TEMA 6 - TRANSCRIPCIÓ (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura Genètica Molecular
Año del apunte 2014
Páginas 6
Fecha de subida 06/12/2014
Descargas 42
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 6  TRANSCRIPCIÓ Microarrays→xip (plàstic, silici, vidre...) que conté una col·lecció de fragments de DNA. Mesura el nivell d’hibridació entre la sonda específica, i la molècula diana i s’indica a través de fluorescència o d’un anàlisi d’imatge que ens indica el nivell d’expressió del gen. Es pot identificar gens amb una expressió diferencial en diferents condicions. (ex.
detectar malalties a través de la comparació dels nivells d’expressió entre cèl·lules sanes i cèl·lules que s’estan desenvolupant certs tipus de malalties).
____________________________________________________________________________________________________________________ • Projecte genoma→es vol la seqüenciació massiva del genoma de diferents organismes.
• Projecte ENCODE→ Enciclopedia of DNA Elements és una recerca d’investigació pública duta a terme per l’Institut de Investigació del Genoma Huma USNational (NHGRI). És un seguiment al projecte del Genoma Humà (investigació genòmica), es volen identificar tots els elements funcionals del genoma humà.
_____________________________________________________________________________________________________________________ • Procariotes→no tenen mb nuclear que separi el material genètic del citoplasma→mRNA accessibles pels ribosomes des del moment en què comencen a ser sintetitzats, ja són madurs. Traducció i transcripció al mateix compartiment cel·lular.
eucariotes→es sintetitzen en l’interior del nucli cel·lular com els hnRNAs i abans de entrar al citoplasma són processats per transformar-se en els mRNAs madurs. Compartiments diferents.
→La transcripció i la traducció són processos simultanis.
• RNA →polímer compost per nucleòtids units per enllaços fosfodiester. RNA és de cadena simple però pot formar estructures secundàries si s’aparellen regions complementàries dins del mateix RNA (estructures en forquilla i bucles (=hairpin-loops) o estructura en tall i bucle (=stem-loop) Aquestes estructures secundàries són molt importants per la funcionalitat dels RNA.
CLASSES DE RNA [recordem; riboenzims: poden tallar part de les seves pròpies seqüències, connectar certes molècules de RNA entre si, replicar-ne d’altres i inclús catalitzar la formació d’enllaços peptídics entre els AA].
Es poden agrupar en dues classes generals.
1. Codifiquen informació necessària per les proteïnes.
Serveix d’intermediari per passar informació de DNA a proteïnes (=mRNA, RNA missatger) 2. No codifiquen informació per cap proteïna, són actius com a RNA (=RNA funcional). Participen en varis passos de la transferència de la informació de →proteïna, DNA processament d’altres RNA i regulació d’aquest i proteïnes.
• eucariotes+procariotes: -RNA de transferència (tRNA)→són molècules responsables de portar l’AA correcte a l’mRNA en el procés de la traducció. Serveixen com enllaç entre la seqüència codificant de nucleòtids de l’mRNA i la seqüència d’AA d’una cadena polipeptidica. Cada tRNA s’uneix a un tipus particular d’AA i ajuda a incorporar-lo a una cadena polipeptidica.
-RNA ribosòmic (rRNA)→aquestes molècules son el component majoritari dels ribosomes, les maquinàries macromoleculars que guien l’assemblatge de la cadena d’AA junt amb l’mRNA i els tRNA.
-RNA missatger (mRNA)→transporta les instruccions de codificació de les cadenes polipeptidiques des del DNA fins el ribosoma. Després d’unir-se a un ribosoma, una molècula d’mRNA especifica la seqüència d’AA de la cadena polipeptidica i proporciona un motlle per unir-los. (RNA premissatgers, una forma extensa abans de sortir del nucli que han de ser modificats per ser madurs).
• eucariotes: -RNA nuclear petit (snRNA)→forma part d’un sistema addicional de processament dels transcrits de RNA en les cells eucariotes. Alguns snRNA s’uneixen a diferents subunitats proteiques per formar el complex ribonucleoproteic de processament que extrau els introns dels mRNA eucariòtics.
-RNA nucleolars petits (snoRNA)→ intervenen en el processament de l’rRNA.
- RNA citoplasmàtic petit (scRNA) -pre-mRNA -microRNA (miRNA) -RNA interferent petit (siRNA)→ajuden a iniciar la degradació o la inhibició de la traducció de les molècules de mRNA.
- RNA associats amb PIwi (piRNA)→interaccionen amb les proteïnes Piwi. Desenvolupament espermatozoides.
TRANSCRIPCIÓ síntesi de l’RNA a través d’una sola cadena de DNA. Primer pas en la transferència de la informació de gen →proteïna és produir una cadena de RNA la seqüència de bases del qual sigui complementaria a la seqüència de bases d’un segment de DNA (motlle), algunes vegades seguits per una modificació de l’RNA, que el prepara pel seu paper específic en la cèl·lula. Té un principi i un final definit. No es necessita encebador.
-transcrit (=còpia del DNA en forma d’RNA) es llegeix el DNA de 3’→5’ però es sintetitza de !Durant la replicació es copien tots els nucleòtids del motlle de DNA però durant la transcripció només petites porcions de la molècula de DNA (gairebé sempre un gen) es transcriuran a mRNA→procés altament selectiu.
es necessita: 1. un motlle de DNA 2. materials en brut (substrats) necessaris per construir una nova molècula d’RNA 3. maquinària de transcripció consistent en les proteïnes necessàries per catalitzar la síntesi de l’RNA.
5’→3’ TRANSCRIPCIÓ CARACTERISTIQUES • cadena transcrita→Només una de les cadenes de DNA es el motlle per la transcripció gènica però varia segons el gen quina de les dues és. La cadena de nucleòtids utilitzada per la transcripció es denomina cadena motlle. L’altre cadena, cadena codificant o cadena no motlle, gairebé mai es transcriu (hi ha excepcions).
Cada gen es transcriu a partior d’una sola cadena però poden transcriure’s a partir de dues. Durant la transcricpió es sintetitza una molècula d’RNA i aquest té les mateixes polaritats i seqüència de bases que la cadena codificant, però l’RNA té U en comptes de T.
• unitat de transcripció→és un tram de DNA que codifica una molècula d’RNA i les seqüències necessàries per a al seva transcripció. Dins de la unitat de transcripció hi ha tres llocs crítics: -promotor: seqüència de DNA que l’aparell de transcripció reconeix i a la que s’uneix. Indica quina de les dues cadenes de DNA ha de ser llegida com a motlle i la direcció de la transcripció. Determina el lloc d’inici de la transcripció. Es sol localitzar a prop del lloc d’inici de la transcripció però no es transcriu a si mateix.
-regió codificant d’RNA: seqüència de nucleòtids de DNA que es copia a una molècula de RNA.
-terminador: seqüència de nucleòtids que senyalen on ha d’acabar la transcripció.
Formen part de la seqüència codificant→acaba la transcripció quan aquests han estat passats a RNA.
-upstream i downstream→direcció de la transcripció i la localització de les seqüències de nucleòtids que envolten a la seqüència codificant de RNA.
Es diu que l’aparell l’aparell de transcripció es mou downstream durant la transcripció→s’uneix al promotor (que es troba upstream del lloc d’inici) i es mou cap al termindaor (que està downstream).
!Quan s’escriuen les seqüències de DNA, només s’escriu una de les dues cadenes.
Per convenció, la seqüència sobre la cadena codificant s’escriu amb l’extrem 5’ a l’esquerra i el 3’ a la dreta. El primer nucleòtid transcrit (=lloc d’inici de la transcripció) es numera amb +1; els nucleòtids que es trobin downstream del lloc d’inici es numeraran amb + i els que es troben upstream amb -.
• substrat→ribonucleòtids trifosfats (rNTP). S’afegeixen a l’extrem 3’ –OH de la molècula creixent d’RNA. Es tallen dos fosfats de l’rNTP i el fosfat restant participa en l’enllaç fosfodiester.
RNAn+rNTP→RNAn+1+PPi →(foto) transcripció de dos gens en direccions oposades.
Les 2 cadenes de DNA es separen localment, una d’elles es fa servir com a motllel Els ribonucleòtids sintetitzats químicament en una altra part de la cell formen parells estables amb les bases complementàries del motlle→RNA polimerasa col·loca cada ribonucleòtid front la seva base complementaria, s’uneix al DNA i es desplaça al llarg d’aquest, lligant els ribonucleòtids alineats per produir una molècula de RNA en creixement.
La doble hèlix de DNA es desenrotlla per davant de l’enzim i es torna a enrotllar quan ja s’ha transcrit, la bombolla de transcripció es tanca per darrere de la polimerasa.
Poden haver-hi trens de RNA polimerasa.
• aparell de transcripció→RNA polimerasa. La seva activitat pot ↑ degut a varies proteïnes accessòries, amb una funció determinada, que s’hi uneixen i l’abandonen al llarg del procés.
ESTRUCTURA DEL GEN Caràcter de l’mRNA • Caràcter monocistrònic→en eucariotes. Un mRNA codifica per un sol polipèptid (gen). Té un sol codó d’inici AUG que és reconegut pels ribosomes per iniciar la traducció.
• Caràcter policistrònic→procariotes i virus. Un mRNA codifica per varis polipèptids. Té varis codons AUG (faran falta varis codons stop per parar-los a tots, a excepció de que estiguin solapats).
ETAPES DE LA TRANSCRIPCIÓ 1. iniciació→l’aparell de transcripció s’ensembla sobre el promotor i comença la síntesi d’RNA.
2. elongació→l’RNA polimerasa es mou al llarg del DNA, el desenrotlla i afegeix nous nucleòtids, un a un, per l’extrem 3’ de la cadena creixent d’RNA.
3. terminació →es recoenix l’extrem de la unitat de transcripció i la separació de la molècula d’RNA del motlle de DNA.
És semblant en eucariotes i procariotes però hi ha certes diferencies.
TRANSCRIPCIÓ EN BACTERIS →els bacteris només tenen un tipus d’RNA polimerasa (gran i multimèrica) que catalitza la síntesi de tots els tipus d’RNA bacterians: mRNA, tRNA i rRNA.
→a l’interior de l’RNA polimerasa de gairebé tots els bacteris hi ha 5 subunitats (=cadenes polipeptidiques individuals) que constitueixen el nucli centre de l’enzim o enzim nucli (core): -2 còpies d’una subunitat α -1 còpia de β -1 còpia de β’ -1 còpia de ω→estabilització de l’enzim.
→factor σ: controla la unió de l’RNA polimerasa al promotor. Senseσ l’RNA polimerasa iniciaria la transcrip ció en un pount a l’atzar al llarg del DNA. Quan σ s’uneix a l’enzim →holoenzim.
nucli Quan s’han sintetitzat els primers nucleòtids s’allibera σ. Molts bacteris tenen ≠ σ que inicien regions promotores ≠.
1. Iniciació: l’aparell de transcripció reconeix el promotor i s’hi uneix, es determina quines seran les parts del motlle de DNA que es transcriuran.
≠ gens es transcriuen a ≠ freqüències i la unió del promotor determina la freqüència de la transcripció del gen en particular. Els promotors també tenen diferents afinitats per l’RNA polimerasa (por variar segons les proteïnes accessòries que tingui en un moment determinat).
Es forma la bombolla de transcripció, es crea els primers enllaços entre els rNTP i l’aparell de transcripció es comença a desplaçar des del promotor.
• promotors bacterians→dins de la seqüència de nucleòtids del promotor hi ha informació essencial per la unitat de transcripció: on començarà a transcriure, quina cadena ha de llegir i en quina direcció s’ha de moure l’RNA polimerasa. Solen estar al costat d’una seqüència que codifica RNA.
- - Característica general: hi ha trams curts de nucleòtids comuns entre molts d’ells. L’espai i la localització d’aquests, en relació al lloc d’inici de la transcripció son semblants→seqüències consens, associades a una funció important.
[la seqüència consens ↑freqüent→seqüència consens -10 o caixa de Pribnow] → 5’ – TATAAT – 3’ Seqüència consens -35 3’ – ATATTA – 5’ la funció d’aquestes seqüències consens en els promotors bacterians es va estudiar introduint mutacions en diferents punts d’aquestes seqüències i de l’efecte que tenien aquests canvis sobre la transcripció ↓velocitat que de transcripció (=down mutations). N’hi ha d’acceleradores (=up mutations) • holoenzim→El factor σ s’associa amb l’enzim nuclear per formar l’holoenzim que s’uneix a les seqüències consens -35 i -10 en el promotor de DNA i forma un complex tancat. Al principi l’holoenzim s’uneix al promotor de manera dèbil però després pateix una modificació estructural que li permet unir-s’hi de manera més estreta i desenrotllar la doble cadena de DNA. El desenrotllament s’inicia dins de la seqüència consens -10 i s’estén downstream.
→element upstream: tercera seqüència consens que participa a l’inici de la transcripció; conté cert nº de parells A-T i es troba entre -40 i -60, també s’hi associen proteïnes modificant-ne la velocitat. No sempre hi és! Síntesi incial de l’RNA→l’RNA polimerasa es posiciona sobre +1, desenrotlla el DNA →motlle de cadena simple. La orientació i la separació espacial de les seqüències consens sobre una cadena de DNA determinen quina cadena serà el motlle de la transcripció i per tant, la seva direcció.
Si les seqüències consens es mouen artificialment upstream o downstream, la localització del punt d’inici de la transcripció canvia de forma corresponent.
L’RNA polimerasa aparella la base d’un ribonucleòtid trifosfat amb la seva base complementària en el lloc d’inici de la cadena motlle de DNA. No es necessita encebador per iniciar la síntesi de l’extrem 5’ de la molècula d’RNA. A l’extrem 5’ el primerribonucleòtid trifosfat no participa en la formació d’un enllaç fosofdiester i conserva els fosfats.
2. Elongació: l’RNA polimerasa→canvi de conformació (=morfològic) no és capaç d’unir-se a les seqüències consens del promotor → pot moure’s downstream→ desenrotllament positiu progressiu del DNA per l’extrem líder (downstream) de la bombolla de transcripció (uneix nucleòtids a la molècula d’RNA d’acord amb la seqüència present al motlle)→enrotllament negatiu del DNA a regió upstream.
-velocitat de síntesi ↓↓que el DNA.
-σ sol ser alliberada despr és de l’in ici transcripció, algunes RNA polimerasa poden retenir el factor durant tota l’elongació.
-l’RNA polimerasa té capacitat proofreading→pot realitzar correccions mentre transcriu, és a dir, retrocedir i eliminar fins a dos nucleòtids de la cadena d’RNA creixent.
-estructures secundàries o seqüències específiques poden provocar que l’RNA polimerasa faci una pausa d’un segon o més→coordinació entre la transcripció i la traducció en bacteris i per la coordinació del processament de l’RNA en eucariotes..
3. Terminació: l’RNA polimerasa transcriu un terminador, no s’atura abruptament, la transcripció acaba una vegada es transcriu el terminador.
Al terminador es requereixen diversos esdeveniments superposats per a que acabi la transcripció: l’RNa polimerasa ha de deixar de sinteritzar RNA, la molècula d’RNA ha de ser alliberada de l’RNA polimerasa, la nova molècula d’RNA s’ha de dissociar completament del DNA i l’RNA polimerasa s’ha de desprendre del motlle de DNA.
• tipus de terminadors -dependents de rho→poden provocar la terminació de la transcripció només en presència d’una rpoteïna auxiliar denominada factor rho.
Tenen seqüències de DNA que produeixen una pausa en la transcripció i d’altres que codifiquen un tram de RNA cap a la direcció 5’ del terminador sense estrucutres secundàries. Aquest RNA desestrcutrat serveix com a lloc d’unió per la proteïna rho que s’uneix a l’RNA i es desplaça en direcció 3’ (segueix a l’RNA polimerasa). Quan l’RNA polimerasa es troba amb el terminador para la seva activitat i rho l’atrapa. La proteïna rho té activitat helicasa, i la fa servir per desenrotllar l’hibrid DNA-RNA en la bombolla de transcripció, determinant el final de la transcripció.
-independents de rho→ no necessiten rho. Tenen repeticions invertides (invertides i complementàries) de manera que es formen una estructura secundaria en forma de forquilla que fa que l’RNA polimerasa s’aturi. La segona repetició invertida en el motlle de DNA ve seguida de 6 nucleòtids d’adenina. La seva transcripció produeix una successió de nucleòtids d’uracil.
!Els aparellaments A-U en direcció 3’ de la forquilla són relativament inestables i poden separa la molècula d’RNA del motlle de DNA →fi síntesi.
TRANSCRIPCIÓ EN EUCARIOTES tipus transcriu localització • cromatina laxa →DNA accessible per la maquinària de transcripció.
polimerasa I rRNA grans nucleol Pre-mRNA, alguns snRNA, snoRNA Nucleoplasma →Acetil transferases→ afegeixen grups acetil polimerasa II als AA que es troben als extrems de les polimerasa III tRNA, rRNA petits i alguns snRNA nucleoplasma histones, el que desestabilitza el polimerasa IV siRNA de plantes nucleosoma→descondensació.
→proteïnes remodeladores de la cromatina poden desplaçar els nucleosomes dels promotors i altres regions importants per la transcripció.
• RNA polimerases→tres tipus diferents, cada una responsable de la transcripció de≠ RNAs. Són grans i multimèriques, tenen més de 12 subunitats, algunes comunes a totes les RNA polimerases. Igual que en bacteris, hi ha proteïnes accessòries que alteren la funció de l’enzim nucli.
• promotor→depèn de si serà reconegut per una RNA polimerasa I, II o III. El reconeixement del promotor està a càrrec de proteïnes accessòries que s’uneixen al promotor i després recluten a un RNA polimerasa específica d’aquest.
• tipus de proteïnes accessòries -factors de transcripció general→Juntament amb RNA polimerasa formen l’aparell de transcripció basal que s’assembla a prop del lloc d’inici i és suficient per iniciar nivells mínims de transcripció.
-proteïnes activadores de la transcripció→s’uneixen a seqüències de DNA especifiques i generen nivells més alts de transcripció perquè estimulen la unió de l’aparell de transcripció basal en el lloc d’inici.
!La RNA polimerasa II és la més important ja que transcriu per proteïnes (premRNA). Aquesta polimerasa necessita dos promotors: 1. Promotor mínim (core promoter)→ es localitza immediatament upstream del gen i és el lloc al que s’hi uneix l’aparell de transcripció basal. Té una o més seqüències consens. La més comú és la caixa TATA, que té la seqüència TATAAA i es troba entre -25 i -30 pb upstream del lloc d’inici.
2. Promotor regulador→es troba immediatament upstream després del promotor mínim. Tenen diverses seqüències consens que poden estar barrejades i aparellades en combinacions diferents. Les proteïnes activadores de la transcripció també regulen la transcripció quan s’uneixen a seqüències distants anomenades intensificadors (=enhancers). El DNA comprès entre l’intensificador i el promotor forma un bucle i, d’aquesta manera, permet la interacció de les proteïnes activadores de la transcripció unides a l’intensificador, amb la maquinaria basal de la transcripció unida al promotor mínim.
3. Promotors de les RNA polimerases I i III→l’RNA polimerasa I i III reconeixen promotors diferents dels que reconeix la II. (ex. promotors dels gens d’rRNA i tRNA petits, transcrits per la III que contenen promotors interns que estan ubicats downstream respecte al lloc d’inici i que en realitat són transcrits dins de l’RNA.
1. Iniciació: Es dóna la unió de la maquinaria de la transcripció (pol II+factors de transcripció=complex gegant) sobre el promotor, aquest comença quan les proteïnes Els promotors dels gens transcrits per l’RNA pol II consisteixen en un promotor mínim i regulatòries s’uneixen al DNA proper al un regulatiu que conte seqüències consens. No totes les seqüències consens promotor i modifiquen l’estructura de la il·lustrades en la imatge es troben en tots els promotors.
cromatina perquè la transcripció es pugui donar. També recluten l’aparell transcripcional basal al promotor mínim.
• aparell de transcripció basal→format per una RNA polimerasa, una sèrie de factors de transcripció i un complex de proteïnes conegut com mediador. Els factors de transcripció inclouen: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF i TFIIH; on TFII significa factor de transcripció per a la RNA polimerasa II i les lletres finals designen el factor individual.
→L’RNA polimerasa i els FT s’acoblen al promotor mínim i formen un complex de preiniciació que és anàleg al complex tancat vist en l’inici dels bacteris [en la transcripció bacteriana, factorσ reconeixia i s’unia a la seq üència del promotor. En eucariotes la funció de σ és reemplaçada pels FT generals.] • TFIID s’ha d’unir a la caixa TATA per iniciar la transcripció sobre el DNA motlle.
TFIID→format per 9 polipèptids, un d’ells és la proteïna d’unió a la caixa TATA, que reconeix aquesta i s’hi uneix. Aquesta proteïna s’uneix al solc menor i es col·loca sobre el DNA com una cadira, d’aquesta manera el corba i el desenrotlla de manera parcial.
-altres FT s’uneixen a seqüències consens addicionals en el promotor mínim i a l’RNA polimerasa, posicionant-la sobre el lloc d’inici de la transcripció.
• després de que l’RNA polimerasa i els FT s’hagin acoblat sobre el promotor mínim, es donen canvis conformacionals tant en el DNA com en la polimerasa. Aquest canvis indueixen a la separació dels 11 a 15pb que envolten el lloc d’inici de la transcripció, produeixen DNA de simple cadena que servirà com a motlle per la transcripció. Aquest es posiciona dins del lloc actiu de l’RNA polimerasa i crea una estructura anomenada complex obert. La síntesi de l’RNA comença mentre grups fosfat són escindits de els nucleòtids trifosfat.
foto del power, diapo 40: 1. TDFIID s’uneix a TATA en el promotor mínim 2.FT i RNA pol II s’uneixen al promotor mínim 3.Les proteïnes activadores de la transcripció s’uneixen a seqüències dels intensificadors 4.el DNA forma un bucle que permet que les proteïnes unides a l’intensificador interactuïn amb l’aparell transcripcional basal 5.les proteïnes activadores de la transcripció s’uneixen a les seqüències del promotor regulador i interactuen amb l’aparell de transcripció basal a través del mediador.
2. Elongació: l’RNA pol abandona el promotor i comença l’etapa d’elongació. Varis dels FT son deixats enrere en el promotor i això serveix per reiniciar ràpidament un altre esdeveniment de transcripció amb un altre enzim RNA pol. L’RNA pol manté oberta la bombolla de transcripció. La doble hèlix ingressa en una “hendidura“ de la polimerasa i és atrapada per extensions similars a mandíbules que té l’enzim. Les dues cadenes del DNA es desenrotllen i els nucleòtids d’RNA complementaris de la cadena motlle s’agreguen al l’extrem 3’ de la molècula de RNA. A mesura que travessa la pol, l’híbrid DNA-RNA xoca contra una paret d’AA i gira gairebé en angle recte; aquest gir col·loca l’extrem de l’híbrid en el lloc actiu de la pol i s’agreguen nous nucleòtids. L’RNA recent sintetitzat es separa del DNA i travessa una altre ranura abans de sortir de la polimerasa.
3. terminació: les tres polimerases tenen diferents mecanismes de terminació.
• pol I→necessita un factor de terminació, com rho. El factor de terminació s’uneix a una seqüència de DNA que es troba downstream del lloc de terminació.
• pol III→es transcriu una seqüència terminadora que produeix una successió de nucleòtids de uracil en la molècula d’RNA recent transcrita, similar als terminadors independents de rho, però no es necessita una estructura en forma de forquilla que precedeixi la successió de U.
• pol II→no està senyalitzada per cap seqüència especifica. LA transcripció per l’RNA pol II continua molt més enllà de la seqüència codificant necessària per produir l’mRNA. L’extrem 3’ del pre-mRNA es talla per un lloc específic indicat per una seqüència consens mentre que la transcripció continua en l’extrem 3’ de la molècula. Del tall del pre-mRNA en resulten dues parts: 1. mRNA que codificarà per la proteïna 2. RNA amb extrem 5’ penjant de l’RNA polimerasa. L’enzim Rat1 és una exonucleasa 5’→3’, està localitzat a l’RNA polimerasa, “mossegant” el l?RNA, quan aquest arriba a la amquinària transcripcional s’acaba la transcripció. (similar a dependents de rho però degradant RNA).
...