Tema 5: Altres tipus de vectors. Modificació de l'expressió gènica. Construcció i avaluació de genoteques (2015)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Tecnologia del DNA recombinant
Año del apunte 2015
Páginas 3
Fecha de subida 21/04/2016
Descargas 8
Subido por

Vista previa del texto

Tema 5. Altres tipus de vectors. Modificació de l’expressió gènica. Construcció i avaluació de genoteques Primera part: explicada a mà Segona part (no cal saber-la amb profunditat): RT-PCR com alternativa a la clonació de cDNA: la retrotranscripció seguida d’una PCR (procés anomenat RTPCR) permet l’amplificació de seqüències de RNA en forma de cDNA, al tractar-se d’una PCR, s’usen encebadors específics per al/s gen/s d’interès que ens permet clonar-los de forma específica. La retrotransposició s’inicia en l’extrem 3’ i en la PCR el primer s’afegeix en l’extrem 5’. La sensibilitat és tan gran que es pot usar el RNA total com a material de partida, sense necessitat de talls previs. Tot i aquests avantatges, encara hi ha raons per a construir biblioteques de cDNA: o Són permanents: el mRNA buscat pot ser que no estigui disponible ja que pertany a un teixit o cèl·lules determinades. Si es construeix una biblioteca de cDNA d’aquests tipus de mostres on sabem que es troba el nostre mRNA, el nostre fragment d’interès estarà sempre disponible.
o Les estratègies de screening: en la PCR estan basades en la hibridació, però en les biblioteques poden estar basades en l’expressió, per exemple, realitzant assaigs immunohistoquímics.
o Les DNA polimerases convencionals per a la formació de la segona cadena de DNA són millors que les usades en PCR, ja que realitzen menys errors. De forma que una biblioteca de cDNA construïda per PCR contindrà més errors de seqüència.
1. Estratègies de screening: es tracta de la identificació de clons en una llibreria 1.1. Buscant la seqüència: hibridació d’àcids nucleics, tant per biblioteques genòmiques com per les de cDNA 1.1.1. Cribratge per hibridació: és la tècnica més usada ja que és rapida i pot aplicar-se en un gran nombre de clons. Grunstein i Hogness (1975) van desenvolupar un mètode per detectar seqüències de DNA en colònies transformades per hibridació in situ amb DNA marcat radioactivament, aquest procés pot detectar quina colònia, d’entre centenars, conté la seqüència diana.
Replica-plate: les colònies transformades creixen en una superfície d’agar. Es fa una rèplica en un filtre de nitrocel·lulosa que es plaqueja i incuba en una placa de Petri amb agar, mentre es manté la placa inicial (la qual ens servirà de referència). En la placa rèplica, agafem el filtre amb les colònies i el tractem amb solució alcalina (1), per tal que les colònies siguin lisades i el DNA desnaturalitzat, posteriorment es neutralitza (2) i després el filtre es tracta amb proteïnasa K (3), per tal d’eliminar les proteïnes i deixar el DNA unit a la nitrocel·lulosa, el qual té una gran afinitat per aquesta, el resultat d’aquest pas és que ens quedem amb unes “petjades de DNA de colònies”. Aquest DNA es fixa firmament a 80ºC (5) posteriorment a un rentat (4). Afegim una sonda de RNA marcat, que hibridarà amb la nostra seqüència d’interès i el resultat es podrà monitoritzar per auto-radiogradia. La colònia que doni positiu podrà ser recollida de la placa inicial que s’ha mantingut. És tracta d’un mètode de Grunstein-Hogness per la detecció de colònies recombinants per hibridació de colònies.
- - Plaque lift: variacions en el procés anterior per tal d’aplicar-lo en plaques de fags dutes a terme per Benton i Davis. El filtre de nitrocel·lulosa s’aplica en la superfície del agar que conté els fags, fent un contacte directe (no cal sembrar en placa), el DNA del fag s’unirà al filtre i es desnaturalitza (2).
L’avantatge d’aquest mètode és la possibilitat de fer duplicats de la mateixa placa fàcilment. És un dels processos més usats en cribratge de biblioteques per aïllar fags recombinants mitjançant la hibridació d’àcids nucleics.
- PCR: té la mateixa versatilitat que la hibridació, i les mateixes limitacions descrites amb anterioritat (a mà).
És possible identificar qualsevol clon per PCR, però únicament si hi ha suficient informació de la seqüència per construir els encebadors adequats. En comptes de posar la biblioteca en agar, els clons es mantenen en plaques multi-pous, cada pou es cribra per PCR i s’identifiquen els positius. Els clons dels pous positius es dilueixen novament en plaques multi-pou i es repeteix el cribratge.
1.2. Buscant l’expressió/funció de la proteïna generada pel clon: únicament en biblioteques d’expressió, el producte expressat pot ser reconegut per un anticòs o lligand, o també per la seva activitat biològica- Són biblioteques útils ja que permeten l’ús de tècniques alternatives, estudiant l’estructura i la funcionalitat del producte del gen. És una eina important en casos en que la seqüència diana de DNA del clon és desconeguda i no hi ha ninguna estratègia per crear encebadors específics d’hibridació o de PCR. Es tracta de biblioteques representatives de la seva font, de forma que alguns cDNAs seran abundants i altres no.
1.2.1. Cribratge immunològic: s’usen anticossos que reconeixen específicament un antigen determinat del polipèptid sintetitzat pel clon diana, és una tècnica que pot ser aplicada en qualsevol proteïna, sempre i quant el anticòs estigui disponible, a més, no és necessari que la proteïna sigui funcional (sol ens interessa saber si està present). La diana de reconeixement acostuma a ser un epítop (seqüència curta d’aminoàcids que forma una estructura 3D en la superfície de la proteïna), a més, molts epítops es poden trobar sota condicions desnaturalitzants, quan la conformació de la proteïna és anormal.
Mètode de Broome and Gilbert: en cas que els vectors d’expressió siguin plasmidis. Aquest mètode aprofita el fet de que ens anticossos absorbeixen molt bé alguns tipus de plàstic, com ara el polivinil i en que les IgG poden ser marcades amb 125I mitjançant ionització in vitro. Les cèl·lules es cultiven en una placa de Petri, per tal d’alliberar els antígens dels clons positius, les cèl·lules són lisades (per exemple usant vapor de cloroform o o amb aerosol amb un fag virulent), és necessària una prèvia rèplica de la placa ja que aquest procediment mata el bacteri. S’aplica en la superfície de la placa el polivinil que posseeix els anticossos adequats, permetent la unió Ac-Ag, s’exposa el polivinil a 125I-IgG específic per una zona diferent de la superfície del antigen, el polivinil es renta i s’exposa a raigs X. Els clons detectats es poden aïllar de la rèplica de la placa. Aquesta tècnica únicament es pot aplicar si hi ha disponibles dos anticossos que reconeixen l’antigen.
Aquesta tècnica s’ha refinat amb els anys, la detecció original era usant anticossos iodants, això ha estat substituït per l’ús de marcadors no radioactius, més sensibles i amb menys soroll de fons. Actualment es necessiten 2 anticossos: el primari i el secundari. El primari detecta directament el polipèptid d’interès i l’anticòs secundari està marcat enzimàticament (peroxidasa o fosfatases alcalines) i detecta l’anticòs primari. Aquests dos són detectats mitjançant assaigs colorimètrics en la pròpia nitrocel·lulosa.
1.2.2.
1.2.3.
1.2.4.
1.2.5.
Cribratge South-western i North-western: s’usa quan volem aïllar clons que expressen proteïnes d’unió al DNA. Es passen de la placa a la membrana de nitrocel·lulosa (?). No s’usen anticossos per al cribratge, sinó que s’incuba la membrana amb DNA de doble cadena marcat radioactivament (aquest contindrà la seqüència de reconeixement de la proteïna en qüestió). La tècnica s’anomena South-Western perquè combina els principis de les tècniques de Southern i Western-Blott. Un dels desavantatges d’aquesta és que únicament es pot usar si la proteïna d’unió al DNA és funcional. Tot i així, és una tècnica que ha estat molt útil en l’aïllament de clones de cDNA que expressen seqüències corresponents a certs factors de transcripció en mamífers. Més recentment, s’ha desenvolupat una tècnica per aïllar proteïnes d’unió a seqüències específiques de RNA, per analogia, aquesta s’anomena North-Western (en aquest cas, en comtes de DNA de doble cadena s’usa RNA de cadena senzilla per a la identificació). Les dues tècniques són més eficients quan l’oligonucleòtid conté la seqüència d’unió en una forma multimèrica. Per minimitzar les unions no específiques s’usa un excés de DNA de doble cadena o de RNA de cadena senzilla no marcats, per tal de saturar les proteïnes que no són del nostre interès. No obstant, normalment s’ha de confirmar la tècnica portant a terme una segona ronda. (p.118 llibre Primrose) Cribratge per clonació funcional: aquesta tècnica aprofita l’activitat bioquímica o fisiològica del producte del gen. De forma contrària als altres mètodes, el clonatge funcional és possible sense conèixer la localització del gen d’interès en el genoma, i tampoc és necessari un coneixement de la seqüència de nucleòtids o aminoàcids. Si la proteïna expressada és funcional i aquesta funció es pot buscar en una biblioteca d’expressió, es pot identificar el clon corresponent.
Cribratge per complementació funcional: és el procés en el qual una seqüència particular de DNA compensa la falta d’una funció en una cèl·lula mutant, restablint així el fenotip salvatge. És un mètode potent ja que si les cèl·lules mutants no són viables sota alguna condició, les cèl·lules que continguin el clon d’interès poden ser seleccionades positivament, permetent així aïllar els corresponents clons. La complementació funcional també és possible en animals i plantes transgèniques, l’any 1998l Probst et al.
Van ser capaços de clonar el gen de ratolí associat a la sordera (Shaker-2) i el seu homòleg en humans (DFNB3), la mutació de Shaker-2 havia estat situada en un mapa prèviament en una regió del genoma de ratolí, que és igual a la regió involucrada en la sordera en humans. Els clons de BAC corresponents en aquesta rgió es van preparar amb el genoma de ratolí salvatge, i es van micro-injectar en òvuls de ratolins mutants per Shake2, es fa fer un cribratge dels ratolins transgènics que havien recuperat l’oïda, permetent identificar el clon BAC amb el gen funcional de Shake-2. Es va observar que el gen codificaba per una miosina del citoesquelet, que va ser usada per fer un cribratge en biblioteques de genoma humà i determinar el gen humà equivalent.
Cribatge per ganancia de funció: el cribratge anterior sol es pot fer si hi ha diponible un hoste apropiat (mutat), pot ser possible identificar clons basant-nos en que aquests confereixen una nova funció en la cèl·lula hoste. En alguns casos, aquesta ganancia de funció és un fenotip seleccionable que permet que les cèl·lules que contenen el clon es seleccionin positivament. En altres casos, la ganància otorgada no és seleccionable, però pot ser detectada perquè causa diversos canvis visibles en el fenotip.
...