Tema 5: Restricción bacteriana (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Microbiología Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 6
Fecha de subida 04/10/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Tema 5. Restricción bacteriana.
Importancia de la restricción de las bacterias. Esta historia comienza por el año 63, un microbiólogo hizo unos experimentos que explicaremos para entender qué es un sistema de restricción. Cogió el bacteriófago landa e hizo crecer una alícuota en una cepa de E coli K, y otra en B. Cogió la cepa de L y tenemos los lisados de cada cepa.
• • Cogemos el lisado de K y sembramos en una cepa de E. coli K y salen las calvas que hemos visto.
Paralelamente en el lisado de K sembramos en una cepa de E coli B y miramos si hay diferencias en el recuento de partículas de calvas en ambas condiciones.
En el de arriba, obtenemos un título, es decir, una concentración de 4 por 10 elevado a 11.
Abajo, reducción de cuatro órdenes de magnitud en el mismo lisado según sembremos en cepa de E. coli B o K.
Se ha de hacer un control: hacemos lo mismo pero al revés, con el lisado de landa B y sale lo mismo pero cambiado.
• • Cuando el lisado B infectamos landa B, sale elevado a 11.
Si el mismo lisado sembramos en K vuelve a haber una reducion de 4 ordenes de magnitud.
Cuando viene de B y sembramos en K, o de K a B, el lisado sufre una restricción, de ahí viene el nombre de restricción.
Los bacteriófagos lo que hacen es inyectar el A. nucleico y la cápside queda fuera. El DNA cuando penetra K ha de haber una modificación que no le guste a la célula y hace ciclo lítico, eso pensaban. Decían que ha deber una modificación en el DNA, y de ahí viene el nombre de sistemas de restrición-modificación. Desde el punto de vista biológico tienen como función detectar el DNA propio, lo que viene de K no es de B, y funciona por patrones de metilación por secuencias específicas. El DNA es metilado, por metilación especifica de cepa si no tiene la metilación adecuada pos mal. ¿Qué bases se metilan? Ni la guanina ni timina, metilan adeninas y citosinas (uracilo no pq no hay) esto es lo que metilan los si stemas de mod restricción. La SAM, es el donador y es el responsable de la metilación en adeninas y citosina!!!!!!! Tenemos SAM, como consecuencia de la actuación de la metilasa, pasamos a tener la adenina metilada y el donador del radical metilo es el SAM. También como en el caso de la metilasa Dam, es una metilación postreplicativa (tendremos una secuencia no metilada y otra metilada cuando repliquemos el DNA). En el sistema general de restricción, los genes se acostumbran llamar hsd, host specificity determinant, significa que tiene afectado un gen que interviene en el proceso de reconocer/restringir/metilar el DNA. La metilación no es al azar, son secuencias concretas.
Etapas en el proceso de actuación del sistema Hsd en bacterias.
Tenemos célula bacteriana donde su sistema de restricción (cada célula tiene uno) reconoce en este caso esta secuencia palindrómica que tiene metilada la adenina. Esta sería la secuencia. Muy bien. Entra en la célula el DNA, y puede entrar en tres situaciones diferentes: 1. DNA con esta secuencia metilada. No restricción 2. DNA con esta secuencia no metilada. Restricción 3. DNA que no tenga esta secuencia. No restricción Entonces tenemos el sistema Hsd, el gato lo que hace es analizar el DNA que penetra, si lo encuentra el de la secuencia propia metilada, no hará nada porque entiende que su secuencia está metilada y quiere decir que esté DNA es de un vecino de la misma población y no le hará nada. ¿Qué pasa si detecta una secuencia no metilada? Esto quiere decir que este DNA no proviene de la misma línea bacteriana, por tanto el sistema de restricción (el gato) coge el DNA que es un DNA extraño porque está la secuencia propia pero no está metilada, y lo restringe.
En la tercera situación, no está la secuencia propia, entonces el sistema de restricción no se entera de que ese DNA existe porque el sistema de restricción siempre busca la secuencia propia. Si no detecta la secuencia no puede restringir porque no hace nada.
¿Qué pasa arriba de todo a la derecha? Aparece otra secuencia de restricción (otra diana, pero aunque esté presente esta última secuencia metilada, el sistema de restricción no le hace nada porque por defecto, solo actúa en función a la metilación de la secuencia PROPIA. Si hay otra secuencia metilada, pos vale, no se entera, solo reconoce la secuencia Hsd propia de la bacteria. Actúa por defecto de la metilación, la segunda secuencia no la reconoce.
Características: 1. El proceso de metilación es port replicativo (aparecerán regiones hemimetiladas.
2. Cuando replicamos el DNA, una de las cadenas no estará metilada, si el sistema no fuera capaz de no restringir la región hemimmetilada la celula continuamente se estaría suicidando xd. No lo hacen, si la cadena es hemimetilada, si restringimos la metilada lo que estamos haciendo es degradando DNA, por tanto esto no lo harán.
3. El sistema de restricción corta cuando ninguna de las dos cadenas está metilada.
4. Se han descrito hasta el momento 4 clases de sistemas de restricción.
Otro recordatorio. Hasta el momento hemos hablado de dos metilasas: 1. Dam 2. Sistema de resticción NO ESTÁN CONECTADAS!!!! Tienen funciones diferentes, no tienen nada que ver.
 TIPOS DE SISTEMAS DE MOD-RES.
CLASE I.
Caracteriza por tener 3 genes que son (host specifity determinant) 1. Hsd S.
2. Hsd M.
3. Hsd R.
S es la prote que reconoce la secuencia especifica del sistema de restricción. Cuando la reconoce, pueden pasar dos cosas: Que ninguna de las cadenas esté metilada, entonces interviene la restrictasa codificada por el gen Hsd R, por tanto, restringimos. Si la cadena es hemimetilada, debemos metilar el trozo que no está metilado y esto lo hace la Hsd M.
¿Dónde corta? La restrictasa corta de forma un poco aleatoria entre 25 pares de bases a 1000 pb del lugar donde hemos reconocido la secuencia. ¿Problema? A saber qué hay en esos 1000 nucleótidos por tanto no se utilizan en ingeniería genética.
Enzima. Genero especie, cepa y número.
CLASE II.
Dos protes: 1. Hsd R: Restrictasa reconoce la secuencia, restringe 2. Hds M: metila y restringe Falta la de reconocimiento (Hsd S), pero cada una de estas protes tiene la capacidad de reconocer la secuencia.
Estos enzimas de restricción cortan en la secuencia que reconocen, por tanto, cuando cortamos sabemos lo que hay, son las que se utilizan en lab.
- La secuencia de reconocimiento es palindrómica.
Cuanto más pequeña es la secuencia más efectiva es la enzima.
El corte puede ser romo o cohesivo.
CLASE III y IV.
No sirven en el lab, por eso no están tan bien caracterizadas. No son tan extremas, pero cargan entre 25-27 nucleótidos de distancia entre la secuencia que reconocen.
Resumen del lugar de actuación de diversos sistemas de restricción.
• • I, III y IV, la metilasa o restrictasa va acompañada de HsdS que da la especificidad de reconocimiento de la secuencia.
II reconoce la secuencia y se produce en el mismo lugar.
Ejercicio, combinaciones de mutaciones en los sitemas de restricción-modificación de las clases I, III, IV.
Si inactivamos hsdS, inmediatamente la célula es (fenotipo) restricción menos metilación menos. El hecho de que aparezca otra secuencia incrementa el juego de posibilidades de posibles mutaciones excepto la de abajo que es letal, una celula que sea hsdS +, hsdR +, hsdM – es letal porque puede reconocer la secuencia, puede restringirla pero no puede metilrla, es una condición letal (a no ser que el mutante sea condicional). Letal porque se produce la degradación. Lo mismos sucede con los de clase II. La única combinación letal es la de abajo, hsdR +, y hsdM-, no metilaremos el DNA, la restrictasa que reconoce la secuencia detectará que no está metilado, como DNA no propio y por tanto restringirá.
Los sistemas de restrincción se pueden equivocar, imaginar que tenemos dianas no metiladas, y actúa la restrictasa. Imaginar que hay una metilasa que detecta la secuencia propia y se equivoca y metila una de las cadenas (antes no estaba ninguna metilada) entonces inmediatamente este DNA pasará a ser hemimetilado, y entonces la restrictasa no lo degradará por tanto este error significa que esta celula se “come” este dna que no será restringido, tendremos variablidad genética. Estos errores son la base del intercambio genético entre especies alejadas, son la base y el fundamento de evolución en células bacterianas y organismos superiores, porque si somos incapaces de incorporar nada será más difícil evolucionar.
Segunda hora.
Las enzimas de restricción son nucleasas, pero ¿endo o exo? Endo. Lo que hacen es buscar la secuencia, la encuentran, no está metilada, y hacen un corte. ¿Siguiente paso? En un organimo vivo, ¿qué pasa? Se detecta como DNA no propio y hacemos un corte, ¿cuál es el siguiente proceso? Se trata de eliminar este DNA que es extraño, ¿quien participa a continuación? RecBCD, que era una exonucleasa, la más masiva de las bacterias, exonucleasa V. Por tanto la restricción tiene dos etapas. Y después la degradación por parte de la exonucleasa, porque si no degradara, lo que acabamos de cortar la ligasa podría unirlo y no eliminamos el DNA. La actuación de la exonucleasa es debido a los extremos libres. Va ligado. Lo degradaría todo la exonucleasa.
La hsd R entonces es una endonucleasa.
Localización de los sistemas RM: En el cromosoma, PERO, hay sistemas de mod-res en plásmidos y bacteriófagos atenuados!! Por lo tanto, un sistema que esté en cromosoma tb puede estar presente en moléculas extracromosómicas que se muevan por conjugación (plásmido) o por infección (bacteriófago).
• Arriba: cepa de E. Coli lisogénica para el bacteríofago atenuado P1 es infectada por Landa, si no está modificado landa la mayoría serán degradados, pero el sistema se puede equivocar. Si sale una partícula de Landa, cuando salga de ahí saldrá con dos marcas, dos metilaciones diferentes, la K, y la P1(Porque el bact P1 tiene su sistema de mod- restric) y ahora este bacteriófago infecta una cepa de e coli K-12. Pregunta, ¿habrá restricción de este Landa? No, porque el sistema de restricción de K12 detectará la secuencia propia, ¿qué pasa? ¿Que además hay otra secuencia de otro sistema? Da igual, solo actúan por defecto de la secuencia, por tanto no habrá restricción.
• Abajo: Cepa de E. Coli, Landa infecta K-12, no está metilada y hay el error que hemos dicho, salie el K, landa tiene la secuencia K e infecta una cepa de e coli lisogénica para p1. Tenemos dos enzimas de restricción k12 detecta su secuencia como propia y no hará nada y el sistema P1, que buscará en landa su secuencia y pasarán dos cosas: 1. Que la secuencia propia de p1 no sea y no tenemos nada que restringir.
2. Que la secuencia de p1 esté, ¿la secuencia de p1 de este landa está modificada? No, por tanto cuando penetre dentro el landa, como esta célula tiene un sistema de metilación P1 buscará su secuencia, verá que no está modificada y restringirá el Landa.
Hay plasmidis y bacteriófagos que tienen sistema de mod.-restricción propios y esto hay que tenerlo en cuenta en el lab.
Diseñar la razón de un sistema de restricción si no supiéramos más de lo que sabemos. El sentido biológico es la defensa de las células bacterianas frente a infecciones de bacteriófagos.
El origen biológico es que hemos desenvuelto estos sistemas para escapar de la infección. Y el fago ha diseñado sistemas de defensa frente a nuestros sistemas de defensa. Esto se llaman sistemas de antirestricción. Tienen muchas utilidades. Es decir, sistemas de lo bacteriófagos para defenderse de las enzimas de restricción de las células. Estrategias de los fagos frente a los sistemas de modificación restricción: 1. Inhibición de las endonucleasas celulares, no solo las de restricción sino todas.
Garantiza su estabilidad.
2. Inducción de la sobreproducción de la metilasa del huésped (de la metilasa de restricción). ¿Por qué? Porque si hay más metilasa hay más error, más regiones hemimetiladas e inhibición de la restrictasa 3. Modificación de las bases del genoma viral: esencialmente metilamos citosinas, si hacemos una hidroxilación de citosinas dificultamos el reconocimiento de estas porque le colgamos un radical hidroxilo y dificultamos el reconocimiento de la secuencia entonces inducimos a que la célula acabe por no reconocer las secuencia y no habrá restricción.
4. Ausencia de las secuencias de restricción del huésped del en el genoma viral.
Ejemplo: DNA del fago H2 en todo su genoma a nivel evolutivo se ha seleccionado que no haya ni una sola copia de la secuencia GGATCC, por tanto, tiene inmunidad total a la hora de infectar esta cepa.
5. Nosotros buscamos una secuencia donde están metiladas A y C por tanto hay bacteriófagos que fabrican metilasas que comienzan a metilar todas sus A y Cs, por tanto, estamos metilando secuencias de restricción y por tanto inhibiendo metilasas.
Sistema Mcr/Mrr Estrategia de anti-antirestricción, ¿quien la hace? Las células bacterianas. Es un sistema de defensa de las bacterias frente a un mecanismo de defensa de los fagos frente a las bacterias.
¿En qué consiste? No tiene metilasas, no modifica, lo que hace es restringir, va recorriendo cualquier DNA que haya en su citoplasma y cuando hay una hipermetilación de A o C, se da cuenta de que le quieren dar gato por liebre, xd eso no es suyo entonces inmediatamente restringe.
Los bacteriófagos han desenvuelto sistemas de anti-anti-antirestricción D: que consiste en eliminar la actividad de estas endonucleasas. Este sistema Mcr tiene consecuencias prácticas, ¿característica que diferencia el DNA procariota del eucariota? El eucariota está hipermetilado, por tanto, al meterlo en e coli, este sistema puede que lo degrade poco, estos experimentos se han de hacer en E coli que son Mcr o Mrr – para disminuir la eficiencia del sistema.
...

Comprar Previsualizar