul y las que contengan el inserto de color blanco.
3 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología VECTORES PARA LA TRANSCRIPCIÓN IN VITRO.
Vectores plasmídicos mejorados.
Abajo de la imagen de la izquierda podemos ver la secuencia codificante de lacZ: metionina, ATG y así, codones que codifican para lacZ, el cual corresponde con la zona MCS.
Es decir, el plásmido pGEM dispone de un lugar de clonaje múltiple (muy similar a pUC18/19).
Sobre esta zona, haciendo unas cuantas modificaciones pudieron introducir dianas de restricción que no había dentro del plásmido.
A pesar de introducirlas no se hace nada con estas dianas ya que el puC produce un lacZ alfa que es capaz de complementar con lacZ omega.
Si introducimos un DNA foráneo por la zona del medio en una diana de restricción la secuencia codificante quedará interrumpida y justo en el N terminal.
Flanqueando el MCS del pGEM, hay una secuencia específica que es reconocida por la RNA polimerasa del fago SP6 y otra por la T7. Gracias a esto podemos transcribir en los dos sentidos (hacer las dos cadenas) Si se corta con EcoR1, solo se puede transcribir con RNA pol T7.
Si se corta con Hind3, solo se puede transcribir con RNA pol SP6.
4 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología FAGO LAMBDA. CICLO BIOLÓGICO.
Se trata de un fago atemperado.
La introducción de su DNA dentro de E. Coli se produce de forma muy eficiente.
Actualmente su uso como vector de clonaje ha quedado limitado a la obtención de bancos de cDNA.
Su genoma, relativamente grande, dentro de la cápside se encuentra de forma lineal flanqueado por dos secuencias ss cos (cohesive). Al ser secuencias ss complementarias, una vez entra dentro de E.
Coli recirculariza.
Una vez se forman las uniones por los extremos cos, se inicia la replicación en forma de círculo rodante, produciendo diversas copias (si no fuera así, el sistema de exonucleasas, como RecBCD, de E. Coli, degradaría su genoma.
Dentro de E. Coli tiene dos maneras diferentes en las cuales inyecta su DNA, necesita proteínas receptoras en la pared de la célula huesped: - - Ciclo lítico: se forman muchas copias del fago empaquetados con la forma típica que salen de la bacteria lisándola. En este caso se sintetizan las proteínas necesarias para copiar el DNA y empaquetar.
Ciclo lisogénico: el DNA del fago se recombina con el cromosoma bacteriano de manera que queda insertado, no se expresa ni se copia. De manera que, cada vez que el DNA se replique, también lo hará el genoma del fago.
Este estado es reversible, ya que con una agresión externa o en situaciones de estrés, puede haber una reversión e iniciar el ciclo lítico.
FAGO LAMBDA. GENES Y REGIONES GÉNICAS.
Se puede distinguir una zona central donde se encuentran los genes que dirigieren la recombinación y la regulación de la replicación del DNA. Se llama “stuffer”, no brazo central. La zona de recombinación es esencial para el ciclo lisogénico, pero no lítico. Esta región se llama “att”.
5 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Los brazos (partes más externas) se encuentran genes que codifican proteínas con función estructural: - En el extremo izquierdo: proteínas de la cabeza y de la cola.
En el extremo derecho: proteínas para la lisis.
Tiene un genoma de 48502 pb, con restricciones importantes para que empaquete.
Presenta dianas de restricción, admite deleciones, pero no demasiadas adiciones, ya que si pasa más allá de 52 y pico kb ya no puede empaquetar (el mínimo es de 37 kb). La mayoría de enzimas de restricción normales pueden actuar, entonces son de uso fácil como vectores.
Podemos obtener mucha cantidad de fago lambda en poco espacio. La frecuencia de mutación de lambda es 10^-9 en E. Coli, es decir, en un tubo pequeño ya hay muchos mutantes.
Entonces, como tenemos tantos genomas de forma tan fácil podemos mirar las mutaciones espontáneas.
Se coge un tubo, infectamos sobre E. Coli que porta la enzima EcoR1 y el fago porta la diana de restricción: se linealiza y no se replica. Si el tubo porta algún mutante que esté en alguna diana de la EcoR1, entonces ya no es reconocida por el sistema de restricción.
Originarán calvas los fagos mutantes en las dianas de restricción, el que haya perdido todas las dianas será el que sobreviva y permita incorporar insertos.
La porción central se puede eliminar sin demasiados problemas y el fago continúa empaquetando. Se puede eliminar 3, 4, 5 kb de la parte central, que no es imprescindible para el ciclo lítico. Entonces queda más espacio, y se puede poner más inserto (unos 7 kb como mucho, más que suficiente para bancos de DNA).
Una partícula fáguica es capaz de infectar una E. Coli de forma uy eficaz. La encapsidación del genoma no requiere ningún componente para que encapside, permite que sea in vitro, ya que no hace falta la síntesis concertada de los componentes.
También permite la supervivencia de los fagos portadores de insertos.
6 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología FAGO LAMBDA. TRANSCRIPCIÓN DE LOS DIFERENTES GENES.
Desde los 𝑃𝐿 𝑦 𝑃𝑅 se transcribe N (antiterminador) y cro (antirepresor).
pN permite la transcripción de los mismos promotores hasta pasados N y Cro y se transcriben cII y cIII: proteínas reguladoras.
La transcripción se inicia en el 𝑃𝑅 (entre la Q y la S) y pQ permite continuar y transcribir todos los genes.
7 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología FAGO LAMBDA. CICLO LÍTICO.
Se recirculariza el DNA del fago. Queda continuo con dos direcciones, ya que la expresión de este se realiza a partir de las dos cadenas (síntesis del mRNA en sentido 5’-3’). Se transcriben los genes de la etapa temprana (primerenca): - Proteína N: es un antiterminador.
Invalida la señal de terminación del DNA.
- Proteína Cro: es un antirepresor.
Una vez se comienza a elongar, se comenzarán a sintetizar las proteínas CII y CIII (transcripción temprana retrasada), que son proteínas reguladoras y la proteína pQ (transcripción tardía).
FAGO LAMBDA. CICLO LISOGÉNICO.
El CI es esencial para el establecimiento del ciclo lisogénico. Para que se lleve a cabo, antes de que la proteína Cor se una a los promotores ha de haber iniciado la expresión de la proteína CI (activador del ciclo lisogénico y represor del ciclo lítico).
Para el establecimiento del ciclo lisogénico se utiliza un segundo promotor, diferente al inicial, que se llama 𝑃𝑅𝑀 (promotor de mantenimiento).
8 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología FAGO LAMBDA.
ESTABLECIMIENTO DE LOS CICLOS LÍTICO Y LISOGÉNICO.
Cro: ciclo lítico.
CI: ciclo lisogénico.
FAGO LAMBDA. PRINCIPALES ELEMENTOS REGULADORES.
Proteínas que participan en el ciclo lisogénico: - CI --> represor del ciclo lítico.
CII --> activa la expresión de CI.
CIII --> mantiene y estabiliza la vida media de CII (en mutantes en CIII baja la medida media de CII).
Proteínas que participan en el ciclo lítico: - Cro --> inactiva la expresión del represor CI. Los diferentes promotores y proteínas que se sintetizan (CI, CII, etc) es lo que se llama región de inmunidad. Es decir, una bacteria que ha sido infectada por un fago lambda con una determinada región de inmunidad no puede ser infectada o es inmune a un segundo fago de la misma familia. Pero sí que podría ser infectada por otro fago de otra familia que tuviera una región de inmunidad diferente. Es por eso que se pueden obtener clones en lugares donde se tienen calvas con un DNA recombinante con un inserto y no con dos o más insertos.
9 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología FAGO LAMBDA. RESUMEN CIRCUITOS REGULADORES.
Todo un seguido de genes que sintetiza por ciclo lítico o bien por integración del genoma (ciclo lisogénico). Para que la célula huésped sea capaz de soportar la integración del fago lambda hace falta un estado de crecimiento óptimo de la célula, si el medio es pobre hará ciclo lítico.
En una calva de lambda hay unos 10 o 20 mil partículas fáguicas.
- Cuando E. Coli está creciendo en un medio rico o está en fase exponencial: Niveles bajos de cAMP.
Niveles bajos de CII: no puede activar la síntesis de CI.
Niveles altos de proteasa Hfl: degrada al activador CII.
Niveles altos de Cro.
Ciclo lítico.
10 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología 11 ...

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