Tema 2 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Biotecnología - 1º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 6
Fecha de subida 21/04/2016
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Biología Molecular Héctor Escribano Tema 2 Estructura del DNA El DNA y el RNA están formados por nucleótidos. Estos nucleótidos están formados por azucares y bases nitrogenadas, a su vez unidos por grupos fosfato. Las bases nitrogenadas se clasifican en dos grupos, Purinas: Guanina y Adenina (de dos anillos) y la Pirimidínas: Citosina y Timina (de un solo anillo).
Mientras que la Adenina, Guanina y Citosina forman parte del DNA y RNA indistintamente, el Uracilo se encuentra solo en moléculas de RNA y la Timina se supone que solo se encuentra en DNA. Aun así, se han encontrado organismos que tienen RNA y llevan Timina. Aquello que diferencia el DNA de RNA no es la base nitrogenada, U o T; sino el tipo de azúcar, Desoxirribosa en DNA y Ribosa en RNA.
Los nucleótidos están unidos entre sí por enlaces fosfodiéster, al estar unidos por grupos fosfato. La molécula de DNA tiene una cierta polaridad, marcada por el tipo de enlace con el fosfato. Siempre se une el carbono 5 con el fosfato y el fosfato con el carbono 3. Por tanto hablamos de cadena 3'-5' o de 5'3'.
Las bases nitrogenadas, cuando el DNA es de doble cadena, se encuentran apareadas. La Adenina aparea con Timina y Citosina con Guabina. Por lo que aparear una Adenina con Citosina no tendría mucho sentido. Este apareamiento se da por enlaces no covalentes, puentes de hidrogeno entre las bases nitrogenadas que unen los hidrógenos directamente unidos a nitrógeno con oxígenos o nitrógenos de la otra base. Aunque pueda parecer que los otros apareamientos también son posibles sobre el papel, en la práctica se crean densidades de carga que se repelen o los átomos que habrían de formar el puente están demasiado separados. Dos Pirimidínas no podrían aparear nunca debido a que al ser anillos simples, las interacciones no son suficientemente fuertes para unirlas, no llegan.
La doble hélice de DNA está formada por dos cadenas polinucleotídicas orientadas anti paralelamente.
De arriba a abajo, una va 3'-5' y la otra 5'-3'. Si las cadenas fueran paralelas los grupos no encajarían bien, por eso son con polaridades opuestas. La hélice de DNA es muy larga pero muy delgada a la vez.
Entre cada nucleótido hay una distancia de 3,4 Amstrong. Cada vuelta de hélice son 34 Amstrong o 10,5 nucleótidos. Las bases no se unen de forma simétrica, es decir, no forman ángulos de 180 grados perfectos; sino que tienen una desviación y dejan un Angulo de 120 grados. Este hecho provoca que uno de los surcos de la hélice sea más ancho que el otro, por lo que les damos el nombre de surco mayor o surco menor. Entre las bases de un nivel y las de otro también existen interacciones hidrófobas, manteniendo las bases pegadas las unas a las otras.
Cuando una proteína debe interaccionar con el DNA sabe por qué lado lo hace, debido a que en el surco menor sobresalen 3 cosas y en el surco mayor 4. Me explico. En el surco menor, en el caso de Timina y Adenina tendríamos un Aceptor de enlaces de hidrogeno (N), un hidrogeno no polar y otro Aceptor de enlaces de hidrogeno (O), por lo que tenemos la secuencia AHA (Aceptor-Hidrogeno-Aceptor). En el caso de Citosina y Guanina, tendríamos ADA, Aceptor-Donador de enlaces de Hidrogeno-Aceptor. Por lo que la proteína puede reconocer si esta interactuando con AT o con GC. Además por el surco mayor ocurre exactamente lo mismo, pero con 4 cosas que sobresalen. En el caso de Timina y Adenina tendríamos la secuencia MADA o ADAM (Aceptor-Donador-Aceptor-Metilo), según si la Adenina está a la derecha o a Biología Molecular Héctor Escribano Tema 2 la izquierda, respectivamente. En el caso de Citosina Guanina encontraríamos la secuencia AADH o HDAA, según la disposición a derecha o a izquierda de la Citosina.
De esta forma todas las proteínas que interaccionan con el DNA pueden elegir si lo hacen por el surco mayor o menos y saber con qué par de bases están tratando. Se trata de una codificación, así las proteínas que deban interaccionar solo con un tipo de bases, tendrán sitios de unión para esos grupos en esa determinada secuencia. De esta manera no hace falta abrir la cadena para saber que hay dentro.
La mayoría de proteínas interaccionan por el surco mayor porque hay más espacio y además la secuencia de reconocimiento es más específica que la del surco menor. Ya que AADH|HDAA siempre será más específico que ADA|ADA.
El DNA vs RNA El RNA usa bloques de ATP, GTP, CTP y UTP; mientras que el DNA utiliza dATP (deoxiATP), dCTP, dGTP y dTTP. El RNA es generalmente monocatenario debido a que proviene de la transcripción de una de las cadenas de DNA, la cadena complementaria no se suele sintetizar. El DNA en cambio suele ser bicatenario. El DNA tiene como función almacenar la información genética y transmitirla lo más fielmente posible. Y ésta no es la función del RNA. El RNA tiene distintas funciones adaptadores, estructurales, reguladoras, sintéticas, enzimáticas o mensajeras.
Las estructuras secundarias del RNA Aunque el RNA es monocatenario también puede formar doble hélices en algunas regiones con apareamiento de bases intramoleculares. Las características de la doble hélice del RNA son diferentes de las de DNA. Los RNA tienen longitudes bastante diferentes, el rango va desde los 20 nts hasta los varios miles de ellos. Son mayoritariamente monocatenarios pero también pueden adoptar estructuras complejas como cruces, horquillas, lazos internos, protuberancias u otras uniones que confieren al RNA una forma “peculiar”. Estas “formas-2 vienen determinadas por los apareamientos de G-C, U-A y G-U.
Apareamientos inusuales en el RNA En el RNA se pueden dar apareamientos de bases poco ordinarios, como por ejemplo el G-U, en el que se forman dos puentes de hidrogeno o el Trinucleótido de U-A-U, en el que la Adenina ocupa la posición central y los dos uracilos, a cada lado formando dos puentes de hidrogeno cada uno. Estos apareamientos poco normales son los que permiten las estructuras secundarias complejas y raras del RNA.
Existen muchas modificaciones en el RNA, la más común es la metilación de la Adenina en el Nitrogeno 6 (N6-Methyladenosine) o la pseudouridina. También podemos encontrar algunos nucleótidos de Timina que se han añadido después de la formación de la molécula.
Biología Molecular Héctor Escribano Tema 2 Las estructuras terciarias del RNA El RNA adopta estructuras terciarias bastante complejas y diversas; parecidas a las subunidades proteicas.
Conceptos básicos sobre nucleasas Las nucleasas son enzimas cuya función es la de romper los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos.
Las nucleasas son casi exclusivas de las bacterias procariotas como mecanismo de defensa ante los virus.
Hay nucleasas que expresan especificidad ante solo DNA, solo RNA o DNA solo si es bicatenario o que no son nada específicas y lo cortan todo. Otras solo actúan cuando una de las cadenas es DNA y la otra RNA.
Dentro de las nucleasas también podemos clasificarlas en dos grupos, dependiendo de si pueden romper los enlaces fosfodiéster en cualquier punto (endonucleasas) y aquellas que solo pueden romper el enlace del último nucleótido (exonucleasas) que solo acceden en los extremos. Además, también se diferencian por el sentido en que eliminan los nucleótidos, si en el sentido 3’-5’ o en el 5’-3’.
Además tenemos endonucleasas de restricción que en lugar de degradar DNA solo lo cortan por secuencias específicas, solo las corta y el resto queda intacto.
Por ejemplo el EcoR1. Esta enzima proviene de la E.Coli, de las cepas R y esta comercializada. La enzima corta la secuencia GAATTC dejando extremos cohesivos que se podrán volver a unir. Las bases se separan por los enlaces débiles de hidrogeno. La secuencia se corta así: 5’ - G AATTC – 3’ 3’ - CTTAA G – 5’ El extremo que quedaría en cada lado, monocatenario y acabado en 5’ se llamaría 5´overhang. Los overhangs permiten que las secuencias se encuentren y se vuelvan a aparear.
Otra enzima es la Sma 1, que corta la secuencia CCCGGG por la mitad, dejando todas las C a un lado y todas las G en otro. En este caso no se forma ningún overhang ya que las dos cadenas se cortan por el mismo sitio, y ninguna monocadena es más larga que la otra. En cambio la enzima Apa 1 corta la misma secuencia pero lo hace así: 5’ – GGGCC C – 3’ 3’ – C CCGGG – 5’ Por lo que quedan 3’ overhangs que no tienen nada que ver con la secuencia que aparece en Sma 1 y que por tanto no son compatibles.
Otro ejemplo de enzima lo tenemos e la Dpn1, que reconoce secuencias de 4 nucleótidos GATC y que lo parte por la mitad de forma simétrica, sin dejar ningún overhang. Pero necesita que ambas Adeninas estén metiladas. Si las Adeninas no están metiladas no puede cortar la secuencia.
Biología Molecular Héctor Escribano Tema 2 Desnaturalización y renaturalización de ácidos nucleicos Los choques de las cadenas de DNA con otras moléculas provocan la rotura de los enlaces de hidrogeno entre las bases nitrogenadas, pero como hay tanta y tan juntas, la fuerza de las otras mantiene el DNA junto y los puentes de hidrogeno que se han roto se vuelven a formar. Pero al aumentar la temperatura lo suficiente, las cadenas se podrían separar. Si se bajase la temperatura poco a poco las dos cadenas se volverían a unir y al final nos quedaría la molécula inicial en doble hélice. Cuando se unen no necesariamente se unen a la misma cadena a la que estaban antes unidas; sino que si hemos puestos nuevas cadenas complementarias en el medio, se pueden unir a las nuevas. Este hecho nos permite añadir un marcador a la cadena que agregamos y así obtener información de cuantas moléculas de DNA hay. La desnaturalización consiste en separar las cadenas y no depende en absoluto de la concentración de éstas, solo de la temperatura. En cambio, la renaturalización sí que depende de la concentración ya que si en un tubo de ensayo solo tenemos dos cadenas que sean complementarias tardarán mucho en encontrarse, o por lo menos más que si tenemos 1000 del mismo tipo. Se puede medir la cantidad de DNA que hay en una muestra al medir la absorbancia de la misma. Las cadenas dobles, en hélice de DNA absorben mucha menos luz que aquellas monocatenarias, cuanta más temperatura, más desnaturalización y más absorbancia. El grafico que se obtiene no es lineal, sino que pasa de un estadio a otro en el punto en que el DNA se desnaturaliza, que suele ser una temperatura determinada. En DNA de doble cadena se absorbe menos luz debido a que son las bases nitrogenadas las que la absorben y éstas están escondidas, por eso en monocatenario se absorbe más. Y si se mide la absorbancia de nucleótidos sueltos, la Absorbancia es aún mayor. El valor de Abs será extrapolable a concentración solo si tenemos DNA puro y no degradado.
El grafico del que he hablado se trata de una curva sigmoidal propia de procesos cooperativos. Cuando unos nucleótidos se han despegado, se produce un efecto dominó que provoca que e resto de bases nitrogenadas se despeguen. En el proceso inverso también pasa lo mismo, ya que a la que se unen unos pocos, el resto los sigue inmediatamente, es un efecto cremallera.
Tm es la temperatura a la que el DNA se desnaturaliza, pero no es igual para todo el DNA, ya que esta depende de las interacciones hidrofóbicas. Tm también depende de la longitud de la cadena y de la fuerza iónica (concentración de la sal). Las interacciones de G-C aportan mayor estabilidad a la molécula de DNA que las interacciones A-T ya que GC tienen más puentes de hidrogeno. De la misma manera si subimos la concentración de la sal en la que disolvemos el DNA, también subimos Tm. Los iones con carga positiva tienden a interaccionar con los grupos fosfato y estabilizan la molécula de DNA. Si no hay iones, las cargas negativas tienden a repelerse y separarse.
Biología Molecular Héctor Escribano Tema 2 Técnicas de iluminacion. El Dot-Blot Blot significa transferencia, transferencia de puntos. En el Dot-Blot se utilizan gotitas de DNA que se fijan en una membrana con luz UV y posteriormente se las trata con una solución alcalina de pH alto para que las cadenas se separen. Luego se mete la membrana, enrollada en una especie de tubo con una disolución de DNA cuya secuencia conocemos, colocando la membrana de forma que la solución pueda llegar a todas las partes de esta membrana. Esta nueva disolución que añadimos al tubo contiene secuencias de DNA que nosotros conocemos y que llevan un marcador asociado. Por lo que al “mojar” la membrana con esta disolución, permitimos que nuestras secuencias interactúen con las secuencias complementarias del DNA que queremos analizar y que hemos fijado a la membrana por UV. Como las cadenas a estudiar están separadas, se producirá emparejamiento. Para que la sonda detecte a su cadena complementaria hace falta calentar la muestra. Entonces se lava para que lo que no esté pegado se vaya y no interfiera. Luego podemos observar, mediante la técnica que hayamos usado como marcador, aquellos fragmentos de DNA que tenían la secuencia complementaria a la de nuestra sonda.
El método puede ir desde la fluorescencia a la utilización de metales pesados para observarlos en radiografías. Donde quede más oscuro será que hay más sonda y por tanto más secuencia de la que queríamos estudiar.
Existen diferentes maneras de hacer un dot-blot. Podemos poner el RNA o el DNA primero en la membrana y luego en la dilución poner la sonda con el marcaje o poner sondas diferentes y sin marcar en la membrana y luego utilizar cachos de DNA marcados en la disolución y cada DNA se irá con su correspondiente. El empleo de una técnica u otra dependerá de las circunstancias del experimento y de las necesidades.
Nos podemos encontrar con que la sonda no solo reconozca el gen que nosotros queramos sino que en la muestra también haya esa misma secuencia que codifique para otra cosa, con lo que los resultados no serían los que buscamos.
Macro-Array El Macro-Array s un dot-blot a “lo bestia” con muchas más muestras. Se utiliza un soporte no poroso, como por ejemplo cristal, nunca membrana porque si no la muestra se expandiría. El hecho de que el material no sea poroso nos permite poner una mayor cantidad de gotitas en un menor espacio. El Macro-Array es un dot-blot del segundo tipo, en el que se utilizan sondas no marcadas fijadas en el soporte y DNA o RNA marcado en la solución con la que se “baña” el soporte.
La técnica del Dot-Blot se puede utilizar para detectar biomoléculas, no solo DNA o RNA; siempre que se utilicen marcadores adecuados. Siempre lo que se fija en la muestra no debe estar marcado nunca, ya que si no nos saldría que todo está marcado al máximo. Y lo que lleve la solución con la que se baña el soporte ha de estar marcado.
Biología Molecular Héctor Escribano Tema 2 Técnicas del Sothern y Northern Blot En el Southern y el Northern se utilizan geles de Agarosa en los que se harán correr diferentes moléculas para clasificarlas por tamaños. Después, las moléculas se transfieren a membranas (normalmente de nitrocelulosa o algún compuesto similar) y finalmente se utilizaran anticuerpos o secuencias de DNA complementarias y marcadas para teñir aquellas secuencias o moléculas que queremos. El Southern y El Northern se refieren al tratamiento de DNA y RNA respectivamente, ya ambos tienen el mismo proceso.
Primero se hace el gel, dependiendo de la concentración de Agarosa conseguiremos un gel con los poros más grandes o un gel con los poros más pequeños. La agarosa hace poros irregulares, de diferentes tamaños. Si el poro es demasiado pequeño, puede que la molécula ni lo pueda atravesar, si es demasiado grande puede que lo tenga demasiado fácil y corra demasiado rápido. Si queremos separar secuencias que se diferencian en longitud unos 200/300 nts utilizaremos una concentración del 1’5%. Si en cambio queremos diferenciar moléculas que difieren en 1000/2000/3000/4000nts podremos hacer servir una concentración menor, del 0’8%. Si lo que queremos es diferenciar entre cadenas que difieren en solo 2-3 nts, no utilizaremos un gel de agarosa sino de Acrilamida. La acrilamida tiene la propiedad de formar poros regulares y pequeños. Hoy en día no se utilizan geles de Acrilamida, sino que se utilizan capilares de Acrilamida por los que se hacen pasar las moléculas y se pueden obtener y separar según con la rapidez que viajan a través del capilar.
Para diferenciar entre los de una longitud y los de otra con una electroforesis, los fosfatos hacen que se mueva la molécula hacia el polo positivo. Los más pesados y más largos tienen más cargas negativas, peo también son más lentos debido a su tamaño. Por eso, los fragmentos pequeños se desplazan más que los grandes. Para poder visualizarlas en el gel de Agarosa o Acrilamida hace falta teñirlas con Bromuro de Etidio, que las vuelve visibles y fluorescentes bajo la luz UV.
El RNA, no obstante no corre según su longitud o su tamaño, son según su forma. No es lo mismo un RNA lineal, que otro circular que otro que forma estructuras secundarias con horquillas y todo, aunque los tres tengan la misma cantidad de nucleótidos. Un RNA lineal corre más que uno circular relajado, uno circular con superenrrollamientos corre más que uno relajado. Por eso hay que correrlos en condiciones desnaturalizantes, con la adición de Formaldehido se mantiene el RNA desnaturalizado.
Cuando en el gel, en lugar de aparecer una sola banda, aparece una sombra alargada que contiene todos los fragmentos, no podemos diferenciar cual es el nuestro. Por eso, se ponen gel de Agarosa y una membrana tocando, y se hace pasar una solución tampón a través de ellos. Para que la solución entre por el gel, arrastre el DNA o RNA y lo pegue en la membrana. Después de pegarlo en la membrana se puede bañar la membrana en una solución con sondas de secuencia complementaria a la de la secuencia que estamos estudiando y así obtenemos que segmento es el que realmente pertenece a la secuencia que habíamos seleccionado, dejándonos con una sola línea de toda la mancha.
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