TEMA 3. FAMÍLIES GÈNIQUES PRINCIPALS IMPLICADES EN LA REGULACIÓ, GENS EINA (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia del Desenvolupament
Profesor I.S.
Año del apunte 2015
Páginas 9
Fecha de subida 21/03/2015
Descargas 46
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 3: FAMÍLIES GÈNIQUES PRINCIPALS IMPLICADES EN LA REGULACIÓ, GENS EINA (L’ordre dels temes per a Isaac Salazar, en la seva immensa saviesa, no té absolutament cap sentit).
Hòstia! Però si és una mosca amb quatre ales! + I què passa? Normalment els insectes tenen el cap, el tòrax (amb la part anterior, mitja i posterior) i l’abdomen. I quatre ales. Però justament els dípters, dels quals forma part la mosca, tenen dues ales.
+ Guau! Llavors què ha passat per què en tingui quatre? - Al laboratori de tant en tant apareixen mosques amb quatre ales. A més, tenen el segment 3 com el 2, en comptes de tenir-lo diferent.
 És a dir, és un mutant oi? - Sí. A vegades també s’han vist mutants els quals tenen unes antenes sensitives al cap.
Normal Mutant (antenes al cap)  Ostres, això de que surtin ales on no toca, antenes on no toca... sembla que els dos siguin un mateix tipus de mutant.
- Efectivament. A aquests mutants se’ls anomena mutants homeòtics, ja que els gens mutats són els gens homeòtics o gens hox.
LOCUS HOMEÒTIC Els gens homeòtics estan implicats en la regulació del desenvolupament dels animals. La família dels gens Hox és el conjunt dels gens homeòtics. Com funcionen? Els gens homeòtics codifiquen per proteïnes que actuen com a factors de transcripció d’altre gens que dirigeixen el desenvolupament de diferents segments corporals i indiquen quines estructures s’han de desenvolupar (per exemple, en Drosophila, antenes al cap, potes en els tres segments toràcics...).
Tots els gens homeòtics contenen una seqüència anomenada homeobox. Aquesta és una seqüència molt conservada d’uns 180 bp que codifica per uns 60 aminoàcids que conformen l’homeodomini. Aquest és un domini de la proteïna que permet la unió al DNA, i per tant que pugui dur a terme l’acció de factor de transcripció. Les proteïnes que tenen homeodomini s’anomenen homeoproteïnes.
Estructura d’una homeoproteïna.
Tots els gens amb homeobox tenen un origen comú, per tant tenen homologia. La majoria dels gens hox tenen dos exons, i en l’exó 2 és on es troba la seqüència homeobox.
Els gens Hox actuen en el control del desenvolupament de l’eix antero-posterior (cap-cua) de diversos organismes multicel·lulars (artròpodes i vertebrats, sobretot en tunicats). Els factors de transcripció expressats pel conjunt de gens Hox s’encarreguen de regular la morfogènesi i la diferenciació cel·lular durant el desenvolupament embrionari primerenc, i tot i que el patró d’expressió d’aquests gens comporta ajustos complexos conforme el desenvolupament va progressant, en cada cèl·lula el complex Hox actua com un segell o marca de registre permanent de la posició que ocupa la cèl·lula en l’eix antero-posterior de l’embrió. D’aquesta manera, les cèl·lules sempre estan equipades amb un valor posicional.
COMPLEXOS HOX Els gens Hox es troben agrupats en els complexos Hox. Hi pot haver més d’un complex Hox en el genoma, per exemple, els ratolins tenen quatre complexos: Hox a, b, c i d. Aquests complexos han estat originats per duplicacions dels gens, i les dues característiques més importants són: - Hi ha col·linealitat (espacial i a vegades temporal).
Els gens Hox d’un mateix complex es regulen entre si.
Col·linealitat Els complexos Hox tenen un patró d’expressió seqüencial extremadament regular. La seqüència en la que estan ordenats els gens en el(s) cromosoma(es) correspon exactament a l’ordre en que els gens s’expressen al llarg de l’eix antero-posterior del cos. És aquest fenomen el que s’anomena col·linealitat. Els gens que es troben més popers a l’extrem 3’ són els que s’expressen a l’extrem anterior (cap) i els que es troben a l’extrem 5’ s’expressen a l’extrem posterior (cul).
La col·linealitat només s’observa en vertebrats i alguns insectes, entre ells Drosophila. En Drosophila només observem la col·linealitat espacial, que és la que hem explicat. En humans, però, a part d’aquesta, també hi ha col·linealitat temporal: els gens de l’extrem 3’ s’expressen primer i els de l’extrem 5’ són últims en expressar-se.
La col·linealitat suggereix que els gens s’activen en sèrie per algun procés gradual (en duració o intensitat) al llarg de l’eix del cos. L’acció d’aquest procés s’estén gradualment al llarg dels cromosomes. Generalment, domina l’expressió de l’últim gen que s’ha expressat, és a dir, el situat més a prop de l’extrem posterior o 5’, ja que aquest inhibeix l’expressió dels gens més “anteriors” (o propers a l’extrem 3’) activats prèviament.  Regulació de l’expressió entre els gens dins del mateix complex Hox.
Per què pugui passar això, per tant, és necessari que els gens homeòtics es trobin agrupats en complexos Hox. Hi ha un quantitat considerable de gens que presenten la seqüència homeobox però que no es troben agrupats en complexos, sinó que es troben dispersos per tot el genoma.
Tot i que exerceixen alguns efectes similars, no podem parlar de col·linealitat com parlàvem amb els gens dels complexos Hox.
Posició dels gens Hox al llarg del cromosoma i la corresponent zona del cos de Drosophila melanogaster on s’expressen.
Complexos Hox dels ratolins i la seva expressió corresponent en l’embrió.
En ratolins (vertebrats) si alterem alguns gens homeòtics, hi ha parts anterior o posteriors que no es formen (per exemple, una vèrtebra; les vèrtebres estan molt afectades pels gens homeòtics, ja que canvia la seva morfologia segons en quin punt de l’eix antero-posterior es troben). Si alterem gens homeòtics en Drosophila (artròpodes), els gens alterats s’expressaran en llocs diferents dels que els toca, i per tant es crearan estructures en llocs del cos on no haurien de crear-se (tot i això, hi ha límits, no es poden intercanviar tots amb tots).
A més de la col·linealitat amb l’eix antero-posterior, també hi ha gens hox que s’expressen més o menys en funció de quin punt de l’avantbraç es troben.
La col·linealitat, però, només s’observa en artròpodes i vertebrats, però no en els grups que filogenèticament estan entre aquests dos.
A vegades, però, podem veure un fenotip que sembli que sigui resultat d’una mutació en gens Hox, però que en realitat es degui a una alteració de l’ambient. Si en un moment determinat del desenvolupament de les larves de Drosophila se’ls posa èter a l’ambient durant un cert període, aquestes larves creixen amb quatre ales. Això es deu a que el cos de l’adult es desenvolupa a partir d’unes poques cèl·lules de la larva, els discs imaginals, que són unes invaginacions de l’epiteli de la larva. L’èter fa que aquests discs imaginals creixin molt més del normal, i per això apareixen més ales.
De manera que a vegades podem veure fenotips que ens facin pensar en una mutació als gens Hox, però la raó que hi hagi al darrere sigui una altra.
Exemples de la col·linealitat en mosques, ratolins, i un exemple amb vèrtebres: Esquema que ens mostra com de general és la col·linealitat dels gens hox entre diferents grups: MÈTODES EN BIOLOGIA DEL DESENVOLUPAMENT Per estudiar quina funció tenen certs gens en el desenvolupament, es poden fer diverses alteracions en aquests per veure quin efecte té l’alteració sobre el procés. A partir d’aquest efecte podem intentar saber la funció del gen en qüestió.
Quines alteracions es poden fer? TÈCNIQUES D’ALTERACIÓ TRANSGENS - Knockout (KO): s’inactiva un gen perquè no es pugui, per veure què passa quan no hi és.
- Knockouts condicionals: són construccions en les quals modifiquem només el promotor del gen que volem estudiar, de manera que nomes és knockout quan s’afegeix un factor determinat a l’ambient que actua sobre el promotor modificat i fa que s’inactivi el gen.
Podem fer que aquest gen s’inactivi quan nosaltres vulguem. Això va bé per si aquest gen és necessari en alguna etapa i per tant no podem inactivar-lo durant tot el procés.
- Posar davant un gen el promotor d’un altre gen. Així, ara el primer gen s’expressarà com el segon i en els mateixos moments.
Exemple 1: si al gen del FC1 (Factor de Creixement 1) se li posa el promotor del gen del FC2, el FC1 s’expressarà igual i en el mateix moment que el FC2, però es trobarà en el lloc on se sol expressar.
Exemple 2: s’agafen gens homeòtics de ratolí i s’introdueixen a Drosophila sota els promotors de gens homeòtics de Drosophila, de manera que s’expressin tal i com ho farien els gens homeòtics d’aquesta espècie.
- Agafar un gen i canviar algunes parts de la seqüència per canviar alguns dominis funcionals de la proteïna. Per exemple es pot canviar el domini d’unió al DNA. Així es pot interferir en interaccions concretes entre productes gènics.
TRANSPLANTAMENTS I ABLACIONS VIA AGULLES LÀSER Es tallen alguns llavis (invaginacions de cèl·lules) que es formen a l’embrió. Llavors veiem que no es forma res. Si es fica aquest llavi en un altre embrió, que ja té un llavi pot passar que: - Si els dos llavis estan a la mateixa distància (a l’equador de l’embrió) es creen dos capgrossos siamesos per la panxa.
- Si els dos llavis es troben més junts que l’equador, un dels capgrossos creix més gran que l’altre.
Això es pot fer en cèl·lules individuals o en grups de cèl·lules.
FÀRMACS Es poden posar fàrmacs que interfereixen en els processos de les cèl·lules en embrions. Per fer això s’ha de saber com actuen els fàrmacs i els processos que inhibeixen per no matar les cèl·lules. Els exemples clàssics són: - Colxicina: inhibeix la polimerització dels microtúbuls, per la qual cosa s’inhibeix el cicle cel·lular.
- Ciclopamina: aboleix la via de senyalització d’un factor de creixement. Si es posa ciclopamina directament a l’embrió o s’injecta a la mare les senyals específiques no es transmeten. Com podem controlar la dosi, podem fer que aquesta via de senyalització d’un determinat factor s’activi molt, poc o gens.
S’anomena així perquè es va observar que si es donava aquesta substància a vaques perquè produïssin més, aquests tenien només un ull (eren ciclops).
INJECCIÓ DIRECTA DE PRODUCTES GÈNICS Si volem estudiar l’efecte de certs factors de creixement i altres productes gènics, podem: - Injectar-los directament en alguna part de l’embrió.
Posar-los en el medi de cultiu.
Incloure’ls en la dieta de la mare o directament injectar-li a la sang perquè arribin a l’embrió.
Fer una microinjecció de virus.
Els avantatges d’aquest mètode són que tenim un control quasi absolut de l’espai o el temps (o els dos alhora). Els desavantatges són que utilitzem rangs de territoris que no apareixen naturalment a l’embrió.
(Si algú té problemes per entendre algunes coses d’aquest punt, tal i com em passa a mi, no patiu, simplement és que no arribeu a l’altura del gran Isaac Salazar i sou incapaços d’entendre la seva magnífica i elaborada prosa i capacitat de paraula).
TÈCNIQUES DE VISUALITZACIÓ HIBRIDACIÓ D’RNA IN SITU Es fa amb una sonda de RNA. D’alguna manera es marca aquesta sonda i s’introdueix a les cèl·lules, de manera que hibrida amb els mRNA expressats en aquesta cèl·lula. Si fem una sonda de RNA complementària d’un gen, i aquest s’està expressant la cèl·lula, la sonda hibridarà i llavors observarem el marcatge en aquesta cèl·lula. La gràcia d’aquesta tècnica no es veure si el gen s’expressa o no, sinó veure on s’expressa.
Depenent de com sigui l’embrió, pot ser que la sonda d’RNA no acabi de penetrar a tot l’embrió, o pot ser que segons la resolució del microscopi no s’aconsegueixi veure bé. Per que es pugui observar millor i la tècnica sigui òptima, es fan seccions i la sonda s’aplica sobre aquestes.
Visualització in situ amb hibridació en tot l’embrió.
Visualització in situ amb hibridació en seccions.
IMMUNOQUÍMICA En aquest cas, es fan servir anticossos marcats que reconeixen productes gènics. De la mateixa manera que abans, si s’introdueixen en una cèl·lula i el producte gènic al qual s’uneixen hi és, es veu la cèl·lula marcada, i podem saber on s’ha expressat aquest producte. Com abans, aquesta tècnica també es pot fer en tot l’embrió o per seccions.
Visualització in situ amb immunoquímica en tot l’embrió.
És important entendre que tot i que funcionen de manera molt semblant, el que observem en la hibridació amb RNA i en la immunoquímica no és exactament el mateix. Amb la hibridació veiem on es troba l’mRNA que ha expressat un gen, però aquest no està necessàriament al mateix lloc que els productes gènics (proteïnes). De fet, pot ser que la cèl·lula rebi senyals que facin que reguli l’expressió d’un determinat gen justament en la seva traducció, de manera que podem veure la hibridació de mRNA, però no es marca amb la immunoquímica perquè l’mRNA no s’ha arribat a traduir.
TRANSGENS Volem estudiar un gen que s’associa a processos cel·lulars que ens interessen. Per visualitzar les proteïnes per les quals codifica podem fer servir proteïnes com la GFP o la RFP (Green Fluorescent Protein i Red Fluorescent Protein). Si posem el gen que codifica per aquestes proteïnes just al costat del gen que ens interessa, quan aquest es tradueixi, aconseguirem la proteïna que ens interessa estudiar unida a la GFP o la RFP, de manera que observarem fluorescència de color verda o vermella allà on es trobi aquesta proteïna.
Si només volem saber el moment en que s’expressa un gen, podem posar el gen de la GFP, la FRP o el gen lac (o qualsevol altre gen indicador) sota el promotor del gen que ens interessa estudiar. Llavors, el gen indicador s’expressarà en el mateix moment que ho faci l’altre, i ho podrem detectar perquè veurem fluorescència, o que es degrada la lactosa...
FATE MAPS En català s’anomenarien mapes de destí cel·lular. S’utilitzen per entendre i caracteritzar l’origen de diferents teixits en organismes adults a partir de cèl·lules individuals o grups de cèl·lules en algun estadi del desenvolupament embrionari.
Tècnica: es tenyeixen grups de cèl·lules d’una regió específica de l’embrió amb colorants vitals (que no perjudiquen ni a les cèl·lules ni a l’embrió). Aquests colorants vitals es mesclen amb agar en un portaobjectes, i es deixa que s’assequi.
Posteriorment es tallen trossets molt petits per aplicar-los a diferents regions de l’embrió, i permetre que el color entri a les cèl·lules que ens interessen, per després poder seguir els seus moviments, i veure quin és el seu destí cel·lular.
Aquest és un Fate Map. En un embrió s’han marcat de colors diferents diverses regions. El que està escrit dins de cada regió són els teixits en els quals es convertiran posteriorment.
Aquesta tècnica permet establir mapes de destí cel·lular bastant precisos, i un estudi relativament fàcil de la morfogènesi.
Els mapes de destí cel·lular es poden fer també amb proteïnes fluorescents, com la GFP o la RFP, en comptes de fer-ho amb colorants vitals.
Les somites són estructures segmentades, formades als dos costats del tub neural durant el desenvolupament embrionari a partir del mesoderm paraxial o mesoderm dorsal somític. Tot i que són estructures transitòries, tenen un rol important en la organització del patró segmentari en els embrions dels vertebrats, ja que donen origen a les cèl·lules que formaran les vèrtebres i les costelles, la dermis de la pell dorsal, els músculs esquelètics de l’esquena i els de la paret corporal i les extremitats.
MICRO-CT SCANNER DE RAIGS X Permeten aconseguir imatges d’alta resolució dels embrions: MESURAR FORCES És la última tècnica que s’ha descobert: ...