T2. EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR (I) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Microbiología - 3º curso
Asignatura Epidemiologia de les malalties infeccioses
Año del apunte 2016
Páginas 9
Fecha de subida 04/04/2016
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EPIDEMIOLOGIA DE LES MALALTIES INFECCIOSES Marcadores geneticos aplicados al estudio de la Epidemiologia Epidemiologia molecular: Se trata de una sinergia, conjunción entre el estudio de la epidemiologia de una infección o colonizacion mediante la caracterizacion molecular del agente etiológico. Esto se hará mediante métodos de tipificación que van a intentar responder a determinadas preguntas epidemiológicas.
Con estos métodos de tipificación podremos saber cual ha sido el origen, por que vehículos se ha transmitido ese brote i cuales son los factores de riesgo de ese brote.
Lo mismo pasa con ciertas enfermedades endémicas, que están instauradas en una región o las nosocomiales, que son las internas a un centro hospitalario que están siempre colonizados por algún agente. Si alguien se contamina por algún agente de estos por estar mucho tiempo en el hospital por ejemplo, podemos identificar reservorio, los patrones de colonización o infección y los modos de transmisión desde el origen hasta la persona. Son métodos epidemiológicos que por diferentes métodos de tipificación, podemos llegar a relacionar.
Esto no va solo, no solo comparamos los aislamientos y vemos cuales son iguales o diferentes, sino que además tenemos que integrar los datos epidemiológicos y compararlos con lo que nos dé el método molecular.
Conceptos básicos: Aislamiento ! ‘isolates’. Aunque hay autores que lo usan como otros conceptos, se trataría en principio de un cultivo puro obtenido desde una colonia y que procede de un único organismo/bacteria. Cuando hay que tipificar, siempre se realitza a partir de un cultivo puro.
Tipo ! patrón o perfil especifico del aislamiento que vamos a caracterizar y que se ha obtenido por la aplicación de uno o varios métodos de tipificación.
El perfil de resistencias, por ejemplo, es el antibiotipo.
Cepa ! ‘strain’. Todo el conjunto de aislamientos que una vez tipificados por una técnica, son iguales entre si y les permite diferenciarse de otros aislamientos de la misma especie. Tienen que presentar el mismo patrón formando así una cepa y que serán distintos a otros de la misma especie. Se refiere a un componente filogenético, en un periodo largo de tiempo.
Clon ! hay gente que confunde o usa de manera igual, cepa, aislamiento o clon cuando no tienen el mismo significado. Se parece a cepa pero se refiere a los aislamientos, que una vez tipificados, independientemente del tiempo, de la región en la que han sido tipificados y de las características fenotípicas o genotipicas, denotan un origen común.
1 EPIDEMIOLOGIA DE LES MALALTIES INFECCIOSES Para escoger un método de tipificación cuando vamos a hacer un estudio, nos fijamos en unos criterios anteriores pero si no disponemos de ellos, tenemos los criterios de eficacia y eficiencia que hay que cumplir.
Criterios de eficacia: - Tipabilidad ! que una técnica produzca un resultado claro, de cada aislamiento estudiado, fácil de reproducir e interpretar.
- Reproducibilidad ! que de el mismo resultado cuando lo reproducimos en ensayos diferentes y separados. Si con la misma muestra, repito es repititibilidad que no es lo mismo de lo que estamos hablando ahora.
Repetitivo seria con la misma muestra mientras que reproducible, volvemos a reproducir todo el proceso.
- Poder discriminativo ! que esa técnica nos permita decir que son diferentes cepas que no están relacionadas entre si y que son de la misma especie bacteriana. Una técnica con bajo poder discriminativo, no nos permite diferenciar entre las cepas mientras que una técnica con alto poder discriminativo, si.
- Concordancia epidemiológica ! nos permite diferenciar aquello que no tiene relación según su origen epidemiológico. Es decir, que concuerde con el origen - Estabilidad ! reconocer la relación clonal entre cepas con precursor común a pesar de las variaciones ocurridas in vitro o in vivo (espacio/tiempo).
Permita establecer relación entre los métodos aplicados a pesar de los cambios que se pueden dar y de los pasos que tengas que hacer y asi te pueda permitir diferenciar con la variabilidad del microorganismo que si es poca, no tiene por que variar la técnica.
Criterios de eficiencia: - Facilidad de uso ! que los resultados los obtengamos de forma fácil y me permita estudiar un gran numero de cepas.
- Flexibilidad ! tipificar el máximo numero de especies con el minimo de modificaciones - Rapidez ! variable (horas-semanas) - Accedibilidad ! disponibilidad y coste y la cualificación técnica necesaria.
Se complementan unos criterios con otros.
Como métodos de tipificación o caracterización hay de dos tipos: - Fenotipo: aquel producto origen de la expresión de varios genes.
Caracterizar el anticuerpo en la membrana de un organismo por ejemplo. Pero estos, alguna de las características que hemos visto, no 2 EPIDEMIOLOGIA DE LES MALALTIES INFECCIOSES la cumplían. Para poder hacer los estudios de forma mas rápida o simple.
- Genotipo: estudiando el genoma de un organismo (hongos, bacterias o levaduras). Se estudia DNA cromosómico o plasmidico. El plasmídico para estos estudios de epidemiologia molecular se ha dejado de utilizar, y nos basaremos en el DNA cromosómico. Lo que obtendremos es la huella genética o ‘fingerprinting’ que será un patrón o código de barras o un código genético. Es como si comparamos códigos de barras.
Veremos métodos genotípicos basados en la restricción del DNA, basados en una restricción que es el ribotipado. La seguida de una PCR que es la AFLP, la macrorestriccion. Luego también según la amplificación del DNA (PCR) y la PCR y secuenciación.
Metodos genotípicos 1. Restricción de DNA: Nos permitirá un polimorfismo del tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP). Cuando restringimos DNA puede ser cromosómico, plasmidico o un producto de PCR para luego ser comparado, a todo eso se le llama RFLP.
Para digerir el DNA utilizamos unas proteínas, enzimas de restricción que para cortar, necesitan una secuencia especifica en la secuencia de DNA. Hay los de alta y baja frecuencia de corte ya que depende del porcentaje de GC del microorganismo, el porcentaje de GC de la secuencia y además también influye la medida, la alargada del fragmento. En función de la técnica usaremos una u otra.
1.1.Restricción de DNA + Southern blot Usaremos las de alta frecuencia de corte, de manera que tendremos un monton de bandas. Para simplificarlo, se invento la restricción con una técnica de hibridación. Se da una electroforesis horizontal…. Luego obtenemos una sonda marcada de forma fría con un método colorimétrico, hacemos la hibridación y luego revelo. De todo el perfil de bandas, pasamos a tener un perfil más simplificado después de la hibridación, entonces podemos comparar. La técnica se llama ribotipado. La metodología es la misma pero la diferencia es en la procedencia de la sonda. La sonda en este caso, procede de zonas conservadas del RNA 16S que son genes que están altamente conservados en la mayoría de especies bacterianas. Obtenemos la sonda y es la que marcaremos y utilizaremos para hibridar. Si nos vamos a caracterizar los criterios de los que hemos hablado antes, es muy reproducible pero tiene una baja capacidad de discriminación por la característica intrínseca de la técnica, basada en el RNA y hay pocas copias.
La posibilidad de que salgan diferentes bandas, es muy difícil por su posición conservada. Además es muy laboriosa. Aun así, se vió su potencial y se ha 3 EPIDEMIOLOGIA DE LES MALALTIES INFECCIOSES desarrollado el riborpinting que lo hace de manera automática. Ademas tiene una base de datos de perfiles y va comparando. 
 1.2.Macrorestricción de DNA + PFGE No hay técnica que lo haya desbancado todavía como método de restricción del DNA. Tiene que ir junto. Macrorestricción, es decir, digerimos el DNA muy poco de manera que obtenemos bajo numero de bandas pero son de alto peso molecular. Para ello, usamos enzimas de baja frecuencia de corte, que las GC no coincidan con las del microorganismo a estudiar. Permite explorar el genoma completo y es la técnica gold standard a nivel mundial.
Cuando se vieron las cualidades de la técnica, se creó una red donde se ha ido modificando y simplificando los protocolos y se pueden meter los datos de tus resultados y puedes saber si hay algún microorganismo que tiene el mismo patrón que el tuyo.
Los fragmentos se separan porque son muy grandes. El DNA migra por su carga hacia los polos. Para separarlos, en este caso, usamos la electroforesis de campo pulsante que se basa en la alternancia de campo eléctrico. Se pone en marcha el campo eléctrico una vez cargada la muestra, luego se para y se vuelve a aplicar hacia el otro lado de manera que el DNA se tiene que ir redireccionando permitiendo asi, separar y resolver fragmentos tan grandes. El tiempo y los cambios de campo eléctrico es lo que se llama pulso.
Cuando los fragmentos son más grandes, los pulsos serán más largos que en los fragmentos más pequeños.
Nos tenemos que asegurar que lo que vemos son fragmentos de la restricción y no por roturas del DNA, de manera que se hace todo dentro de un bloque de agarosa. Todo lo que queremos comparar tiene que tener la misma densidad óptica, se hace una centrifugación, unos lavados y se mezcla todo con una agarosa especial que la pondremos en unos moldes y se deja refrigerar. La agarosa, se habrá previamente disuelto antes de mezclar con las células.
Luego se crearan los moldes. Para liberar el contenido, con un tampón lisaremos las paredes, y añadiremos alta concentración de edta que hará que las células liberen el DNA que quedará en la agarosa. Cogemos un trozo de agarosa dentro de los que habrá el DNA y hacemos ahí la digestión.
Cuando cogemos los insertos de 1cm de largo, se hace un lavado para eliminar restos celulares i para hacer la digestión con la enzima que hayamos escogido, lo que se hace es colocar el inserto en un cubre, y se hace un corte recto para que no se distorsione y muy pequeño. Eso lo pondremos en un eppendorf con un buffer que tendrá el enzima de restricción.
Después preparamos el gel de agarosa especial para campo pulsante. Los poros de agarosa, son muy grandes comparado con los normales, de manera que como los fragmentos son grandes, pueden pasar a través. Para cargar el inserto se hacer con la ayuda de una pipeta Pasteur. Se coloca por encima un 4 EPIDEMIOLOGIA DE LES MALALTIES INFECCIOSES poco de agarosa fundida para que no se salga el inserto y luego el gel. La cubeta de electroforesis, tiene un marco donde se sumerge el gel en la cubeta. Esta cubeta tiene 24 electrodos alrededor del gel de manera que al ir cambiando la dirección del campo, se iran redireccionando los fragmentos, irá cambiando el campo eléctrico.
Es una maquinaria compleja, y además salen unos tubos debido a que el tampón en el que esta sumergido el gel, tiene que estar recirculando continuamente porque las carreras pueden durar hasta 18h. Presenta un tampón de enfriamiento porque si no pasadas las 18h se habría calentado mucho.
Lo que se obtiene es un perfil de bandas, con los marcadores. Tenemos perfiles indistinguibles que son el mismo pulsotipo o perfiles distinguibles en diferentes bandas que son diferente pulsotipo (número y posición de bandas).
Los cambios si comparamos con un perfil fijo, pueden darse mutaciones al azar en el genoma que den una diana más de restricción o que elimine una diana de restricción. Entonces veríamos diferencias en las bandas, podría aparecer bandas nuevas si aparecen dianas o menos si se eliminan. Si en cambio, se ha dado una inserción o deleción de bases en el genoma, eso daría un cambio de dos bandas, desaparece una y aparece otra o al revés.
Si lo tenemos así en un gel y tenemos pocos aislamientos, es fácil verlo. Pero cuando hay muchos aislamientos y hay diferentes geles, es difícil, por lo que se usan software para que dependiendo del peso, sabremos el tamaño de la banda. Lo pone numéricamente para cada banda y luego los compara 2 a 2, generando automáticamente las diferencias de bandas. Pero se necesita un número para que vaya comparando. Para eso se usa un coeficiente de similitud y el más usado en epidemioloiga molecular es el coeficiente de Dice que depende de la posición de bandas. Depende de patrones. Se cuentan las bandas comunes y se divide entre el número total de bandas que tienen ambos perfiles y x2. Se crea un % de similitud entre los 2 comparados. Crea así, comparando 2 a 2, una matriz de similitud, donde el color negro indica 100% similitud i el blanco la diferencia.
Esto es difícil de estudiar. Hay otro software que agrupa desde un 100% hacia menos, esa matriz y genera un dendograma. Todos los pulsotipos que están dentro de la región negra, es que tienen una similitud del 100%. Y asi sucesivamente.
Se dijo, que a partir de más de 6 bandas de diferencia, que es alrededor de un 80%, se considera como diferente organismo. Más adelante, se ha visto que no siempre es así, cualquier variación de banda se considera distinta cep Como resumen, como ventaja respecto a los criterios, se puede aplicar a la mayoría de microorganismos, permite explorar el genoma completo porque genera pocos fragmentos pero grandes, el resultado se interpreta fácilmente 5 EPIDEMIOLOGIA DE LES MALALTIES INFECCIOSES y respecto a los criterios, los cumple ampliamente, tiene alto poder discriminativo. Es importante destacar que el poder discriminativo depende del enzima y no de los campos.
Como inconvenientes, es laboriosa, puede ser de difícil manipulación, el aparato es costoso y aunque hay software de interpretación, a veces hay que saber interpretar, requiere un entrenamiento.
Un ejemplo de la capacidad discriminativa según el enzima. Vemos un dendograma a partir de un enzima, y se ven los casos de un brote y casos aislados que no tiene que ver con el brote. En cambio, aunque no tenga nada que ver, vemos que sale un 100% de homología. Probaron con otro enzima y se vio que con esta, si que cambiaba la homología. Ya hemos visto que esto podía cambiar por mutaciones. 
 1.3.RFLP + PCR ! AFLP Amplificación mediante PCR de fragmentos de restricción de DNA genómico. Hacemos restricción y luego amplificación.
En este caso, el DNA cromosómico se digiere con enzimas de alta y baja frecuencia de corte y seleccionas los que tienen en un extremo una diana y la otra.
Se hace una ligación y formas fragmentos que están adaptador – adaptador que conocemos y la diana de alta y baja frecuencia. Como queremos perfiles a comparar fácilmente, hacemos una primera PCR cuyos primers son del adaptador que conocemos, la de la secuencia diana y la de otra base.
Hay una PCR adicional donde coges lo anterior como molde, el primer es el mismo pero en cada extremo, añades 2 bases más. De manera que se unirán solo a aquello que presente el adaptador, la diana y las bases que has escogido.
Uno de los primers está marcado con fluorescencia. Se obtienen diferentes tamaños porque lo del medio, será de diferente distancia siempre.
Por tanto, lo que tenemos después de la PCR son fragmentos de diferente tamaño. Esto se desneutraliza y se carga en un secuenciador. Se realitza una electroforesis donde se ve en un solo canal (1 único fluoróforo) los distintos picos o patrón de bandas. Suelen añadirse marcadores de peso molecular.
Alta reproducibilidad y la capacidad discriminativa es alta ademas de ser rápido también. Como inconvenientes, necesitas un secuenciador, de manera que si no tienes el aparato es costoso. Ademas puede ser difícil de interpretar.
6 EPIDEMIOLOGIA DE LES MALALTIES INFECCIOSES 2. Tecnicas de secuencación:
 2.1.PCR con cebadores arbitrarios ! RAPD Solo una reacción de PCR. Se usa un poco para limpiar, antes de usar la de campo pulsante. Es una técnica muy fácil, extraemos el DNA y hacemos una PCR. Es un cebador arbitrario porque no son específicos, puede ser el que quieras. La temperatura de hibridación es baja (40ºC) para que el cebador se vaya uniendo de manera indistinta en diferentes fragmentos y diferentes orientaciones. La amplificación de regiones del genoma por lo tanto, son al azar (distancia y orientación apropiada).
Como inconvenientes: se necesita una estandarización previa para que los resultados sean reproducibles, las bandas de igual tamaño pueden ser secuencias distintas, baja reproducibilidad por la baja temperatura de hibridación y por los cebadores arbitrarios.
Se producen fragmentos de diferentes tamaños. En el mismo termociclador se carga el gel el mismo día. Luego se compara.
2.2.PCR secuencias repetidas (REP – PCR/ ERIC – PCR) Son secuencias de diferente tamaño, palindrómicas extragénicas repetitivas.
Es una PCR pero en este caso, los primers se diseñan hacia afuera de lo que se conoce. La secuencia repetida varia en número y orientación. Conforme se orienten, se amplifica lo que está en medio de las secuencias repetidas. La temperatura de hibridación es la que le toca al primer, pero se generan fragmentos de diferentes tamaños.
Se realitza después una electroforesis convencional y un software va dando valores a las diferentes bandas y los compara 2 a 2.
Es un método rápido como el anterior, es muy simple porque podemos estudiar esos cebadores para estudiar lo que queramos. Como problemas, hay veces que es difícil de interpretar, pueden aparecer bandas débiles y la reproducibilidad, pasa igual que antes, se tiene que hacer en un mismo termociclador y hacer el gel el mismo dia. Pero como es tan simple, lo que es diferente aquí, no hay que estudiarlo por campo pulsante y si es igual si. Son técnicas de cribaje.
Se ha generado el labora-chip que son materiales con micro panales que se realizan en el interior como pozos donde se cargan las muestras. Aquí dentro se hace la PCR, el gel de agarosa y el resultado final que te lo dan, como los primers son marcados, como un electroferograma. Se pueden poner hasta 13 muestras. El resultado se obtiene en 2-3h 7 EPIDEMIOLOGIA DE LES MALALTIES INFECCIOSES 2.3.PCR secuencias repetidas MLVA (VNTR) Secuencias repetidas en tándem, variables en numero (VNTR). El estudio de estas secuencias en un solo locus es VNTR y en multilocus es MLVA. Extraigo el DNA y hago una PCR y las parejas de primers, son de la zona flanqueante donde sabemos que esta la secuencia repetida.
El tamaño es muy pequeño, se usa un secuenciador y uno de los primers esta marcado. Aquí lo que se compara es un código numérico en función de la variación de las bases repetidas en las cepas. Lo que comparas aquí en vez de fragmentos, son los números que obtienes y en función de las diferencias, se genera el dendograma igual.
Se carga el secuenciador con un marcador de pesos, y cargas las secuencias.
El producto marcado, se puede secuenciar.
Es un método rápido, simple técnicamente y automatizado porque es el termociclador y el secuenciador ademas del software. Como inconveniente, tienes que hacer un estudio completo del genoma, para buscar las secuencias repetidas y diseñar los cebadores que amplificaran esas secuencias.
Pero se esta pensando porque, que no este automatizado, interviene mucho la subjetividad de la persona que interviene, del investigador. En cambio, aquí al ser automatizado es lo que sale. Es más objetivo.
3. PCR + secuenciación
 3.1.Multilocus sequence typing (MLST) Lo que se estudia es un determinado numero de genes que son los housekeeping, tienen una expresión constitutiva, suelen ser genes metabólicos y conservados dentro una misma especie. Nos da un dato directo del genoma, no hay que hacer una interpretación.
Tenemos los aislamientos, extraemos el DNA. Para ciertas cepas que no se pueden tipificar por campo pulsante, se pensó en esta técnica. En función de la especie bacteriana, se han buscado los genes housekeeping, normalmente 7 o 8 genes, amplificas en los aislamientos y secuencias por Sanger, secuenciación normal.
Por cada gen, vas viendo respecto una secuencia, las variaciones alélicas respecto una secuencia tipo. Se obtiene un código numérico.
Como ventajas, Presenta un buen nivel discriminativo, es un análisis objetivo que permite un intercambio fácil de datos. Además, es adecuado para estudios filogenéticos y permite su utilización en muestras clínicas directas.
8 EPIDEMIOLOGIA DE LES MALALTIES INFECCIOSES Como inconvenientes, es laborioso, con un equipamiento específico y costoso.
Además hay una dificultad en la selección de los genes de estudio.
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