TEMA 5. REPLICACIÓ DEL MATERIAL GENÈTIC I RECOMBINACIÓ (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular d'Eucariotes
Año del apunte 2014
Páginas 29
Fecha de subida 22/10/2014
Descargas 32

Vista previa del texto

TEMA 5: REPLICACIÓ DEL MATERIAL GENÈTIC I RECOMBINACIÓ MODELS DE REPLICACIÓ DEL DNA Abans no se sabia si la replicació era conservativa, semiconservativa o dispersiva. Gràcies als experiments de Meselson i Stahl es va poder demostrar que la replicació semiconservativa era la que fan servir les cèl·lules.
Meselson i Stahl es van basar en que el nitrogen és un àtom molt important en el DNA, i que aquest té dos isòtops: 14N i 15N. L’isòtop més freqüent és el 14N, i el més pesat el 15N.
Per dur a terme l’experiment, van fer un cultiu d’E. coli en un medi amb 15N. Després en van extreure una mostra de DNA i la van centrifugar en un gradient de clorur de cesi, i les molècules de DNA es van situar en el punt on la seva densitat era igual a la del medi. Es va veure que la densitat d’aquest DNA era més alta que la de mostres de DNA de cultius amb 14N.
Posteriorment, es van agafar bacteris que havien crescut en el medi amb 15N i es van posar en un medi on només hi havia 14N, i es van deixar replicar un sol cop. Una altra vegada se’n va extreure la mostra de DNA i es va centrifugar en un gradient de clorur de cesi. En aquest cas la mostra quedava en un punt entremig dels altres dos, just el que seria la mitjana de les densitats del DNA amb 15N i del DNA amb 14N. Això va fer que es pogués descartar la replicació conservativa, ja que en aquest cas en aquesta mostra s’haguessin obtingut dos grups amb la mateixa quantitat de DNA, un corresponent a la densitat del DNA amb 15N i un altre corresponent a la densitat del DNA amb 14N. Com només sortia un punt, i a més a la densitat mitjana dels altres dos, quedava clar que cada doble cadena de DNA tenia la meitat amb 14N i l’altra meitat amb 15N. Però això no permetia saber si la replicació era semiconservativa o dispersiva.
Llavors es va fer un segon experiment per destriar entre replicació semiconservativa i dispersiva.
Es van agafar un altre cop bacteris que havien crescut en un medi amb 15N i es van posar en un medi amb 14N, i van deixar que fessin dos cicles de replicació. Un altre cop se’n va extreure una mostra de DNA i es va centrifugar en un gradient de clorur de cesi. En aquest cas van aparèixer dos punts de densitats diferents de DNA, els dos amb la mateixa quantitat de DNA. Un dels punts corresponia a la densitat del DNA amb 14N, i l’altre corresponia a la densitat del DNA amb 15N després d’haver replicat un cop en un medi amb 14N. Aquest resultat era inconsistent amb una replicació dispersiva, ja que en aquest cas s’hagués obtingut DNA amb una única densitat, major que la del DNA amb 14N però menor que la del DNA amb un sol cicle de replicació, ja que els isòtops 15N s’haurien repartit uniformement per totes les molècules de DNA.
El resultat sí que era consistent amb la replicació semiconservativa. La meitat del DNA té una cadena amb 15N i una segona cadena amb 14N, i l’altra meitat té les dues cadenes amb 14N.
DNA-TOPOISOMERASES Són enzims amb una funció molt important: relaxen el superenrotllament que es produeix quan la forquilla de replicació avança i les dues cadenes es separen.
La topoisomerasa 1 no necessita ATP, però només pot tallar una monocadena. En comptes, la topoisomerasa 2 produeix dos talls però sí que necessita ATP. Les topoisomerases tallen i enganxen després el que han tallat, no necessiten dos enzims diferents, com per exemple la ligasa per enganxar.
CICLE CEL·LULAR Mentre que en procariotes hi ha un únic origen de replicació, i aquesta acaba en regions ter, en eucariotes hi ha replicons, i n’hi ha molts (cada replicó és com un OriC). La replicació s’acaba quan s’arriba a un altre replicó o quan s’acaba el cromosoma.
Perquè hi ha tants orígens de replicació en eucariotes? Per començar, perquè hi ha molta més quantitat de DNA, i perquè les polimerases són més lentes que les de procariotes. Si només hi hagués un OriC la fase S hauria de ser molt més llarga que en procariotes. Perquè tingui una duració normal hi ha d’haver diversos replicons.
Però tots els replicons s’han d’activar, i fer-ho més o menys alhora, per això és necessari un control. També s’ha de controlar que per cada cicle cel·lular cada replicó només s’activi un cop, perquè només hi hagi una replicació.
Tots aquests controls es fan en el punt de control G1/S. Si la cèl·lula supera aquest control està obligada a entrar en divisió. Entra en fase S, es replica i després arriba a fase G2. Igualment hi ha un punt de control d’entrada a la mitosi (G2/M), que si no es supera la cèl·lula morirà i no entrarà en mitosi). També hi ha un punt de control dins la mitosi.
Les dues cèl·lules filles resultants de la divisió mitòtica són genèticament iguals que la mare. En la meiosi les cèl·lules que s’obtenen no són idèntiques a nivell genètica a causa de la recombinació i la repartició dels cromosomes homòlegs aleatòriament a un pol o un altre de la cèl·lula.
Però a vegades, i això és molt poc freqüent, hi ha recombinació mitòtica. A nivell fenotípic això fa que un heterozigot pugui tenir cèl·lules homozigòtiques recessives, ja que en la divisió s’ha quedat amb les dues còpies de l’al·lel recessiu en comptes de quedar-se amb una còpia d’aquest i una còpia del dominant, i per tant que pugui expressar un fenotip en mosaic. Això s’anomena mosaïcisme.
REPLICACIÓ EN CROMOSOMES D’EUCARIOTES A cada replicó es formen dues forquilles de replicació en sentits oposats.
Hi ha un nombre determinat de replicons per espècie: SÍNTESI DE DNA Hi ha una cadena adelantada i una retardada. En la retardada es formen els fragments d’Okazaki (això és igual que en procariotes). Aquests fragments es formen perquè la DNA-polimerasa replica en sentit 5’3’ i necessita un extrem 3’OH lliure per començar a replicar. En la cadena adelantada amb un sol encebador que proporcioni aquest extrem n’hi ha prou perquè es replica tota la cadena d’una tirada, però en la retardada es va fent per fragments, ja que aquesta surt de la forquilla de replicació en el sentit 3’5’. En eucariotes la mida dels fragments d’Okazaki és més petita que en procariotes.
En la cadena adelantada la DNA-polimerasa va replicant fins al final del cromosoma o fins que es troba un altre replicó.
ETAPES DE LA REPLICACIÓ EN EUCARIOTES Iniciació - Es crea el complex de reconeixement de l’origen (ORC).
Hi ha d’haver un factor permissiu de la replicació.
Es necessiten: helicases, proteïnes d’unió al DNA (RPA), topoisomerases...
Elongació - Síntesi de la cadena contínua i discontínua (ho fa la polimerasa δ).
Síntesi (polimerasa α) i eliminació d’encebadors (endonucleasa FEN1/RNAsaH).
- Unió dels diferents fragments d’Okazaki entre ells (ligasa).
Terminació - Assemblatge del nucleosoma.
Formació dels telòmers: telomerasa.
El replicator és la regió reconeguda per començar la replicació.
L’ORC (Complex de Reconeixement de l’Origen de Replicació) s’hi uneix i recluta Cdc6 i Cdt1. Quan aquestes dues proteïnes estan unides, s’hi uneix un tercer complex, el Mcm2-7. Aquest últim és una helicasa. El complex format per tot aquest conjunt de proteïnes s’anomena preRC (origen de pre-replicació). Quan un replicó té muntat a sobre el complex preRC vol dir que s’està preparant per començar la replicació.
Quan el preRC està preparat, pot activar-se o no. Com tenim molts orígens de replicació, és important que cada un només s’activi un cop per cicle cel·lular. És per aquesta raó que, de la mateixa manera que hi ha d’haver un control per a què es formin els preRC, també n’hi ha d’haver per a què no se’n formin de més. Aquest control es fa amb la concentració de ciclines.
Depenent de la concentració de ciclines, aquest preRC s’activarà o no, i se’n formaran de nous o no.
Si l’activitat de ciclines és alta (això vol dir que la seva concentració és alta) aquests preRC s’activen, i llavors s’hi uneixen les polimerases i la replicació comença. Quan s’activen, la formació de més preRCs queda inhibida. Així es controla que en un cicle cel·lular cada replicoó només s’activi un cop. Si l’activitat de les ciclines és baixa, els preRC es formen però no s’activen.
REGULACIÓ DE LA FORMACIÓ DE preRC DURANT EL CICLE CEL·LULAR Hi ha nivells alts de ciclina durant les fases S, G2 i M. Els nivells només són baixos en G1, permetent així que es formin els preRC però no que s’activin.
Les ciclines controlen l’activació de preRC. Cdk són les ciclines, que actuen conjuntament amb les Ddk, que són quinases però no ciclines. Es necessiten les dues proteïnes per fer el pas següent. Quan les ciclines estan en una concentració alta, les quinases poden fer la seva funció, que es fosforilar la Cdc6 i la Cdt1. Aquesta fosforilació promou la seva degradació. També fosforilen les helicases, però aquestes no són degradades perquè són necessàries per tot el procés.
Quan Cdc6 i Cdt1 són degradades s’activa la col·locació de les polimerases. Les principals en la replicació d’eucariotes són la δ i la ε. Són les homòlogues de la polimerasa 3 en procariotes.
Quan ja s’han posicionat les polimerases δ i la ε, es posiciona la α. Encara que aquesta no sigui la primera en col·locar-se, és la primera en actuar. La polimerasa α és una primasa, i com indica el seu nom el que fa és sintetitzar els primers (encebadors). Això vol dir que té activitat RNApolimerasa, però també té activitat DNA-polimerasa perquè després de sintetitzar el primer continua sintetitzant alguns nucleòtids de DNA. Però sintetitza molts pocs nucleòtids de DNA, ja que de seguida és substituïda per les polimerases principals (δ i la ε). A aquest canvi se l’anomena procés d’intercanvi polimeràsic.
La polimerasa α és la única que pot començar el procés, gràcies a la seva activitat RNApolimerasa que li permet sintetitzar els primers. Però després han de continuar les polimerases principals perquè la α és molt poc processiva. La processivitat és una característica que es refereix a la capacitat d’incorporar molts nucleòtids per unitat de temps. Una polimerasa amb més processivitat té més velocitat de replicació. Les polimerases δ i la ε tenen una processivitat molt més gran perquè compten amb l’ajuda d’un carregador d’abraçadora (RFC) i una abraçadora lliscant (PCNA).
L’abraçadora és com un anell, que està carregat pel carregador d’abraçadora. Això fa que la cadena motlle estigui unida a la nova cadena que s’està sintetitzant. L’anell va lliscant pel DNA i va movent les polimerases. El carregador, quan ja ha carregat les abraçadores, se’n va.
L’eliminació dels encebadors la realitza un altre enzim, la RNAsaH o FEN-A. La polimerasa δ fica el DNA al lloc on hi havia l’encebador. I finalment per unir els fragments hi ha la DNA-ligasa.
CONTROL DEL CARREGADOR D’ABRAÇADORA El carregador està tancat i quan s’uneix a ATP s’obre i pot agafar l’abraçadora.
Quan l’abraçadora s’uneix al carregador aquesta s’obre.
Llavors l’abraçadora pot envoltar el DNA. Això fa que l’ATP s’hidrolitzi, i llavors el carregador se’n vagi i l’abraçadora es tanqui.
ACTIVACIÓ DELS REPLICONS Els replicons s’activen tots, però no al mateix temps. Presenten una certa asincronia, però al final s’acaben activant tots. Per exemple, si en el dibuix comencen el 3 i el 5, automàticament en aquelles regions s’inactiva la formació de preRC nous. Llavors, el replicó 4, que està al mig pot ser que s’activi per l’avanç de la forquilla de replicació dels replicons del voltant. Aquesta activació del preRC es diu activació passiva.
Sempre que s’activa un replicó després no se’n poden formar de nous, almenys fins que no es completi un altre cicle cel·lular.
RUPTURA CROMOSÒMIC PER REPLICACIÓ INCOMPLETA DEL DNA Si el DNA no es replica en la seva totalitat, després es produeixen ruptures en l’anafase en les zones que han quedat sense replicar, perquè es veuen estirades cap als dos pols alhora.
TIPUS DE DNA-POLIMERASES EN EUCARIOTES TERMINACIÓ DE LA REPLICACIÓ En els cromosomes procariòtics, com són circulars, no hi ha problemes perquè la estructura theta acaba quan les dues unions han recorregut totalment la molècula.
Els cromosomes d’eucariotes, però, tenen problemes per completar l’últim fragment d’Okazaki, per la formació dels telòmers.
En la cadena adelantada no hi ha cap problema perquè la DNApolimerasa ja feia tota la cadena d’una tirada, però en la retardada s’anaven posant encebadors que creaven els fragments d’Okazaki. Després aquests s’eliminen, i a l’extrem 5’ de la nova cadena li falta un tros. Això fa que els cromosomes es vagin escurçant, i provoca l’envelliment cel·lular.
PROCÉS DE FORMACIÓ DELS TELÒMERS Els problemes d’escurçament cromosòmic no poden passar en les cèl·lules germinal, ja que llavors un nadó naixeria ja sent vell. Per exemple, l’ovella Dolly va morir “jove” perquè es va clonar amb cèl·lules somàtiques que ja tenien els telòmers una mica escurçats.
Per a què això no passi a les cèl·lules germinals hi ha la telomerasa. Aquest enzim és una transcriptasa inversa: a partir d’un motlle de RNA propi pot sintetitzar DNA. Està formada per tant, per una part proteica i una part que és RNA. La telomerasa allarga l’extrem 3’ dels telòmers, que ja era de per si monocatenari. La part allargada és de color vermell a l’esquema.
El motlle de RNA de la telomerasa ara pot fer-se servir com a encebador per la cadena amb l’extrem 5’. A partir d’això una DNA-polimerasa DNA pot sintetitzar la part de la cadena que abans quedava sense replicar.
EL T-LOOP DELS TELÒMERS Participen dues proteïnes: TRF1 i TRF2. La TRF1 és la proteïna que promou que la estructura final del cromosoma es plegui, i la TRF2 és la proteïna que forma el segellat final i que manté estable la monocadena de l’extrem del telòmer que s’intercala entre la doble cadena.
Aquesta estructura és la típica en els mamífers. S’anomena t-loop.
DIFERÈNCIES DE LA REPLICACIÓ EUCARIÒTICA AMB LA PROCARIÒTICA La replicació eucariòtica respecte la procariòtica: - - Té una velocitat menor de replicació.
Hi ha múltiples orígens de replicació.
Les rondes de replicació no se solapen.
Els fragments d’Okazaki són més curts.
Hi ha polimerases diferents:  δ i ε: les principals, s’encarreguen de la replicació de les cadenes adelantada i retardada.
 α: síntesi d’encebadors.
 β: reparació de DNA.
 γ: replica el DNA mitocondrial.
El control és més complex.
Hi ha telòmers.
En la replicació eucariòtica és molt important també el paper de les cohesines. Aquestes proteïnes mantenen unides les cromàtides germanes després de la replicació fins l’anafase.
REPLICACIÓ DE LES HISTONES Les histones representen un problema durant la replicació. Les marques que porten les cues de les histones no s’han de perdre durant la replicació, ja que després la cromatina ha de tronar a condició d’heterocromatina o eucromatina, tal i com estava abans, i això està determinat per les modificacions de les cues de les histones.
El mecanisme és el següent: - - - La forquilla de replicació passa pel DNA i llavors els nucleosomes es desintegren.
Les histones estan distribuïdes en dos dímers d’H2A-H2B i un tetràmer H3-H4. Es queden formant aquests dímers i tetràmers quan els nucleosomes es desintegren.
Les histones es reciclen. Després de desintegrar-se els nucleosomes, en les noves cadenes de DNA es tornen a formar nous nucleosomes utilitzant els dímers i tetràmers d’histones provinents de nucleosomes antics i també histones de nova síntesi.
Els dímers i tetràmers tenen totes els histones velles o noves, però no pot ser una nova i l’altre vella.
La distribució dels dímers i tetràmers en les dues cadenes noves és aleatòria, de manera que cada cadena queda més o menys amb la meitat de les histones velles i la meitat nova, tot i que cada nucleosoma pot tenir un percentatge diferent de noves i velles. Això permet assegurar-se que en els noves cadenes hi hagin histones amb les marques antigues que permetran que el DNA torni a l’estructura que tenia abans.
En la reorganització dels nucleosomes intervenen les xaperones històniques: les principals són CAF-1 i NAP-1. CAF-1 s’encarrega de la reorganització de les histones H3 i H4 en tetràmer, i NAP-1 dels dímers d’H2A-H2B.
HERÈNCIA DELS ESTATS CROMATÍNICS A cada cadena hi ha histones antigues i noves. Les antigues porten les seves marques (les banderes del dibuix representen acetilacions). Aquestes marques serveixen perquè es puguin marcar les histones noves de cada cadena.
Hi ha unes proteïnes que reconeixen les acetilacions, els bromodominis, que s’uneixen a les regions de les histones que presenten acetilacions. Aquests bromodominis són una diana per la unió de les acetilases, que llavors saben quines són les zones en les que han de marcar les histones.
LA RECOMBINACIÓ La recombinació homòloga no és l’únic tipus de recombinació que existeix. Hi ha diferents tipus de recombinació: - Recombinació homòloga: té lloc entre dos zones homòlogues d’una parella de cromosomes homòlegs.
Recombinació específica de lloc: es necessiten molts pocs nucleòtids homòlegs perquè es produeixi.
Transposició: no és una recombinació en si, però necessita de la recombinació per produir-se.
RECOMBINACIÓ ESPECÍFICA DE LLOC La recombinació homòloga estava basada en la existència de seqüències homòlogues llargues, i per això la recombinació podia produir-se en diferents llocs d’aquestes. La recombinació específica de lloc, com el seu propi nom indici, ocorre en un sol lloc. Només hi ha homologia de seqüències en una regió molt petita (uns 10 pb), i és aquí on es produeix la recombinació. La mecànica d’aquesta recombinació no té res a veure amb la de la recombinació homòloga, ja que no intervenen les mateixes proteïnes.
Aquesta recombinació és un tipus de recombinació especialitzada perquè ocorre entre parells específics de seqüències curtes de DNA. Aquestes seqüències poden trobar-se sobre un mateix cromosoma o en diferents. En aquest cas la recombinació no està guiada per les seqüències curtes homòlogues, sinó que depèn d’enzims especialitzats en reconèixer aquestes seqüències i catalitzar talls dins o a prop d’elles i després tornar a unir el DNA per donar lloc a productes recombinants. Aquest tipus de recombinació generalment condueix a un reordenament de la informació.
El reordenament gènic es promou per la recombinació entre dues seqüències específiques o dues còpies d’un element transposable. Si aquestes seqüències es troben en un mateix cromosoma, es parla llavors de repeticions, que poden ser directes (RDs) o inverses (Ris), i el resultat de la recombinació depèn de la orientació de les repeticions (quan parlem d’orientació ens referim a l’ordre dels nucleòtids). En la següent figura veiem dos exemples, en els quals les repeticions estan en color verd i vermell: Si les repeticions tenen orientació inversa (Ris) el segment de DNA que es trobava entre les Ris queda invertit després de la recombinació (cas a en la figura anterior). Per contra, si les repeticions eren directes (RDs) després de la recombinació l’element intermedi que fora del cromosoma com un cercle de DNA (cas b de la figura anterior).
Quan les seqüències es troben en molècules de DNA diferents, el fragment s’integra al DNA.
Com a exemple d’aquesta recombinació tenim la integració de fago λ al cromosoma bacterià.
Veiem el mecanisme general en les dues figures següents: El lloc d’integració del fago s’anomena attP (attachment Phage), i interacciona amb el lloc d’interacció attB del bacteri (attachment Bacteria). Encara que no hi hagi homologia de seqüència entre attP i attB, hi ha una regió de 15 pb que és idèntica en els dos llocs. Aquesta regió s’anomena O, sent així les regions que l’envolten P i P’ en el fago i Bi B’ en el bacteri, així que attP és el mateix que POP’ i attB és el mateix que BOB’. La recombinació es dóna entre els llocs O de manera que en integrar-se el DNA del fago en el bacteri, el profago (DNA del fago integrat) qeudarà envoltat per dos noves regions: BOP’ i POB’. BOP’ és el mateix que attL i POB’ el mateix que attR.
Degut a que el DNA del fago és circular, aquesta recombinació permet la seva inserció en el DNA bacterià com una seqüència lineal. Aquesta forma integrada s’anomena profago i queda rodejada a l’esquerra per attL (BOP’) i a la dreta per attR (POB’). attL i attR estan involucrats en la escissió del profago, que transcorre amb un mecanisme oposat al d’integració. Això implica que els mecanismes d’integració i escissió són reversibles, encara que es donen en condicions diferents.
MECANISMES DE RECOMBINACIÓ PER TRANSPOSICIÓ Hi ha dues classes de transposició: una és conservativa i l’altre repetitiva. En la primera es talla el transposó, i en la segona es transcriu i després torna a passar a DNA per inserir-se. Per a què el transposó s’insereixi al DNA, en tots dos casos es fa servir un procés de recombinació.
Hi ha transposons, retrotransposons i poly-A retrotransposons.
En transposons les regions TIRS (Terminal Inverted Repeats) són importants, ja que són regions terminals invertides i repetides. Això significa que són seqüències curtes, sent una la còpia de l’altre però amb l’ordre de nucleòtids invertit. Si es produeixen mutacions en aquestes seqüències, encara que no es facin en el gen principal, el transposó ja no es podrà moure, ja que aquestes seqüències són importants pel reconeixement de la transposasa, que és l’enzim que talla els fragments i els transporta. La transposasa també és necessària per la recombinació.
En el cas dels transposons són importants les LTR perquè dins d’aquestes seqüències hi ha el promotor, per tant són necessàries per la transcripció de l’element. Evidentment, els gens també són importants. Aquests gens codifiquen per la transcriptasa inversa i la integrasa. També hi ha la proteïna RNAsa H.
En el cas dels poly-A transposons no hi ha LTR i són importants les regions terminals poly-A, que són regions que reconeixen el lloc on s’inseriran i poden tenir diversos gens: ORF1 i ORF2. Se sap que aquests gens també codifiquen per la transcriptasa inversa, la integrasa i la RNAsa H.
TRANSPOSONS El fenomen de transposició es produeix mitjançant la transposasa, que s’uneix a les TIRS. És important que les TIRS no tinguin mutacions perquè sinó la transposasa no les reconeix i no s’hi pot unir. La transposasa promou el tall de l’element transposable a nivell de les TIRS. Llavors queden dos extrems 3’OH lliures. Aquestes elements no tenen cap diana específica i es poden inserir en qualsevol regió del genoma.
La transposasa provoca un tall esglaonat a la zona del genoma on s’inserirà l’element. La transposasa catalitza la reacció de transesterificació que fa unir els extrems 3’OH lliures de l’element transposable amb els fosfats lliures de la cadena de DNA on es vol inserir.
El fet que el tall en el DNA fos esglaonat fa que ara quedin uns buits que s’omple per l’acció d’enzims de reparació. Llavors se sintetitza DNA nou i la zona que envolta el transposó queda duplicada.
RETROTRANSPOSONS Aquests tenen transposició replicativa. Delimitant l’element transposable hi ha les LTR. Aquestes LTR no són codificants per cap proteïna però tenen els promotors que permeten que comenci la transcripció de l’element. Per tant també és important que les LTR no tinguin mutacions.
Com el promotor està dins la LTR aquesta seqüència no es transcriu tota, però és necessari que estigui sencera quan la còpia de l’element transposable s’insereixi en algun lloc del genoma. La LTR té tres regions, les clàssiques que es troben tant en els retrovirus com en els transposons (entre elles hi ha el lloc d’unió del ribosoma i el polyA site).
Si la transcripció es fa tal i com posa en l’esquema, després quan el RNA es retrotranscrigui a DNA li faltarà un tros de les LTR.
Per a què no s’eliminin aquests trossos en la duplicació de l’element transposable es fa servir un encebador que és un tRNA. En l’esquema següent es veu el RNA transcrit de color vermell, i el DNA de color verd/blau.
El tRNA encebador té homologia amb el PBS (Poli Binding Site) del RNA transcrit. El tRNA que fa d’encebador pot ser diferent per diferents elements transposables.
La transcriptasa inversa (que està codificada pel propi element transposable) copia retrotranscriu un tros a partir del tRNA. Després aquest tros és eliminat per l’acció de la RNAsaH (també codificada pel propi element transposable). Aquest tros de DNA tallat llavors es transloca a l’altra punta del RNA, perquè també hi té homologia (són regions de la LTR). A partir d’aquest tros se sintetitza més DNA, fins al final del RNA, o sigui fins el PBS.
La RNAsa-H elimina un altre tros de DNA, i a partir del que queda es pot retrotranscriure una altra part de DNA. Així ja tenim la LTR completa en un extrem del DNA. Si una de les monocadenes es transloca a l’altra extrem de l’element transposable, hi haurà una monocadena a cada extrem i podran servir de motle per sintetitzar el DNA que falta.
El factor limitant en tot aquest procés és el tRNA encebador.
Quan ja tenim el DNA de doble cadena, participa una altra proteïna, la integrasa. Aquesta proteïna elimina uns quants nucleòtids dels extrems 3’, fent que quedi un grup 3’OH lliure necessari perquè l’element s’insereixi al genoma.
Llavors la integrasa actua com ho feia abans la transposasa. Talla de forma esglaonada la doble cadena de DNA en un lloc del genoma, i llavors catalitza una reacció de transesterificació per unir els extrems 3’OH lliures amb els fosfats dels extrems 5’.
En aquest cas quan l’element s’hagi inserit també quedaran unes zones buides que els enzims de reparació ompliran. Aquesta regió llavors queda duplicada. S’anomena target-site.
(La part verda que es veu en l’última doble cadena s’hauria de veure una mica esglaonada, això és un erros de l’esquema).
POLY-A RETROTRANSPOSONS Dins aquest tipus hi ha la replicació dels elements LINE. En aquest cas es coneixen menys els detalls a nivell molecular. Els LINE s’insereixen preferiblement en regions riques en A_T. Això és bàsic perquè l’element transposable té zones polyA en els extrems 3’, i aquestes zones són riques en A-T.
Unes proteïnes ORF1 i ORF2 agafen el RNA transcrit per polyA i el porten al target-site, que és on l’element s’inserirà.
Unes proteïnes tallen una de les dues cadenes de la seqüència diana. La regió polyA és homòloga amb la monocadena del DNA que ha quedat lliure perquè ha estat tallada. Ara, l’extrem 3’OH del DNA serveix com a encebador perquè al retrotranscriptasa sintetitzi al primera monocadena de DNA, amb el RNA com a motlle. La segona monocadena se sintetitza fent servir com a motlle la primera.
Al final s’insereix el fragment de DNA al genoma i ja està. Tal i com passava abans, les proteïnes que regulen el procés, com la transcriptasa inversa i les proteïnes que tallen la monocadena de DNA.
Fixem-nos que en aquest cas el target site també acaba duplicat.
ELEMENTS TRANSPOSABLES EN DROSOPHILA En Drosophila no hi ha telomerasa, però les seves línies germinals no tenen escurçats els telòmers. Això és perquè hi ha uns elements transposables anomenats TART que es van transposant en els extrems dels telòmers i així allarguen les seqüències telomèriques.
MODELS DE RECOMBINACIÓ HOMÒLOGA Hi ha el model de Holliday i el model de ruptura bicatenària (DSB). Actualment sembla que s’accepta com a correcte el segon, però és necessari conèixer el primer perquè el model DSB incorpora alguns aspectes d’aquest primer model.
MODEL DE HOLLIDAY En el cas del tall horitzontal és com si no hi hagués recombinació.
Molts científics van dir que era improbable que els talls es donessin en les dues monocadenes a la mateixa alçada. També trobaven improbables altres passos del procés, i per això al final aquest model ha estat substituït pel DSB.
MODEL DE RUPTURA DE CADENA DOBLE O MODEL DSB El model de ruptura de la cadena doble, la recombinació implica un tall de la cadena doble en un dúplex de DNA, el desplaçament de la cadena, la síntesi de DNA i la resolució de dos unions Holliday. En el model de Holliday no hi havia síntesi de DNA.
Convergència gènica per recombinació homòloga per ruptura bicatenària Si un gen heterozigot es troba just a la zona en la que es produeixen les unions Holliday, com d’una cromàtide s’elimina una monocadena i després es torna a sintetitzar fent servir de motlle l’altra cromàtide, al final queden tres al·lels iguals i un de diferent.
Això vol dir que en una cromàtide els dos al·lels són iguals, però en l’altre cada monocadena en té un de diferent. Llavors entre les dues monocadenes hi ha diferències a nivell de nucleòtids, i en aquestes zones no hi ha aparellament de bases. Això implica que hi hagi enzims de reparació que tallin una de les monocadenes del lloc on hi ha el mismatch i utilitzin l’altre com a motlle per reparar-ho. Això farà que tornem a tenir cada cromàtide amb un al·lel diferent, o també que tinguem totes les monocadenes amb el mateix al·lel.
Aquest procés no és gaire corrent.
PROTEÏNES IMPLICADES EN LA RECOMBINACIÓ HOMÒLOGA D’EUCARIOTES - Spo11: talla, fa la ruptura bicatenària del DNA.
MRX: processa els extrems de DNA escindit.
RAD51 i DMC1: són proteïnes homòlogues de RecA en E. coli, però no se sap ben bé com actuen.
Spo11 produeix els talls, i els enzims MRX eliminen alguns nucleòtids dels extrems que han quedat, perquè tenen activitat exonucleasa 5’3’. Després intervenen la DMC1 i la RAD51, que tapissen les regions monocadena que han quedat i permeten que s’intercali amb l’altre molècula de DNA que continua sencera.
PAPER DE LA RECOMBINACIÓ EN EUCARIOTES Té un paper decisiu en la meiosi: - La recombinació és necessària per l’aparellament cromosòmic correcte.
La recombinació contribueix a l’augment de la variabilitat genètica.
A més també contribueix a reparar el DNA i reiniciar forquilles de replicació col·lapsades.
Com pot ser que tinguem milions d’immunoglobulines si només tenim 25.000 gens? Això és possible gràcies a processos de recombinació gènica, que acaben donant lloc a diferents tipus d’immunoglobulines.
Cada immunoglobulina està formada per dues cadenes lleugeres i dues pesades. Cada limfòcit produeix un tipus d’immunoglobulina. Això vol dir que hauríem de tenir milions de tipus de limfòcits.
Un limfòcit que encara no és madur té molts gens V (V de les regions variables de les immunoglobulines) que van de V1 fins a Vn. També hi ha els gens J, que són els gens que codifiquen per les proteïnes que uneix els dominis variables i els constant de les immunoglobulines. Finalment hi ha el gen C (C de domini constant). Hi ha un gen constant per la part constant de les cadenes pesades i un altre per la part constant de la cadenes lleugeres.
El mateix passa amb els gens de les regions variables.
El limfòcit, durant el procés de maduració pateix recombinacions somàtiques. En aquestes recombinacions es van eliminant gens, de manera que al final tenim una composició de n gens menys els que s’ha perdut en el procés. Llavors, el DNA que té aquest limfòcit madur es transcriu, i l’RNA resultant també pateix un procés d’splicing, que vol dir que també s’eliminen els transcrits d’alguns gens. Al final de tot això tenim una combinació determinada VJC (ex: V3J3C4).
Això que hem explicat era per la síntesi de la cadena lleugera. Els gens que codifiquen per les regions variables i constants de la cadena pesada són semblants, però hi ha més gens C i també hi ha gens D (D de diversitat). Igual que en la cadena lleugera, aquí també hi ha un procés d’eliminació de gens fins que al final s’arriba a una combinació VDJC.
Aquest és un exemple de com es produeix la recombinació que fa que al final hi hagi una combinació VDJC.
De fet, hi ha seqüències senyal al voltant de cada gen d’aquets que són específiques per la recombinació. Aquestes seqüències són molt conservades. Hi ha dos tipus: - - Seqüència senyal curta: té un DNA espaiador de 12 pb. Aquest DNA espaiador és variable. El que no ho és són les seqüències de 7 i 9 pb, que són conservades i sempre són iguals.
Seqüència senyal llarga: les seqüències conservades són les mateixes, de 7 i 9 pb, però el DNA espaiador és més gran, de 23 pb.
La recombinació sempre s’ha de produir entre una seqüència llarga i una curta.
Exemples de reordenaments: Mecanisme de recombinació: En aquest exemple tenim dues regions que han de recombinar, una V i una J. Les seqüències senyals són els triangles. Participen unes proteïnes que es diuen recombinases (RAG1 i RAG2).
Aquestes recombinases eliminen uns quants nucleòtids de l’extrem 3’ colindant amb les seqüències senyals dels gens. També promouen llavors l’extrem 3’OH ataci la unió fosfodièster de l’altre cadena entre el gen i la seqüència senyal.
Llavors el tros de separació dels dos gens queda sol, amb les seqüències senyals, que poden recombinar i unir-se. Els dos gens queden junts i ara es transcriuran junts.
...