T.5, Mètodes d’estudi de les cèl·lules (II) (2013)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 1º curso
Asignatura Biología Celular
Año del apunte 2013
Páginas 20
Fecha de subida 30/03/2015 (Actualizado: 30/03/2015)
Descargas 8
Subido por

Vista previa del texto

T. 5 Mètodes d’estudi de les cèl·lules (II) FRACCIONAMENT CEL·LULAR És una tècnica bioquímica utilitzada per separar els diferents orgànuls i components cel·lulars per al seu estudi. La tècnica s'inicia amb l'homogeneïtzació. El teixit es tritura en un homogeneïtzador de manera que les cèl·lules es comprimeixen i s'allibera el seu contingut.
S'afegeix una solució hipotònica perquè les cèl·lules es inflin i arribin a explotar. El que després es fa amb aquest extracte és sotmetre-ho a diferents centrifugacions a diferents velocitats i temps (centrifugació diferencial), de manera que obtenim fraccions enriquides dels diferents orgànuls.
Tècnica que depèn del principi que com més denses siguin les partícules que el medi circumdant, aquestes sedimenten d'acord amb la mida i la forma en un tub de centrífugar a diferents velocitats quan es col·loquen en un camp de centrifugació.
Segons el pes de les partícules es necessita una velocitat en la centrifugadora  Aïllament d'una fracció microsómica per centrifugació diferencial.
Quan una cèl·lula es trenca per homogeneïtzació mecànica (pas 1), els diversos orgànuls membranosos es fragmenten i formen vesícules membranoses esfèriques. Les vesícules derivades dels diferents orgànuls poden separar mitjançant diverses tècniques de centrifugació.
El homogeneïtzat de cèl·lules es sotmet primer a centrifugació de baixa velocitat per formar vesícules amb les partícules més grans, com nuclis i mitocondris, el que deixa les vesícules més petites (microsomes) al sobrenedant (pas 2).
Els microsomes poden retirar-se del sobrenedant per centrifugació a major velocitat per períodes més prolongats (pas 3). Una fracció microsómica general d'aquest tipus pot fraccionar-se en diferents tipus de vesícules per ultracentrifugació a 75000 sedimentant els ribosomes.
g: unitats de centrifugació Desoxicolato de sodio: separa els ribosomes del Reticle Endop.
Rugos S'ha de controlar que la fracció corregida sigui una fracció pura a través de microscòpia electrònica: anàlisi d'elements, anàlisi de molècules concretes ...
 Purificació de fraccions subcel·lulars per centrifugació d'equilibri amb gradient de densitat En molts casos s'aconsegueix una purificació addicional mitjançant centrifugació d'una de les fraccions a través d'un gradient de densitat. Aquí s'ha utilitzat un gradient de densitat continu de sacarosa i els diferents orgànuls es sedimenten fins que arriben a un lloc en el tub igual a la seva pròpia densitat, on formen bandes.
En els últims anys s'ha arribat a la identificació en aquestes fraccions de les proteïnes per l'aplicació de la complexa tecnologia proteòmica. Un cop extret un orgànul en particular, és possible extreure les proteïnes, separar i identificar mitjançant espectrofotometria de masses.
Exemples: (a) Micrografia electrònica d'una fracció microsómica llisa en la qual les vesícules membranoses no tenen ribosomes. (b) Micrografia electrònica d'una fracció microsómica rugosa que conté membranes tachonades amb ribosomes.
L'estudi de la proteòmica sovint requereix la separació de mescles complexes de proteïne Els dos gels electroforètics mostrats contenen proteïnes extretes de l'escorça frontal d'éssers humans (a) o ximpanzés (b). Les taques numerades representen proteïnes homòlogues.
CULTIUS CEL·LULARS Cultius cel·lulars: fibroblasts, limfòcits, bacteris, cèl·lules Hela, L, etc.
Utilitats: - Per estudis fisiològics - Per estudis morfològics - Per estudis químics S'entén per cultiu cel·lular al conjunt de tècniques que permeten el manteniment i la reproducció de les cèl·lules in vitro, conservant al màxim les seves propietats fisiològiques, bioquímiques i genètiques.
Els cultius cel·lulars produeixen clons, de manera que totes les cèl·lules d'un cultiu tenen el mateix genotip, excepte que es produeixin mutacions durant el procés.
 Depenent del grau de preservació de l'estructura del teixit o de l'òrgan d'origen i de la seva durada parlarem de diferents tipus de cultius: - Cultius primaris: s'inicien, cèl·lules, teixits o òrgans presos directament d'un animal.
Ex: En l’estudi dels cromosomes - Generalment s'obtenen d'embrions.
- Els teixits es dissocien mitjançant un enzim proteolític (tripsina).
- Rentat per eliminar l'enzim.
- Suspensió en una solució salina lliure d'ions Ca2+.
- S'afegeix EDTA que actua com quelant dels ions de Ca2+ que està implicat en l'adhesió cel·lular.
- Cultius secundaris: reiteració del cultiu primari - Cèl·lules cultivades amb anterioritat i congelades en nitrogen líquid, descongelar i transferir al medi de cultiu.
- Cultius línies establertes: cèl·lules adaptades a un creixement prolongat in vitro Ex: Cèl·lules Hela, L, etc.
Línies cel·lulars - Divisió limitada de vegades (50-100).
- Modificacions Genètiques = creixement indefinit = línia cel·lular = formació de tumors malignes.
- La freqüència amb què una cèl·lula normal que creix en cultiu es transforma en una línia cel·lular depèn de l'organisme del qual prové.
 Medis de cultiu El medi nutritiu pot ser sòlid o líquid. Ha de contenir: Antibiòtics, per a que no es contamini És la part acel·lular de la sang. Ex: Anticossos S’han de simular les condicions in vivo: té que haver un control, que no hi hagi contaminació Les cèl·lules en el cos no viuen en superfícies planes i dures com plàstic per la qual cosa es creu el cultiu tridimensional ofereix un ambient més natural Fibroblast humà que creix en un substrat pla cobert amb fibronectina en un cultiu 2D assumeix una forma molt aplanada amb lamelipodis amples. Les adhesions que contenen integrina es veuen blanques. La cèl·lula està pressionada contra el substrat.
El mateix tipus de cèl·lula conreada en una matriu 3D assumeix una conformació fusiforme no aplanada. La matriu de fibronectina extracel·lular apareix en blau. La barra equival a 10 µm.
 Avantatges - Poden obtenir-se en grans quantitats - Gairebé tots contenen un sol tipus de cèl·lules - Permet estudiar molts processos biològics -divisió cel·lular -tràfic de membrana -endocitosi -moviment cel·lular -síntesi de macromolècules -Les cèl·lules en cultiu responen al tractament amb: -fàrmacs -hormones -factors de creixement  Desavantatges CONTAMINACIÓ BACTERIANA - ús de guants estèrils - esterilització dels subministraments - esterilització d'equips - ús d'antibiòtics en els mitjans de cultiu - realitzar la manipulació sota campana estèril  Equip bàsic de un laboratori de cultiu cel·lular 1. Campana de flux laminar 2. Baño termostatizat 3. Incubador CO2 Atmosfera controlada amb elevada humitat i tensió de CO2 4. Autoclave 5. Nevera i Congelador 6. Microscopi Invertit 7. Microcentrifuga Suspensions cel·lulars (rentats, concentrats, subcultius) 8. Dipòsit de Nitrogen líquid 9. Botelles i plaques de cultiu Estudis de tipus fisiològic Coneixement de la ultraestructura/ composició/ localització FUNCIONAMENT Per al control del cultiu cel·lular utilitzarem el microscopi invertit: està al revés comparat amb un microscopi convencional oferint una major facilitat de treball.
 Micromanipuladors : Microinjeccions (ICSI - injecció espermàtica intracitoplasmàtica) - Tècnica de reproducció assistida similar a la FIV, però la inseminació dels òvuls es realitza en introduir un espermatozoide a l'interior de l'òvul mitjançant una microagulla, de manera directa.
- S'utilitza quan els espermatozoides tenen dificultats per penetrar en l'ovòcit per si sols.
- La ICSI també s'utilitza quan el recompte d'espermatozoides és molt baix.
- Aquesta tècnica és més complexa que la FIV convencional i per això també suposa un cost econòmic major.
 Microelectrodes : Mesures de potencials de membrana, S.N., etc.
L'elèctrode és prou petit (micròmetres) en diàmetre que pot inserir-se en una sola cèl·lula.
Aquesta configuració permet l'observació directa i registre de l'activitat elèctrica intracel·lular d'una sola cèl·lula.
 Microespiròmetres : Mesures de respiració d’un cèl·lula.
Intercanvis gasosos d’una o vàries cèl·lules Ens indica que la fecundació a tingut lloc amb èxit Una vegada hem punxat la membrana per injectar l’esperma, la membrana torna a com era originalment. Es repara molt ràpidament.
CITOQUÍMICA Permet estudiar la composició química de la cèl·lula. Detectar la localització topogràfica d'alguns principis immediats, enzims, metalls pesants i altres substàncies Estudiar el seu funcionament.
Reaccions enzimàtiques: - són específiques i controlades - depenen de factors com: temperatura, pH i la presència de sals - són difícils de veure a simple vista Exemples, tincions citoquímiques usades amb més freqüència: L'activitat fosfatasa alcalina en un cocultiu de dues línies de cèl·lules intestinals. La localització de l'activitat de fosfatasa alcalina (en vermell) es va identificar per citoquímica en un cocultiu dels llinatges cel·lulars humans intestinals Caco-2 i HT29-5M21.
Fotomicrografia de frotis de sang perifèrica mostrant, al centre, un eosinòfil, positiva per a la mieloperoxidasa en alguns grànuls de color castany fosc i reacció negativa per als altres grànuls. Mètode d'Orto-toluidina-peròxid d'hidrogen per mieloperoxidasa, pH 10,0.
Augment de 1.650x.
Fotomicrografia de frotis de sang perifèrica mostrant alguns leucòcits. Al centre s'observa un eosinòfil (fletxa buida), amb nucli perifèric i reacció negativa per a la fosfatasa alcalina.
Mètode del naftol AS-MX fosfat, coloració nuclear amb vermell neutre. Augment de 1650x.
INMUNOCITOQUÍMICA La inmunocitoquímica és una tècnica per a la localització de molècules en els teixits mitjançant l'ús d'anticossos (proteïnes del tipus immunoglobulina G). És una tècnica que gràcies a l'oferta comercial d'anticossos i a la estandardització del seu protocol s'ha convertit en un mètode senzill, ràpid i molt potent. Es basa en la gran especificitat i alta afinitat que tenen els anticossos per reconèixer molècules i unir-se a elles. A més, la conjugació o combinació dels anticossos amb enzims o amb substàncies fluorescents permet detectar quantitats ínfimes de molècules presents en el teixit.
Mitjançant immunocitoquímica s'ha detectat una proteïna mitocondrial amb un anticòs marcat amb fluoreseina (verd).
És una tècnica senzilla que té diferents aplicacions: - Diferenciació de tumors, quan és necessari localitzar un tumor primari desconegut, per determinar la naturalesa de micrometàstasi.
- Tipificar limfomes i leucèmies, per tal de precisar el tractament.
- Detecció de factors de valor predictiu com els receptors d'estrògens i de progesterona en casos de càncer de mama i establir tractaments adequats.
AUTORRADIOGRAFÍA (isòtops radioactius 3H, 14C, 32P.....) Tècnica que permet localitzar les macromolècules que han fixat isòtops radioactius en posar el tall de teixit en la foscor en contacte amb una emulsió fotogràfica, que queda impressionada per la radiació.
Llocs que tenen un isòtop específic: Cèl·lula Gel de poliacrilamida Filtre de cel·lulosa.
Aprofita la capacitat d'una partícula emesa d'un àtom radioactiu per activar una emulsió fotogràfica.
Les partícules emeses per la font deixen grans de plata negres.
Localitza radioisòtops dins de talls de teixits que es van immobilitzar en una làmina o una reixeta per al MET.
1. Administració del isòtop (P32, C14, H3...) 2. Es renten les cèl·lules per eliminar les restes dels marcadors no incorporats.
Fixació i talls.
3. Els talls es dipositen al portaobjectes.
4. S’introdueix el porta dins d’una emulsió fotogràfica (Br Ag) sensible a la radiació.
5. Els talls han de estar a la a la foscor.
6. L’emulsió es revela fent servir tècniques fotogràfiques estàndards i s’examina al microscopi (observació de precipitat de Ag) Exemples Autoradiografia microscòpica electrònica d'una cèl·lula de medul·la òssia covada en [35S] O4 durant 5 minuts i fixada immediatament. La incorporació de sulfat (revelada pels petits grans negres de plata), es localitza en l'aparell de Golgi (fletxa) Autoradiografia microscòpica òptica i de rastreig d'un cromosoma del politè de l'insecte Chironomus, que mostra la incorporació extensa de [3H] uridina en l'RNA a les regions purificades del cromosoma. Les autoradiografies d'aquest tipus van confirmar que els plomalls dels cromosomes són llocs de transcripció.
Autoradiografia que revela els llocs de síntesi i transport subsegüent de les proteïnes secretores Diagrames d'una seqüència de autoradiografies que mostra el moviment de les proteïnes secretores marcades (grans de plata en vermell) a través de la cèl·lula acinar pancreàtica. Quan la cèl·lula es marca amb tècnica de pols durant tres minuts i després es fixa immediatament (com es mostra en a) la radioactivitat es localitza en el reticle endoplasmàtic (b). Després d'un pols de tres minuts i persecució de 17 minuts, la marca radioactiva es concentra en l'aparell de Golgi i vesícules adjacents (c). Després d'un pols de tres minuts amb persecució de 117 minuts, la radioactivitat es concentra en els grànuls secretors i comença a alliberar als conductes pancreàtics (d).
Micrografia electrònica d'un tall d'una cèl·lula acinar pancreàtica que es va incubar durant tres minuts en aminoàcids radioactius i després es va fixar i es va preparar immediatament per a la autoradiografia. Els grans negres de plata que apareixen en l'emulsió després del desenvolupament es localitzen en el reticle endoplasmàtic.
GANGLI CENTINELA El gangli sentinella és el primer gangli limfàtic regional que rep la limfa de la zona on s'assenta un tumor. La teoria que va donar lloc a aquesta tècnica es basa en què la disseminació dels tumors sòlids a través del sistema limfàtic segueix un ordre específic per a cada individu. Per tant, si es detecta aquest primer gangli receptor, es pot biopsiar selectivament i evitar cirurgies extremes, ja que aquest gangli és el que té més probabilitats d'albergar una metàstasi inicial.
I si és negatiu, és més que probable que ho siguin la resta de ganglis.
• La tècnica consisteix a buscar el primer gangli limfàtic de drenatge directe des del tumor, el qual per aquest motiu presenta la màxima probabilitat d'afectació per cèl·lules metastàstiques.
• El gangli "sentinella" o primer gangli que drena l'àrea cancerosa permet una classificació del càncer i deixa els ganglis no afectats perquè continuïn amb el drenatge de líquids.
Procés: • S'injecta un radiotraçador (col·loide marcat amb tecneci 99) en el tumor o en una zona molt propera a aquest.
• Imprescindible, a més, realitzar una gammagrafia per veure el lloc de drenatge i marcar amb tinta sobre la pell per, posteriorment i amb l'ajuda d'un detector de radiació gamma, poder extreure el gangli a quiròfan.
• La biòpsia de gangli sentinella ajuda a determinar si el càncer s'ha disseminat (metàstasi) o està limitat localment.
S'analitzaran les cèl·lules del gangli. Si en el primer d'ells no hi ha radioactivitat, no s'haurà produït metàstasi. Si n'hi ha, passarem als següents, tenint en compte la probabilitat creixent d'haver patit una metàstasi a mesura que avancem.
Si finalment n'hi ha, es procedirà al extirpació de tots els ganglis.
La radiologia nuclear és una subespecialitat de la radiologia en la qual s'introdueixen radioisòtops (compostos que contenen formes radioactives d'àtoms) al cos amb el propòsits de prendre imatges, avaluar la funció de l'òrgan o localitzar tumors o malalties.
Aplicacions ·Càncer de mama ·Càncer de penis ·Càncer de cap i coll ·Càncer de colon ·Càncer de pell Moltes vegades, la primera senyal de melanoma es un canvi en la mida, color o sensació d’un lunar. La majoria dels melanomes tenen una àrea negra o blau fosca ...