05.2. Metodologies útils a la fase de cribatge (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 4º curso
Asignatura Toxicologia
Año del apunte 2016
Páginas 8
Fecha de subida 28/04/2016
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Jon_Snow 113 5.2 METODOLOGIES ÚTILS A LA FASE DE CRIBRATGE El cribaje dependerá de lo que queramos hacer, no es lo mismo conocer la molécula y intentar mejorarlo que tener un principio del que no tenemos ni idea de su toxicidad. En la zona amarilla discriminamos todos los candidatos y nos quedamos uno, eso lo hacemos con diferentes niveles de screening. Tenemos que escoger técnicas rápidas, automatizadas y baratas, como las QSAR, donde comparamos estructuras con bases de datos y hacemos predicciones de las relaciones entre la toxicidad y su estructura (pq las moléculas con estructura parecida tienden a tener toxicidad parecida). Las tec Una vez reducimos el nº de moléculas empezamos los test in vivo, donde se determina la mutagénesis, dosis letal 50, teratogénia (siempre que nuestro candidato sea una mujer embarazada o en edad fértil). Al final descartaremos todas las moléculas y nos quedará una, que será la que evaluaremos. Además de los testde toxicidad pasaremos tb test de toxicidad en ambiente y de eficacia. Una vez está resuelto psamos a trabajar con humanos en diferentes fases: Jon_Snow - 114 Fase I: test con voluntarios sanos, es una fase muy reducida a nivel poblacional. Nos da una idea preliminar sobre la seguridad y la eficacia. Son estudios ciegos (por ejemplo 3 grupos, dos con diferentes dosis y un placebo). Nos orientara sobre la pauta de administración más apropiada. - Fase II: voluntarios enfermos, relacionado con la enfermedad que queremos tratar. Adquirimos más información, vemos la eficacia en humanos. Conseguimos relación dosis respuesta y ajustamos la dosis terapéutica. Son ensayos controlados y ciegos. - Fase III: se evalúa la seguridad y eficacia, en una muestra representativa de la sociedad escogida al azar (sanos??). Si supera las tres fases se lanza al mercado, hay una fase de farmacovigiláncia para detectar efectos adversos que no hemos podido detectar. Los médicos reportaran todos los efectos adversos que puedan estar relacionados con el medicamento y las autoridades sanitarias decidirán que hacer. SCREENING Los objetivos son proporcionar criterios para encontrar candidatos con posibilidades y tener un perfil toxicológico aproximado. Se usan preferentemente ensayos in vitro (pq son baratos y efectivo). Algunos ensayos carecen de normativa y no se necesitan BPL, pero como si seguimos adelante vamos a necesitar BPL pues es mejor si lo aplicamos desde el principio. Este estudio tendría que cubrir información toxicológica critica y proporcionar información para plantear los ensayos in vitro y in vitro. QUE EVALUAMOS EN UN SCREENING? Jon_Snow 115 NIVELES DE UN SCREENING A medida que vamos avanzando en los niveles cada vez iremos eliminando candidatos. Jon_Snow 116 EJEMPLOS DE TEST DE SCREENING TEST DE CITOTOXICIDAD En una placa de 96 pozos colocamos células del tipo que queremos, mientras sea representativo (si es de aplicación tópica, fibroblastos). Se siembran las células y aplicamos diferentes concentraciones (gradiente de dosis) en el medio de cultivo, dejando filas sin nada, que serán el control. Dejamos crecer 24-48h. Este test nos deja ver si el fármaco mata las células, o bien si el fármaco inhibe la reproducción. El gradiente de las células entre el nº de células control y el nº de células + fármaco nos podrá ayudar a establecer una dosis a la qual se mueren el 50% de las células. Aplicamos una substancia, cuanto más azul este nuestro pozo más células vivas hay, por lo que tenemos una relación entre colores y el nº de células vivas. Los controles serán la viabilidad 100%, y a partir de allí extrapolaremos los demás. Es un ensayo automatizable del que obtenemos una curva dosis respuesta. Permite discriminar las que produzcan más toxicidad. ENSAYOS IN VITRO Una línea celular in vitro no tiene capacidad de metabolizar, no tiene los enzimas necesarios, por lo que si hacemos una citotoxicidad con algunos tóxicos no saldrán tóxicos. Para solucionarlo hacemos una metabolización in vitro à fracción microsomal S9, lo que se añade a las líneas celulares para que metabolicen). Lo obteneos a partir de una rata a la que añadimos aroclor, para que entre en inducción de todos los enzimas, extraemos su hígado y aislamos S9 (contendrá la mayoría de enzimas necesarios). Haremos los ensayos con S9 y sin S9 TEST DE MICRONUCLEOS Se buscan lesiones en el cromosoma. Tenemos una línea celular que se esta reproduciendo y paramos la mitosis con citochalacina B, y añadimos nuestro toxico, que dejaremos un tiempo. Jon_Snow 117 Después de un tiempo en contacto con el toxico añadimos un mitogeno, la fitohemaglutinina, para que se acelere la mitosis. Si el toxico ha producido roturas en el cromosoma, el trozo dañado quedará apartado y tendrá apariencia de micronúcleo. El % de micronucleos que se forman en presencia de un toxico será representativo de su toxicidad. TEST MUTATOX Se usan bacterias gram -, que en condiciones normales no tiene capacidad bioluminiscente, pero tiene el gen que codifica. Si esta expuesta a un toxico y afecta a su DNA dará una respuesta, que se llama respuesta SOS. Codificara para nuevos genes, entre los cuales esta el de la luminiscencia. Estableceremos una relación entre el grado de luminiscencia y la toxicidad. TERATOGÉNIA IN VITRO Por un lado hacemos una citotoxicidad en células 3T3 (fibroblastos de ratón), esto nos dará la dosis letal 50 en células diferenciadas. A parte, haremos lo mismo con células D3 (células madre no diferenciadas), con lo que obtendremos la dosis letal 50 en células madre. Tratamos los datos como dos valores independientes, normalmente las células madre son más sensibles, pero no siempre. Además necesitamos saber cuanto inhibe la diferenciación nuestro producto. Las células D3 se cultiva con un inhibidor de la diferenciación (LIF). Se cultivan mediante el método gota pendiente, se les da la vuelta a las células y se formará un menisco. La célula se irá a la parte inferior, allí crecerá pero no se diferenciara pq tiene LIF. Estas células forman un disco celular, aislamos este disco en placas de cultivo de 24 pozos, allí no le aplicamos LIF y haremos un gradiente de concentración con el toxico. Al día 10 de haber empezado veremos si las células se han diferenciado o no. A las células les añadimos factores de crecimiento para que se diferencien en células de miocardio. Si el toxico afecta a la diferenciación las células no se van a diferenciar a miocardio, en cambio las controles sí. Jon_Snow 118 Las podemos diferenciar pq las células de miocardio se contraen, por lo que se puede ver fácilmente con el microscopio o sin. Intentaremos encontrar una relación dosis respuesta en la diferenciación. Con esto encontraremos una concentración que inhibe la diferenciación en el 50% de los casos. Ahora tenemos 3 datos diferentes, y así clasificaremos las moléculas siguiendo un algoritmo. EMBRIOTOXICIDAD EN PEZ CEBRA. Son pequeños, fáciles de mantener, se desarrollan muy rápido y se necesitan muy pocas concentraciones de producto. Aplicamos el fármaco encima de una placa con embriones de pez cebra, y después de 24-48h observamos si el desarrollo del animal se ha producido correctamente. Este sistema permite la detección de patrones de expresión. Por ejemplo, los embriones cuanto menos se mueven más intoxicados están. Aplicamos el toxico y grabamos en video la placa, por lo que hay software que nos registran el movimiento por filas, y podemos comparar. TOXICOGENÓMICA Todo efecto toxico implica un cambio en el patrón de expresión de algún conjunto de genes. Formamos una placa de microarrays con cDNA, y formamos otra placa con cDNA de un animal que ha recibido el fármaco. Comparamos los dos patrones de expresión. Si la rata es sana tendremos una expresión génica normal, la rata tratada tendrá un patrón de expresión génica diferente (como pasaba en la respuesta SOS de la bacteria). Comparando los patrones podremos ver qué genes están implicados en los mecanismos de toxicidad. TOXICITAT AGUDA IN VIVO Els assaigs de Toxicitat Aguda in vivo es solen fer durant la fase de cribatge per tal de descartar productes massa tòxics. De fet, és un assaig que està Jon_Snow 119 normalitzat (formaran part del dossier toxicològic pel registre). La toxicitat aguda és produïda per una dosi única, o per via respiratòria s’inclou com a toxicitat aguda les dosis repetides en un període de temps inferior a 24h. Cal no confondre la toxicitat aguda amb la Dosi Letal 50. DL50: La Dosi Letal 50: és la dosi única estimada pel càlcul estadístic de la que es pot esperar que produeixi la mort en el 50 % dels animals als que s’ha administrat. Actualment no s’utilitza ja que: NO és un valor unívoc (com, per exemple, el pes específic) És un concepte estrictament estadístic. El càlcul “exacte” requereix un elevat nombre d’animals, que solament és necessari per productes extremadament tòxics DL50 NO es equivalent a toxicitat aguda, ja que no estudia o obté: • els efectes no letals • la reversibilitat • els òrgans diana • la informació necessària per les següents fases Hi ha diversos mètodes per estudiar la toxicitat aguda, tots ells intenten disminuir al màxim la utilització d’animals: Fixed Dose Methode 5animals per grup. Dosis de 5, 50, 500, 2000mg/kg Es busca una dosi discriminant: no letal, no dolorosa, no estressant, evidentment tòxica per la clasificació de les substàncies Test Límit: 2000 mg/kg o 5000 mg/kg Acute oral Toxicity – Acute Toxic Class Method Es comença amb una dosi i es va augmentant fins que s’han mort tots els animals. 3 animals / sexe / grup es comença per un nivell: 25, 200, 2000 mg/kg Segons el resultat es segueix per amunt o per avall Test Límit: 2000 mg/kg o 5000 mg/kg Up and down 1 sol animal, 1 dosi arbitraria (just per sota de DL50 estimada), si no es coneix: 175 mg/kg Si mor, dosi més baixa; si no, dosis més alta Factor 3,2 Acabar si tres animals successius donen resultats en el mateix sentit (llistat de criteris ala guideline) Jon_Snow 120 Test Límit: 2000 mg/kg o 5000 mg/kg ...