Tema 3. Tècniques de blotting (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic genètic molecular
Año del apunte 2016
Páginas 34
Fecha de subida 23/03/2016
Descargas 9
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 3. TÈCNIQUES DE BLOTTING Les tècniques de transferència (blotting) es basen en el mateix fonament que la autoradiografia, i permet identificar la presència d'una banda concreta en un gel d'electroforesi, bé sigui de proteïnes o d'àcids nucleics. 1. APROXIMACIONS GENERALS PEL GENOTIPAT L’origen de les tècniques de blotting va començar amb el Southern blot. Aquesta tècnica rep el nom del seu inventor, Sir Edwin Southern, qui al 1975 va revolucionar totes les tècniques d’anàlisi molecular. Pocs anys després va sorgir la PCR. Diagnòstic genètic molecular Aproximacions generals pel genotipat Cap aquell temps els genomes s’estudiaven mitjançant enzims de restricció i es feien mapes físics. Al fer l’anàlisi per enzims de restricció surten bandes discretes, però al treballar amb genomes complexes no es veuen aquestes bandes degut a que hi ha moltes dianes i molts fragments de diferents grandàries. Per això mateix, per estudiar genomes complexes s’han d’utilitzar sondes, de manera que puguem limitar l’anàlisi. Diagnòstic genètic molecular Quan treballem amb genomes complexes, si els digerim amb enzims de restricció no obtindrem bandes, simplement veurem carrils difusos com els que es veuen a la Hibridació molecular imatge que hi ha a continuació. El que s’ha de fer, en el cas de la utilització de sondes, és limitar l’anàlisi a una regió concreta i hibridar sobre fragments de DNA digerits prèviament i separats mitjançant electroforesi. Ara bé, no es pot fer tot en el mateix gel i per això l’hem de transferir (tècniques de blotting). Blotting El DNA difon, i per tant, la sonda té dificultats per unir-se al DNA. No es pot jugar amb la temperatura per controlar la hibridació perquè com estem treballant sobre gels d’electroforesi (recordem que hem separat els fragments de DNA per mida) aquests es podrien fer malbé. Ara bé, és possible fer anàlisis d’hibridació d’àcids nucleics en gels d’agarosa. El que s’ha de fer és transferir el DNA que hem separat prèviament a un filtre més rígid. És a dir, el que s’ha de fer és el següent: TEMA 3. Tècniques de blotting 1 1. Realitzar una electroforesis per separar les mostres. Si volem separar àcids nucleics es fa en un gel d’agarosa i si volem separar proteïnes es fa en un gel de poliacrilamida. Aquests gels són molt dèbils. 2. Blotting: transferir els gels d’electroforesi a un suport més rígid (normalment membranes de nictrocel·lulosa). A partir d’aquí s’han trobat altres variants basades en trobar primer l’element en qüestió mitjançant medis porosos (electroforesi) i després transferir a membranes de niló. Transferència (blotting) Aquest últim pas es fa per tal que el filtre sigui més manejable i puguem realitzar canvis de temperatura (recordem que els gels d’electroforesi no permeten canvis de temperatura perquè es desfarien). stic genètic molecular Per altra banda, també hi ha variants que no cal separar electroforèticament ja que es poden separar directament sobre les membranes de niló. Gel 2. TÈCNIQUES DE BLOTTING Amb les tècniques de blotting s’han pogut desenvolupar una sèrie de tècniques derivades per tal de poder estudiar el DNA, l’RNA, les proteïnes i interaccions entre aquests. En conclusió, les tècniques relacionades amb processos de blotting són les següents: • • • • Western analysis. Per analitzar proteïnes. Southern/Northern analysis. Per analitzar DNA/RNA. Slot/Dot blotting. Diagnòstic genètic molecular Bacterial colony blotting. Amb aquestes tècniques es pretén detectar colòniques Blotting bacterianes sobre plaques. Western analysis Slot/Dot blotting Bacterial colony blotting Northern analysis Southern analysis Blotting TEMA 3. Tècniques de blotting 2 3. PROTOCOL GENERAL Tant la mostra a analitzar com la sonda (prèviament marcada) es desnaturalitzen (així s’evita la renaturalització). A continuació incubem la sonda sobre el suport on es troba la mostra de manera que en baixar l’astringència (menys severitat), aquesta incubació facilitaria la hibridació d’aquestes sondes amb les molècules d’àcid nucleic que s’està analitzant. Per obtenir un bon resultat hem de fer uns bons rentats que eliminin qualsevol resta de sonda que interfereixi (tots aquests procediments s’apliquen tant a les tècniques de Southern blot com de Northern blot). El material emprat és DNA aïllat, el qual ha d’estar sense contaminar. S’ha d’utilitzar una bona tècnica per aïllar-lo ja que el necessitem íntegre, sense fragmentar. Un cop tenim el DNA íntegre i separat, el fragmentem amb enzims de restricció amb l’objectiu que es produeixin talls en funció de les dianes de restricció presents a la seqüència de DNA i així produir un patró de tall en funció de cada seqüència. Per poder realitzar tot aquest procediment necessitem grans quantitats de DNA en bones condicions (molt ben purificat) per tal de poder realitzar la incubació amb els diferents enzims de restricció. Ens trobarem amb múltiples seqüències de DNA, les quals se separaran electroforèticament en funció de la seva grandària i com es fa en un suport que no és adient per la hibridació (gel d’agarosa en el cas del DNA), l’haurem de transferir a una membrana més sòlida (membrana de niló). Ara bé, abans de la transferència haurem de desnaturalitzar la mostra de manera que quedi separada i fixada de forma correcta per tal de poder fer una bona hibridació. Com hem dit anteriorment, s’han de desnaturalitzar tant el DNA com la sonda: • • El DNA es desnaturalitza mitjançant canvis de pH, ja que si es fa per temperatura faríem malbé el gel d’agarosa. Per fer-ho s’aplica una solució altament alcalina. La sonda es desnaturalitza mitjançant canvis de temperatura . Diagnòstic genètic molecular En conclusió, per obtenir la mostra en condicions hem de tenir una gran quantitat de DNA i ben purificat (intacte), després s’ha de digerir i separar electroforèticament. A continuació es desnaturalitza i es fixa sobre un suport sòlid. Aïllament del DNA Digestió enzimàtica Marcat Separació electroforètica Desnaturalització Desnaturalització Transferència Fixació Blotting TEMA 3. Tècniques de blotting 3 stic genètic molecular Aquests passos es fan tant per l’anàlisi de DNA, RNA com proteïnes. Primer de tot, hem de separar en funció de la grandària dels fragments obtinguts i posteriorment ho transferirem. El filtre és el que obtindrem per l’anàlisi, tant amb sondes com amb anticossos específics de les proteïnes (en el cas que analitzem proteïnes). ark (1977) elin & J Com que al principi digerim, podem detectar la presència de seqüències concretes i variacions d’aquestes seqüències sempre que hi hagi alguna diana de restricció pròpia dels enzims de restricció que estiguem utilitzant en aquell cas. En conseqüència, podem detectar la presència de seqüències concretes, abundància relativa d’aquestes seqüències i variacions (sempre que estiguin afectades d’alguna manera per dianes de restricció). Per Northern podem analitzar ARN: grandària i abundància, normalment. Per tant, no se solen digerir. En principi només se separen, s’identifiquen variacions a la grandària i després es mira l’abundància relativa de les molècules. Diagnòstic genètic molecular Per Western podem analitzar proteïnes: abundància i presència. Canvis en Canvis en la Canvis en la Una aplicació d’aquestes tècniques de seqüència del DNA que afectin quantitat i quantitat i blotting seria la detecció d’oncogens a través a la grandària grandària dels grandària de les RNA proteïnes d’alteracions al DNA i/o proteïnes i gràcies a dels fragments de restricció modificacions epigenètiques (com els canvis de metilació nuclear). Això es pot fer Blotting mitjançant blotting, emprant diferents ítems que ens interessin en el diagnòstic a l’hora de determinar si hi ha una variació i quina és la seva causa. Són tècniques que inicialment permeten un anàlisi molt ampli. Es poden analitzar àcids nucleics obtinguts de diferents formes i no sempre cal electroforesi. Les tres tècniques bàsiques de blotting coincideixen en que primer se separa el material mitjançant una electroforesi i per poder fer-ho s’utilitza una superfície porosa. A aquest suport se li aplica un camp elèctric i en funció de les càrregues de les molècules, aquestes s’orientaran en aquest camp. Per tant, el recorregut que fan aquestes molècules depèn de la càrrega, la seva grandària i/o la seva configuració, entre d’altres. TEMA 3. Tècniques de blotting 4 4. SEPARACIÓ ELECTROFORÈTICA Els gels d’electroforesi emprats són els següents: • • Anàlisi de DNA/RNA: gels d’agarosa. ⇒ En el cas del DNA utilitzem gels d’agarosa no desnaturalitzants. ⇒ En el cas del RNA utilitzem gels d’agarosa desnaturalitzants en concentracions suficients de formaldehid o formamida per tal de desnaturalitzar els RNA’s. Per tant, podrem separar en funció de la seva grandària. Diagnòstic genètic molecular gels de poliacrilamida. També separarem en funció de la Anàlisi de proteïnes: grandària. Separació per grandària en un material porós (gels): • Agarosa DNA / RNA (no desnaturalitzant / desnaturalitzant) • Poliacrilamida PROTEÏNES (desnaturalitzant SDS-PAGE) porositat del medi, és a dir, del diàmetre del porus que utilitzem per fer En funció de la Blotting el gel d’electroforesi, el recorregut de les mostres variarà. Com més gran sigui el porus, més facilitat tindran les molècules per avançar i viceversa. El diàmetre dels porus depèn de la concentració, a major concentració, menor mida del porus. Si treballem amb fragments petits ens interessa fer-los córrer en un gel amb porus petits i per contra, si treballem amb fragments grans, ens interessa fer-los córrer en un gel amb porus grans. Diagnòstic genètic molecular A continuació tenim taules en les quals se’ns indica la mida dels fragments a partir dels quals podem separar en funció de la concentració d’agarosa/poliacrilamida del gel: TEMA 3. Tècniques de blotting Blotting 5 Tot seguit podem veure el que passaria amb gels de diferents percentatges d’agarosa. Si s’utilitzen porus grans (percentatge baix) es distingeixen millor les bandes. Ara bé, a mesura que els porus es van fent petits (percentatge elevat), el recorregut és menor i la distància entre les bandes també ho es. Per tant, els porus grans s’utilitzen per treballar amb fragments de mostres també grans (i al revés). El que ens interessa és poder distingir bé les bandes que ens proporcionin informació Diagnòstic genètic molecular rellevant pel nostre estudi. Aleshores, haurem de jugar amb les concentracions. En conclusió, per fragments llargs emprarem porus grans i per fragments curts emprarem porus petits. Diagnòstic genètic molecular Blotting En el cas dels RNA’s, un cop aïllats i posats al gel d’electroforesi veiem dues bandes molt ben diferenciades. Les bandes de les subunitats ribosòmiques són molt abundants i podem veure que la banda de la subunitat 28S és el doble de intensa que la del 18S. Si ens trobem amb aquesta situació significa que tenim un RNA amb molt bones condicions. Si en aquests carrils veiem zones difuses això ens indica que el material està degradat, és a dir, en mal estat. Blotting En aquesta imatge podem veure que hi ha RNA degradat a la part inferior i això afavorirà l’aparició de més bandes de DNA genòmic a la part superior. Per altra banda, podem veure els carrils dels marcadors emprats, un carril de material degradat i un d’intacte. En funció de la concentració que obtinguem haurem de rebutjar els resultats. És a dir, haurem de tornar a fer l’extracció pel seu posterior anàlisi, sense que hi hagi material a la part superior. Pel que fa als carrils de DNA, es digereix tot el material genòmic de forma que es queda a la part superior i a la part inferior, si ens queda material difús, ens indicarà que està TEMA 3. Tècniques de blotting 6 Diagnòstic genètic molecular contaminat. A la imatge que hi ha a continuació podem veure quatre mostres en mal estat (DNA degradat) i una en bon estat (DNA intacte). Tant les tècniques de Southern com de Northern consumeixen molt temps (una setmana, aproximadament) i per això hem de controlar molt cada pas. Per tant, si en el nostre estudi es pot evitar fer aquestes dues tècniques, és millor evitar-les. Blotting Un cop es fa l’extracció del DNA hem de comprovar si està intacte, si ho està, passem a digerir. Hem d’anar amb molta més cura. Les molècules de RNA es degraden amb molta més facilitat que les de DNA perquè hi ha moltes RNAses. Per tant, hem d’eliminar totes les molècules que ens facin l’anàlisi més difícil, procés que és difícil de realitzar fins i tot mitjançant autoclavatge. És a dir, s’ha de detectar tot el material químicament i eliminar tot el que no sigui RNA. Per poder fer això sense gaires problemes el millor és treballar amb materials d’un sol ús per tal d’estalviar-nos els problemes de contaminació. 5. PASSOS A SEGUIR PER FER EL BLOTTING 5.1. TRANSFERÈNCIA I FIXACIÓ Al transferir el gel d’electroforesi a una membrana més rígida el que s’ha de fer és fixar. Les membranes que utilitzarem seran membranes de niló. Un cop s’ha fixat aquest gel, es procedeix a incubar i a continuació es fan les hibridacions. 5.2. INCUBACIÓ I HIBRIDACIÓ Per hibridar el que es fa és disminuir la severitat. Com les sondes les hem desnaturalitzat mitjançant condicions d’alta severitat augmentant la temperatura, procedirem a baixarla. És a dir, juguem amb les condicions d’hibridació (pH, força iònica, concentració salina i temperatura). Bàsicament baixant la temperatura ja aconseguirem les hibridacions (però també podem utilitzar la força iònica i el pH). Després de realitzar les hibridacions venen els rentats. Amb els rentats pugem les condicions de severitat (però no variem tant la temperatura com la força iònica, factor principal en els rentats). La severitat de la hibridació i els rentats determinaran els resultats finals. TEMA 3. Tècniques de blotting 7 Si les condicions d’hibridació són poc severes, tindrem una gran quantitat de soroll (sortiran moltes marques, perquè la sonda haurà hibridat moltes vegades de forma inespecífica). Aquesta gran quantitat de soroll es pot explicar per una baixa salinitat, ocasionant rentats no han estat prou severs com per eliminar tot aquest material que ha hibridat de forma inespecífica. Tot i que la hibridació estigui feta en bones condicions, ens poden aparèixer algunes bandes que no s’han pogut rentar be. Diagnòstic genètic molecular severitat Incubar amb severitat Si per la hibridació apliquem una alta severitat podrem aconseguir les bandes molt més la sonda desnaturalitzada marcades tot i que hi hagi soroll de fons. 5.3. RENTATS òstic genètic molecular Detecció Blotting Hibridació Els rentats necessaris variaran entre dos i quatre, i s’hauran d’anar incrementant les condicions de severitat. Si tot això és fa correctament podrem arribar a aconseguir unes bandes molt ben marcades sense soroll de fons. Podríem dir que els rentats són més importants que les hibridacions perquè mitjançant els rentats podem SEVERITAT — + rectificar tot allò que no s’ha fet bé durant la hibridació. Incubar amb la sonda Són tan fonamentals perquè podem deshibridar desnaturalitzada totalment la sonda i fer una hibridació amb una altra sonda totalment diferent en la mateixa membrana. És a dir, deshibridem la sonda que hem utilitzat al principi, apliquem rentats per eliminar les restes de sonda i Rentats procedim a fer el mateix que havíem fet amb aquesta Detecció primera sonda però amb una totalment diferent. D’aquesta manera es poden fer diferents anàlisis utilitzant la mateixa membrana. Ara bé, aquest procediment de deshibridació s’ha de realitzar en membranes de niló perquè les membranes de nitrocel·lulosa són massa dèbils (es fan malbé amb rentats severs). Per altra banda, si es donen hibridacions de forma excessiva costarà realitzar els rentats. Ara, els rentats són els que determinaran la qualitat final dels resultats que observarem. Si observem inespecificitats voldrà dir que haurem de fer rentats més severs. TEMA 3. Tècniques de blotting 8 5.4. DETECCIÓ La detecció depèn del que vulguem detectar. A continuació podem veure una taula en la Diagnòstic genètic molecular qual es fa una comparativa dels diferents mètodes de detecció: Factor Sensibilitat Temps de detecció Estabilitat senyal Radioactivitat No radioactivitat 10fg 60-500fg Diagnòstic genètic molecular Hores/Dies/Setmanes Hores/minuts Depenent deFactor la vida mitjana Radioactivitat Variable No radioactivitat 10fg 60-500fg Hores/Dies/Setmanes Hores/minuts Risc Sensibilitat Si No Temps de detecció Depenent de la vida mitjana Variable Podem observar que els mètodes de detecció per radioactivitat són molt més sensibles Estabilitat senyal Si No que els no radioactius. Els mètodes de detecció utilitzats són els següents: Risc Color • • Radioactiva. Bioluminiscencia No radioactiva. Biofluorescencia ⇒ Quimioluminscent. Radioactivitat ⇒ Cromogènica. És la pitjor, no Sensibilitat ens dóna bons resultats (en quant a sensibilitat). Blotting Color Bioluminiscencia Biofluorescencia Radioactivitat Sensibilitat Blotting En conclusió, les sondes ens permeten: • • • Identificar. Localitzar. Quantificar. A les tècniques de blotting, localitzem si hi ha la banda o no, però no on es troba la seqüència dins de l’estructura cel·lular. Això és degut a que no es desestructuen les mostres. A les tècniques de blotting partim dels components, àcids nucleics i proteïnes. Per tant, sabem què hi ha però no on es troben. Per saber on es troben hauríem de realitzar una hibridació in situ. Les tècniques de blotting son anàlisis moleculars únicament (treballem amb molècules completament aïllades). Podrem detectar variacions en les seqüències i quantificar-les, tot sabent l’abundància relativa d’aquella seqüència en la mostra que estiguem analitzant. Les tècniques de blotting en general ens permeten determinar la presència/absència de DNA, RNA o proteïnes. TEMA 3. Tècniques de blotting 9 6. NORTHERN BLOT: APLICACIONS Les tècniques de Northern blot permeten determinar canvis en quantitat i grandària del RNA. Diagnòstic genètic molecular 6.1. CANVIS DE GRANDÀRIA Northern blot Primer de tot hem d’aïllar el RNA en condicions intactes i és això • Canvis en grandària el que permetrà determinar la grandària d’aquest. En funció del recorregut electroforètic podrem saber si hi ha alguna variant de splicing (ja que donen bandes de diferents recorreguts). En funció de si s’ha escindit un intró o no, el fragment de RNA que trobarem serà major o menor, i es podrà identificar en funció de la posició de la banda. 6.2. CANVIS DE QUANTITAT Diagnòstic genètic molecular Blotting: Identificació i quantificació També podem detectar canvis en la quantitat. En el cas de la imatge que hi ha a continuació s’estudia la repressió de la glucosa sobre l’expressió del gen GAL1 en Saccharomyces cerevisiae. Podem veure que a major temps d’exposició a la glucosa el nivell d’expressió de GAL1 és menor (degut a que la glucosa actua com a repressor). És a • Canvis quantitatius dir, detectem una menor quantitat del mRNA del gen GAL1. Northern blot Glucose repression of GAL1 gene expression in Saccharomyces cerevisiae Diagnòstic genètic molecular Blotting: Identificació i quantificació Per altra banda, aquí tenim l'exemple d’una mostra on s’utilitza una sonda de cDNA marcat a partir del gen FMR1 (síndrome de l’X) . Els nivells més alts es detecten en el cervell i els testicles (4,4 kb) , amb disminució d’expressió en la placenta, pulmó i The example shows the use of a ronyó, respectivament. Per altra banda també trobem múltiples labeled cDNA probe from the FMR1 mental retardation transcrits més petits presents al cor.(Fragile-X syndrome) gene. Highest levels are detected in the brain and testis (4.4 kb), with decreasing expression in the placenta, lung and kidney respectively.
Multiple smaller transcripts are present in the heart.
Observem, doncs, que hi ha diferents bandes. Amb els resultats obtinguts podem dir que com que apareixen aquestes múltiples bandes, les quals sorgeixen per complementarietat entre sonda i seqüència, ens indiquen que s’ha produït splicing alternatiu. Blotting: Identificació i quantificació TEMA 3. Tècniques de blotting 10 6.3. CONTROLS Ara bé, per poder donar uns resultats per vàlids ens falta un control amb el qual comparar. Diagnòstic genètic molecular el nivell d’extracció és molt variable. És molt difícil aïllar Es necessiten controls perquè RNA de la mateixa forma i amb la mateixa quantitat en els diferents teixits, ja que l’eficàcia del procés d’extracció és diferent en cadascun. B. WITEK-ZAWADA, A. KOJ REGULATION OF EXPRESSION OF STROMYELYSIN-1 BY PROINFLAMMATORY CYTOKINES IN MOUSE BRAIN ASTROCYTES Quan carreguem la mostra a cada carril hi poden haver variacions, per tant, la quantitat que carreguem a cada carril pot variar. Per tant, necessitem un control intern que digui que la quantitat que s’ha carregat en els carrils és la mateixa. Si hi ha un carril que és més intens que un d’altre, no es per la quantitat de RNA total, sinó per que hi ha més quantitat d’aquest RNA. Pels controls podem utilitzar la mateixa fotografia que tenim de les separacions electroforètiques d’aquests RNA’s. Si la intensitat de la senyal de tots els carrils és semblant, es transfereix l’RNA al filtre, hibridem i detectem. Si la quantitat de RNA que hi ha en tots els carrils és equivalent, ens podem fiar d’aquest senyal. Blotting: Identificació i quantificació Per altra banda, a part de controls interns, també s’utilitzen controls de gens que s’expressen de manera constitutiva a tots els teixits. En aquest cas, com que els gens Diagnòstic genètic molecular s’expressen de forma constitutiva ens assegurem de tenir la mateixa intensitat a cada carril (independentment del teixit). Controls. Northern blot S’utilitzen sondes de gens constitutius com a referències: Gliceraldehid 3’ fosfat deshidrogenasa (GAPDH) -actina 2-microglobulina Blotting: Identificació i quantificació TEMA 3. Tècniques de blotting 11 Increments corregits - Importància dels controls Ens trobem en la situació de tenir un gen control i gen estudiat. Mesurem la intensitat de la mostra problema i trobem que la intensitat del gen estudiat que analitzem és deu vegades més gran que la del gen control de referència. Ara bé, hem de mirar la intensitat d’aquests dos gens en una mostra control. Observant la mostra control control veiem Diagnòstic genètic molecular que el gen control s’expressa el doble que el gen mostra. Per tant, això indica que en aquest cas, la mostra s’expressa cinc cops més que en els casos “normals”. Controls. Northern blot control Per tant, sense controls no es poden fer quantificacions ni donar per vàlids els estudis. mostra gen estudiat gen control actina, GAPDH, RPLP0 etc Increment corregit = 10/2 = 5 Blotting: Identificació i quantificació 6.4. DETECCIÓ DE TRANSGENS Moltes vegades estudiem amb ratolins i volem saber si tenen el gen que hem inserit (transgen), si s’ha inserit correctament, el seu número de còpies, si s’expressa, etc. Aquesta detecció es pot fer mitjançant tècniques de blotting ja que permeten analitzar tant àcids nucleics com proteïnes. El que es fa amb ratolins és tallar-lis la cua per tenir prou material: necessitem suficient DNA per poder realitzar el Southern. A partir d’aquí podem determinar si els ratolins presentaven cert transgen o no en el seu genoma, tot detectant-ho mitjançant sondes específiques del transgen. Si la sonda hibrida, el transgen es trobarà en el DNA genòmic d’aquest ratolí. Diagnòstic genètic molecular Per altra banda, també podem estimar el nombre de còpies del transgen: si tenim múltiples còpies, el que fa l’organisme és silenciar-les totes per metilació i per tant, hi haurà moltes còpies però sense expressar-se. En conseqüència, el transgen no s’expressarà. A la imatge que hi ha a continuació el primer carril correspon a mostres de DNA de ratolins que ja s’havien obtingut prèviament i que se sap que només tenen una sola copia de transgen: utilitzat com a referencia. Els 10 micrograms per lane of tail DNA was digested with BamHI and EcoRI, then electrophoresed on 1.2% agarose, and alkaline capillary transferred to Hybond N+. The blot was hybridized with random prime-32P-dCTP-labeled probe from the transgene. This probe hybridizes with 6 and 5 kb endogenous bands seen in each lane, and the 2 kb transgene band seen in the 1X, 5X, and 10X transgene DNA-spiked tail DNA lanes, two MLC-Sno control lanes containing tail DNA from another, single-copy, transgenic line, and four new transgenic mice identified in this Southern blot. Inclusion of the copy standards allowed us to calculate the approximate number of transgenes integrated for each founder as one for #10054, six for #10116, sixteen for #10050, and sixty for #10052. Thus, four out of 30 mice screened (13%) were transgenic, which is lower than our recent track record of 20% transgenic.
http://www.healthsystem.virginia.edu/internet/transgenic-mouse/southerndesign.cfm Blotting: Identificació i quantificació TEMA 3. Tècniques de blotting 12 quatre darrers carrils corresponen a ratolins als quals se’ls hi ha subministrat la mostra en major o menor quantitat de transgen per tenir una idea del nombre de còpies. Podem veure varis ratolins diferents, un presenta 1 còpia, i els altres 6, 16 i 60. Això es detecta per la intensitat de les bandes (s’ha utilitzat un marcatge radioactiu). Si utilitzem el marcatge per precipitat de color no ens indicaria res, nomes tindríem presencia o absència. En quant a l’hora de quantificar, necessitem un sistema de detecció que sigui molt precís i que permeti detectar perfectament el nombre de còpies: per això utilitzem el marcatge radioactiu. Ara bé, es poden haver inserit mes d’una copia però que Diagnòstic genètic molecular no s’expressi. Western blots Nature Cell Biology 15, 96–102 (2013 Una manera de comprovar que s’expressen els transgens és per Western blot: analitzant Blotting: Identificació i quantificació si expressa o no els diferents elements del transgen que hem introduït. Comprovem als diferents teixits del ratolí si s’expressen o no els diferents elements de la construcció del Diagnòstic genètic molecular transgen que hem introduït. Hi ha proves funcionals que permeten saber si estan expressant els elements de la construcció del transgen sense haver de sacrificar l’animal. A continuació tenim dos ratolins, un verd i un blau. Sabem que el ratolí verd expressa el transgen però el seu germà no. Hem inserit el transgen als dos però un l’expressa i l’altra no. Per tant, les tècniques de blotting ens permeten analitzar diferents elements, tant àcids nucleics com proteïnes (elements que s’utilitzen per analitzar l’expressió la inserció d’un transgen). Identificació i quantificació 7. APLICACIONS DEL SOUTHERN BLOT AL DIAGNÒSTIC GENÈTIC MOLECULAR Com bé hem explicat anteriorment, les tècniques de Southern blot ens permeten identificar i determinar el nombre de còpies de les seqüències de DNA. A més, també permet identificar la presència de seqüències concretes i determinar la quantitat relativa TEMA 3. Tècniques de blotting 13 d’aquestes. Per altra banda, també permeten identificar canvis en les seqüències de DNA que afectin la grandària dels fragments de restricció i inclús canvis epigenètics que afectin a aquestes seqüències de DNA. En aquests casos és més versàtil l’ús del Southern que del Northern o del Western. Recordem que en el Southern, a diferència d’altres tècniques, digerim perquè necessitem el DNA intacte i amb molt bona qualitat per tal de fragmentar-lo amb enzims de restricció específics de dianes concretes: generació d’un patró de tall repetitiu. Per tant, podem detectar substitucions i pèrdues o addicions de nucleòtids que afecten a dianes de restricció (RSP, SNP). Si aquests nucleòtids afectaven a vies de restricció, el patró de tall pot variar: detecció de pèrdues o guanys de material genètic, transposicions o expansions Diagnòstic genètic molecular de nucleòtids i petites delecions (encara que no afectin la diana de restricció però sí al fragment de restricció) deguts a la presència d’una nova diana de restricció. • Substitucions i pèrdues o addicions de nucleòtids que Per altra banda, també podem detectar modificacions químiques que alteren la diana de afecten a dianes de restricció (RSP, SNP) • Guanys i pèrdues (duplicacions, transposicions, expansions, pèrdua d’aquesta diana de restricció. Aquestes modificacions són equivalents a la delecions) • Modificacions químiques de les bases nitrogenades que restricció i per tant, també es poden detectar canvis epigenètics que afectin les dianes condueixen a la pèrdua de dianes de restricció (metilacions) dels enzims emprats en l’anàlisi. En definitiva, observem una sèrie de bandes de certa mobilitat i canvis d’aquesta indiquen canvis en les seqüències del DNA: mutació puntual, mutació de guany/pèrdua d’uns centenars de bases, etc. Detecció de mutacions i metilacions en el DNA 7.1. CAS DE L’ANÈMIA FALCIFORME Aquesta malaltia s’originava per una substitució d’un sol nucleòtid o per una mutació de canvi de sentit del codó amb implicacions en la ß-globina, causant que la hemoglobina formi estructures pseudocristalines. Aquestes estructures fan que els eritròcits presentin forma de falç (d’aquí el nom de la malaltia), la qual causa un mal transport de l’oxigen i deriva en l’acumulació d’aquests eritròcits a la melsa (fins produir la mort de l’individu Diagnòstic genètic molecular per anèmia). Anèmia falciforme Diana MstII A mutació S 1150 bp 200 bp Pèrdua de diana Obtenció d’una sonda marcada radioactivament 1350 bp Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA La mutació puntual que es dóna és una substitució de l’adenina per la timina. Aquesta mutació afecta a aquest codó però també a una diana de restricció. Tenim diferents softwares que es poden utilitzar per la recerca de dianes de restricció i podríem distingir TEMA 3. Tècniques de blotting 14 que aquest canvi aquest canvi afecta la diana de MstII (tot i que també afecta a altres dianes, com la DdI). La ß-globina A reconeix la diana de restricció MstII, però si substituïm l’adenina per la Diagnòstic genètic molecular timina, obtindrem la ß-globina S, i amb aquesta mutació puntual desapareix la diana de Anèmia falciforme restricció. S 1350bp 1150bp A Si hi ha la diana de restricció, ens trobarem amb fragments abans de la diana de restricció i fragments després d’aquesta. La ß-globina S (afectada) presentarà una llargada de 1350 pb i la ß-globina A (sana) presentarà una llargada de 1150 pb perquè s’ha tallat per la diana de restricció. Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA En el cas d’un individu sa, ens trobarem amb un fragment de 1150 pb abans de la diana. Si aïllem aquest fragment i el marquem obtenim una sonda que podem utilitzar per l’anàlisi. Si fem hibridar aquesta sonda amb la seqüència de DNA de diferents individus podem obtenir el següent: • • Al·lels sans. La sonda hibrida perfectament amb la seqüència de DNA fins el punt de la diana de restricció (que és on talla). Per tant, la banda d’un al·lel sa serà de 1150 pb. Al·lels afectats. En aquest cas, com no hi ha diana de restricció no es pot tallar i la sonda hibridarà amb els primers 1150 pb de la seqüència de DNA (per complementarietat) però el fragment de DNA serà més gran i en conseqüència, la banda correrà més. Aleshores, la banda de l’al·lel afectat serà de 1350 pb. En el gel anterior podem veure el resultat d’un estudi d’una família per la detecció d’anèmia falciforme. Per les bandes que observem: • • • Pares. Tant el pare com la mare presenten dues bandes, per tant, tenen un al·lel salvatge o sa i un de mutat o afectat. Són heterozigots. Fill 1. Té una única banda que indica una llargada de 1150 pb pel que fa a la ßglobina. Ara bé, si ens fixem, la intensitat de la banda és molt elevada, fet que ens indica que és homozigot per l’al·lel sa. Fill 2. Té una única banda que indica una llargada de 1350 pb pel que fa a la ßglobina. Ara bé, si ens fixem, la intensitat de la banda és molt elevada, fet que ens indica que és homozigot per l’al·lel mutat. Coneixent la mutació podem dissenyar una tècnica de diagnòstic senzilla basada en el Southern blot: detecció de la presencia/absència de la mutació. Com a curiositat, podem veure que pel que fa les mostres parentals i la del primer fill, hem carregat la mateixa quantitat de material (ja que la del primer fill és el doble que la dels seus pares). Per TEMA 3. Tècniques de blotting 15 contra, la intensitat de la banda del segon fill és molt més elevada que la del primer, fet que ens indica que hem carregat més mostra per la detecció dels al·lels d’aquest segon Anèmia falciforme fill. En cada banda de l’heterozigot hi ha la meitat Diagnòstic genètic molecular del DNA que a la única banda dels homocigots (partint de la mateixa quantitat de DNA genòmic carregat a cada carril) S 1350bp 1150bp A Detecció de mutacions i metilacions en el DNA ¿Per què tenen la mateixa intensitat si la llargària dels fragments és diferent entre al·lels? Això és degut a que detectem la sonda, no el DNA. La sonda és la mateixa per tots els casos, és a dir, només detectem la quantitat de radioactivitat de la sonda. En conseqüència, la quantitat de sonda que hibrida amb cada al·lel és la mateixa, independentment de la llargada de la seqüència. Detecció de mutacions en el DNA Si analitzem prèviament mitjançant un gel d’agarosa (electroforesi de DNA), distingiríem molta més intensitat en la banda gran que en la banda petita, ja que es tenyeix el DNA amb colorant i per tant, depèn de la quantitat que hi hagi, ja que són les molècules de DNA les que retenen bromur d’etidi (element emprat pel marcatge). Si utilitzem la sonda fragmentada, en el fons, tota la seqüència que sigui complementaria hibridarà tot i que siguin fragments. Si només té una part que sigui complementària, com que la sonda està fragmentada, només hibridarà la quantitat de sonda que correspon a aquesta seqüència complementaria. En conseqüència, si digerim, tindrem la sonda fragmentada. Per tant, el fragment més gran retindrà més quantitat de sonda que el més petit ja que te un grau de complementació menor amb la sonda (en el cas que la sonda estigui fragmentada, si esta sencera no, hibridarà tot). Per tant, depèn de la quantitat de seqüència complementària. 8. PÈRDUA D’UNA DIANA DE RESTRICCIÓ El patró que podem trobar depèn de les sondes. Imaginem que tenim una diana que pot estar absent o present en funció de la mutació. Per tant, ens podem trobar en les dues situacions següents: • • Diana present. Tindrem un fragment d’una determinada longitud. Diana absent. El fragment que tindrem serà major que el fragment resultant d’una seqüència que presenti la diana. En conseqüència, ens trobem amb: • • • Homozigot per presència de diana. Presenta una sola banda. Homozigot per absència de diana. Presenta una sola banda. Heterozigot. Presenta dues bandes, és a dir, ajunta els dos patrons anteriors. TEMA 3. Tècniques de blotting 16 A continuació explicarem diferents casos d’utilització de sondes a partir d’una imatge on es veu tot detallat. Sonda de color lila Veiem que aquesta sonda arriba fins la diana de restricció. ⇒ Homozigot (+/+). En aquest cas, la diana no es perd, per tant, els enzims de restricció tallen per aquest punt. D’aquesta forma obtenim dos fragments de la mateixa mida. Com és homozigot, observem una única banda. ⇒ Homozigot (*/*). En aquest cas, la diana es perd, aleshores, els enzims de restricció no poden tallar per aquest punt, causant que quedi un fragment més llarg que quan ens trobàvem amb l’al·lel (+). Com és homozigot, observem una única banda però com que el fragment de DNA amb el qual hibrida la sonda emprada és més gran, la banda està més amunt. ⇒ Heterozigot (+/*). En aquest cas, un al·lel perd la diana de restricció i l’altra no. Aleshores, observarem dues bandes diferents, cadascuna corresponent a un al·lel diferent. Sonda de color vermell Veiem que aquesta sonda arriba una mica més lluny pel que respecte la sonda anterior, és a dir, passa la diana de restricció. ⇒ Homozigot (+/+). En aquest cas, la diana no es perd, per tant, els enzims de restricció tallen pel punt de tall. Ara bé, obtindrem dos fragments de DNA diferents. Com la sonda utilitzada té complementarietat amb qualsevol dels dos fragments, obtindrem dues marques per cada al·lel, una de més curta i una de més llarga. ⇒ Homozigot (*/*). En aquest cas, la diana de restricció es perd i per tant, els enzims de restricció no poden tallar. Com únicament tenim un sol fragment, la sonda hibridarà sempre amb fragments de la mateixa mida (els enzims no han pogut tallar) i en conseqüència obtindrem una sola banda. ⇒ Heterozigot (+/*). En aquest cas obtindrem una barreja de les dues situacions anteriors. Per una banda, com hi ha un al·lel (+), hi ha diana de restricció i s’obtenen dos fragments que hibriden amb la sonda (mateixes bandes que en el cas (+/+)). Per altra banda, com hi ha un al·lel (*), no hi ha diana de restricció i per tant, només s’obté una banda (només pot hibridar un fragment amb la sonda). -NOTA- Veiem que la suma de la intensitat de les bandes de l’heterozigot han de ser equivalents a la intensitat de la banda de l’homozigot (*/*). TEMA 3. Tècniques de blotting 17 El mateix es pot aplicar a les sondes de color blau de la imatge. Podem veure que en el Diagnòstic genètic molecular cas de la primera d’aquestes sondes blaves hi ha cert soroll (bandes més clares) i que en el cas de la segona sonda de color blau obtenim quatre fragments que hibriden amb la Pèrdua d’una diana de restricció sonda però com que el primer i l’últim són de la mateixa llargada apareixen en una sola (resultats amb diferents sondes) banda. Diana que es perd * } +/+ +/* */* +/+ +/* */* +/+ +/* */* sondes +/+ +/* */* Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA 8.1. VARIACIONS EN LES BANDES Si la intensitat de les bandes de l’heterozigot no sumen el mateix que la de l’homozigot pot ser degut a que s’hagi produït la inserció d’un element transposable que portava una diana nova. Les variacions, doncs, poden ser degudes a: • • • Inserció d’un element transposable entre dues dianes. Obtenim dos fragments però la suma d’aquests dos fragments, gràcies a la inserció d’aquest element, és major a la longitud del fragment d’origen (suposant que l’element transposable porta una diana de restricció incorporada). És a dir, tindríem un fragment més un altre tros (excés de material). Hibridació inespecífica de la sonda. Pot donar-se la situació que la sonda hibrida de forma inespecífica amb altres fragments i per tant, ens apareix soroll de fons. És a dir, molts cops aquestes sondes poden hibridar amb un grau de complementarietat elevat amb altres seqüències d’un gen fent que apareixin noves bandes que no tenen res a veure amb la mutació. En aquests casos és molt difícil discriminar, tot i que rentem amb molta astringència. Sonda massa gran que reconeix un fragment que té una longitud d’un dels fragments que ens interessa identificar. Per tant, no trobarem la presència/absència d’aquesta banda perquè les dues s’han ajuntat en una. Aquest cas correspon al de la segona sonda de color blau, ja que hi ha dos fragments diferents que tenen la mateixa longitud i per tant, no podem discriminar entre ambdues bandes. TEMA 3. Tècniques de blotting 18 Diagnòstic genètic molecular Pèrdua d’una diana de restricció (resultats amb diferents sondes) * } +/+ +/* */* +/+ +/* */* +/+ En el fons, l’aparició de múltiples bandes en el Southern és força freqüent. Ara, les úniques bandes que ens donen informació rellevant sobre la presència d’una determinada seqüència són les primeres (les que estan a la part superior). Diana que es perd +/* sondes */* +/+ +/* */* La resta de bandes poden donar informació alternativa però a la vegada poden induir a confusions. Detecció de mutacions en el DNA Hem de tenir en compte que les bandes informatives es vegin clarament i que són les primeres, per tal de poder donar un diagnòstic fiable tot i que moltes vegades els resultats del Southern blot no ho solen ser gaire perquè presenten força soroll de fons. Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Per altra banda, podem trobar diferències en els resultats obtinguts per l’efecte del temps d’exposició dels gels. A continuació podem veure els resultats del mateix Southern Diagnòstic genètic molecular blot però exposat més o menys temps. Pèrdua d’una diana de restricció (resultats amb diferents sondes) Diana que es perd * } +/+ +/* */* +/+ +/* */* +/+ +/* sondes */* +/+ +/* */* Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA Podem veure les bandes informatives en aquests casos. Es podria donar la situació que les bandes informatives no es puguin identificar per haver-nos passat amb el temps d’exposició. Si ens fixem i mirem el tercer carril, la banda superior desapareix si ens passem amb el temps d’exposició (hem de comparar el tercer carril de la primera fotografia amb el de la tercera). En aquest cas, aquesta banda que desapareix és Diagnòstic genètic molecular informativa i el fet de no detectar-la ens podria portar a confusions. Per tant, hem de Pèrdua d’una diana de restricció buscar un revelat per saber si el nostre resultat és fiable i així poder (resultats amb diferents sondes) dir si la mutació està absent o present. A vegades hem d’allargar el Diana que es perd * revelat una mica més per saber si aquests resultats són fiables o no. Una altra variació que ens podem trobar és el repartiment del substrat de forma heterogènia, el qual causa l’aparició d’una gran taca. Si aquesta banda és la que ens interessa i la taca ens ho tapa, no podrem donar un diagnòstic fiable. +/+ +/* */* +/+ +/* */* } +/+ +/* */* sondes +/+ +/* */* 19 TEMA 3. Tècniques de blotting Detecció de mutacions en el DNA Detecció de mutacions i metilacions en el DNA A més, si no anem amb cura amb els guants, podem generar soroll de fons per la pols que portin aquests guants. En aquests casos haurem de repetir el procediment. 8.2. CAS DE DEFICIÈNCIA EN 21-HIDROXILASA La deficiència en 21-hidroxilasa causa hiperplàsia suprarrenal congènita. Aquesta deficiència s’origina per una regió duplicada en tàndem adjacent al gen que codifica per la 21-hidroxilasa. Amb el temps, saltarà la regió promotora del gen i en conseqüència tindrem un pseudogen (no funcional, no s’expressarà). Tenim el cas d’una família, amb els dos pares heterozigots (gen funcional i pseudogen), un fill homozigot i un control poblacional sa. En aquest esquema podem veure indicades les dianes de la TaqI. Podem veure que en el gen de la 21-hidroxilasa funcional obtindríem un fragment de 3,7 kb i el pseudogen donaria un fragment de 3,2 kb. Utilitzem la sonda específica del gen que ens interessa i veiem que al fill li falta la banda de 3,7 kb (és homozigot per bandes de 3,2 kb), per tant, falta la banda corresponent al gen funcional. El control s’utilitza per comparar intensitats. En el control ambdues bandes són semblants. En els pares són menys intenses les que corresponen al gen que al pseudogen, fet que ens indica que els dos pares tenen una deleció que afecta al gen de la 21hidroxilasa. Per tant, tenen tant el gen funcional com el pseudogen, són heterozigots tant per la presència com l’absència del gen. El fill, en aquest cas, ha heretat els dos al·lels que corresponen a la deleció que no porta el gen de la 21-hidroxilasa, per tant, presenta dues còpies del pseudogen: no té la proteïna funcional. Per altra banda, si comparem les bandes de 6 kb i 7 kb, podem veure que els pares tenen una menor quantitat de seqüències repetitives: la deleció agafa més part. Quan analitzem el Southern, se’ns limita la regió. Per tant, podem obtenir informació a partir de la posició de la banda i de la intensitat. Si no miréssim la intensitat, utilitzant una detecció pro-fiable per poder quantificar, nomes podríem dir si tenim una banda o dues. És a dir, no sabríem si s’ha produït una mutació de novo o si els pares eren portadors de la mutació. La Diagnòstic genètic molecular intensitat, juntament amb la presencia i/o absència de les bandes o la seva posició ens donen elements informatius que ens ajuden a perfilar el diagnòstic. Deficiència en 21-hidroxilasa Human Molecular Genetics En síntesi, ens hem de fixar en que: • • Tom Strachan and Andrew P Read Falta la banda del gen funcional. El pares ja tenien una bona intensitat d’aquesta banda, és a dir, eren heterozigots per la deleció. Pèrdua d’intensitat relativa Desaparició de la banda Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA TEMA 3. Tècniques de blotting 20 8.3. ANÀLISI D’UN PEDIGRÍ – MALALTIA CAUSADA PER UNA DELECIÓ Diagnòstic genètic molecular Si analitzem el pedigrí que hi ha continuació (ho podem fer per luminescència també) ens hem de fixar en l’expressió de la banda i la seva intensitat. En aquest cas ens trobem davant d’un pedigrí que correspon a una malaltia causada per una deleció que afecta al fragment de restricció. Les mutacions que afecten a les dianes de restricció es poden reconèixer pel fet que observarem que apareix o desapareix aquesta diana: el patró de tall es modifica i en conseqüència obtenim dos patrons de tall de diferents llargades. deleció sonda Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA Aquesta mutació determinada afecta al fragment de restricció però no a la diana, donant lloc a un fragment de restricció més petit per manca interna de la regió original. Per tant, observaríem dues bandes: • • Banda salvatge. Banda mutant: més petita que la salvatge, correspon a la deleció. Ara bé, les delecions sempre donen lloc a fragments més petits i les insercions a fragments més grans? Doncs no, no sempre és així. Ens podem trobar en la situació que si la deleció inclou la diana de restricció, els enzims no podran tallar-la i per tant el fragment que queda en les dues dianes serà més gran del que s’espera detectar amb la sonda. En aquest cas, per exemple, una deleció comportaria la detecció d’un fragment més gran. Diagnòstic genètic molecular Els patrons que obtenim es poden interpretar de moltes maneres. Ara, quan fem Deleció diagnòstic genètic molecular, si coneixem la mutació que estem estudiant, ja sabem quins patrons possibles hi ha i quines interpretacions es poden du a terme de Deleció cadascun d’aquests. ( ) Sonda +/+ */- -/- +/+ */- -/- Per contra, si es tracta d’una malaltia nova de la qual no sabem quina mutació és la que la causa, aquesta mutació pot tenir moltes explicacions diferents: mutació puntual, deleció, substitució, inserció, etc. Aleshores, si només tenim els resultats d’un Southern blot Detecció en concret, podem tenir múltiples hipòtesis que expliquin aquests Detecció de mutacions i metilacions en el DNA de mutacions en el DNA resultats i en conseqüència, haurem de complementar amb altra informació. Si un fragment es deleciona, la distància entre les dues dianes és major que el fragment original que reconeix la sonda. Per tant, la sonda reconeix els fragments d’aquestes dianes i si la diana es perd per una deleció, la sonda reconeixerà i hibridarà amb un fragment més gran que l’original. TEMA 3. Tècniques de blotting 21 No totes les delecions són terminals, sinó que hi ha moltes que són internes. A partir d’un patró, nosaltres podrem donar diferents hipòtesis per explicar aquest patró. El que hem de fer és buscar informació complementaria. Si només treballéssim amb Southern blot, buscaríem altres enzims de restricció per poder tenir més informació sobre els patrons de restricció. Quan seqüenciem, obtindrem clarament quina és la causa de l’alteració del patró de restricció. 8.4. ANÀLISI D’UN PEDIGRÍ - DETECCIÓ DE LA DISTRÒFIA MIOTÒNICA En aquest pedigrí veiem que el marit té distròfia miotónica i ha tingut una filla que també se li ha diagnosticat aquesta distròfia. La filla s’ha casat i té dos fills, un afectat i l’altra no. Analitzem els fills mitjançant Southern blot i observem el següent: • • • • • • Individu I.1. Home afectat. Heterozigot. Individu I.2. Dona sana. Homozigota. Individu II.1 (filla del matrimoni I.1-I.2). Dona afectada. La filla ha heretat un al·lel del pare i un de la mare. Individu II.2. Home sa. Heterozigot. Individu III.1 (fill del matrimoni II.1-II.2). Nen sa. Homozigot. Individu III.2 (fill del matrimoni II.1-II.2). Nen afectat. Heterozigot. Ha heretat els dos al·lels del pare i cap de la mare. Si fos al revés, podríem dir que el pare biològic Diagnòstic genètic molecular no correspon al pedigrí. Distròfia miotònica El que ha passat amb l’últim individu és típic de les mutacions dinàmiques, (CTG)n que corresponen a microsatèl·lits. En aquest cas és un microsatèl·lit d’unes Anticipació quantes bases CTG que està repetit n Presenta (CTG)n símptomes més vegades. Aquests triplets a partir greus i a una edat més d’una certa grandària solen ser avançada inestables i quan passen del nombre, la grandària augmenta i comença a Expansió Inestabilitat a la augmentar el nombre de repeticions: línia germinal l’al·lel s’expandeix. Quan analitzem Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA aquest per Southern blot, emprem un enzim de restricció que inclogui la regió on està el triplet i en funció del nombre de repeticions el fragment serà més gran o més petit (si hi ha més repeticions, apareixerà una banda de major recorregut). En funció del nombre de repeticions, el fragment serà més gran o mes petit. La gran majoria de malalties es poden trobar per PCR però n’hi ha d’altres que s’han d’analitzar per Southern blot perquè si el fragment és massa gran la PCR no el pot amplificar. TEMA 3. Tècniques de blotting 22 Aquesta patologia depèn del fenomen d’anticipació. A mesura que hi ha individus amb un nombre major de repeticions abans es manifesta la patologia (a edats més avançades) i amb efectes més greus. Diagnòstic genètic molecular 80 CTGs Anticipació Presenta símptomes més greus i a una edat més avançada 120 CTGs 2000 CTGs A continuació tenim el cas de dues persones afectades de distròfia miotónica. L’àvia té 80 repeticions, la filla 120 i el fill 2000. Com podem comprovar, el que ha fet l’al·lel generació rere generació ha sigut expandir-se. La distròfia miotónica és una de les més freqüents en adults. L’àvia no presenta cap símptoma de la malaltia. A la filla se li podria diagnosticar la malaltia per certes característiques facials, ara bé, el Detecció de mutacions en el DNA fill d’aquesta té uns caràcters molt característics de la malaltia (es pot diagnosticar ràpidament). Per tant, aquesta malaltia cada cop és més greu i la simptomatologia s’avança en gran mesura. La detecció de les expansions de trinucleòtids és força simple. Detecció de mutacions i metilacions en el DNA 9. ANÀLISI DE PÈRDUA D’HETEROZIGOSI El Southern blot serveix per trobar pèrdues d’heterozigositat: un marcador que està en heterozigosi passa a estar en homozigosi o hemizigosi. Aquest és un dels elements de pronòstic que s’utilitza en la detecció del càncer, per exemple. Es basa en comparar el teixit sa amb el teixit tumoral i s’analitzen múltiples marcadors polimòrfics: SNPs i microsatèl·lits. El que fem és analitzar els marcadors que corresponen a una regió concreta (regió que volem estudiar). Obtindrem que alguns d’aquests polimorfismes analitzats es trobaran en heterozigosi, és a dir, que presenten dues bandes en el teixit normal. Aleshores, en el Diagnòstic genètic molecular teixit tumoral, presentaran únicament una banda (passen a homozigosi o hemizigosi): indicador de pronòstic. Anàlisi de pèrdua d’heterozigosi (LOH) • Es diu que hi ha LOH quan en la mostra analitzada d’un individu (ex. mostra tumoral) observem que un marcador es troba en homozigosi (o hemizigosi) quan en el teixit normal de l’individu el marcador es troba en heterozigosi Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA TEMA 3. Tècniques de blotting 23 Normalment el que es fa és un pronòstic més greu que si no es detectés la pèrdua d’heterozigosi. Això indica que ha passat alguna cosa en aquella regió que tu saps que hi ha supressors de tumors que solen estar implicats en aquest procés tumoral. Per tant, si es perd l’heterozigositat a la regió del gen supressor de tumors, agreuges el pronòstic probablement el creixement tumoral sigui molt més agressiu. 9.1. EXEMPLE DEL GEN RB Tenim l’exemple del gen RB: amb l’al·lel salvatge i l’al·lel mutant. Els casos en els que es podria donar pèrdua d’heterozigositat són els següents: • • • • • • No disjunció (pèrdua d’un cromosoma). Si es perd el cromosoma de l’al·lel salvatge també perds la funció del gen RB. Per contra, si es perd el cromosoma mutant, no passa res. No disjunció i duplicació (pèrdua d’un cromosoma i duplicació del que queda). Hi ha dos cromosomes però un és una còpia de l’altra. Recombinació mitòtica. Conversió gènica. Diagnòstic genètic molecular Deleció. Mecanismes que poden produir LOH Mutació puntual. Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA El pronòstic ens indica que hi ha un cert risc d’haver perdut la funció del gen en qüestió. Diagnòstic genètic molecular Aquesta pèrdua pot tenir diferents causes. Si analitzem marcadors polimòrfics de la regió Mecanismes que poden produir LOH on es troba la regió del gen del retinoblastoma, detectarem pèrdua d’heterozigosi en tots els casos excepte en la conversió gènica i en la mutació puntual: passen desapercebudes. A la conversió gènica no es detecta perquè es tracta d’una regió molt petita. TEMA 3. Tècniques de blotting Detecció de mutacions i metilacions en el DNA 24 Detecció de mutacions en el DNA “La pèrdua d’heterozigosi no assegura la pèrdua de la funció, però que no s’hagi perdut la heterozigosi tampoc implica que no hagis perdut la funció.” Es poden donar casos on perdem heterozigositat perquè realment s’ha produït una mutació del gen RB o per conversió gènica. Es tracta d’un diagnòstic indirecte, els marcadors de les regions ens informen dels propis marcadors però no del gen en concret. Aquest fet pel gen RB no té massa implicacions. El que passa és que hi ha moltes regions gèniques implicades en processos tumorals en les quals hi pot haver molts gens implicats o un únic gen implicat que encara no s’hagi determinat. 9.2. MARCADORS POLIMÒRFICS DE LA REGIÓ 17p (p53) – CARCINOMA DE COLON-RECTE És informació indirecta perquè ens basem en marcadors: no asseguren el que està passant. A continuació tenim casos en els quals es compara el teixit salvatge amb el tumoral. Tenim varis marcadors. Diagnòstic genètic molecular 17p (conté En el cas de la regió el gen que de codifica per la (p53) p53) no observem pèrdua Marcadors polimòrfics la regió 17p d’heterozigositat. Podem analitzar una regió i podem trobar pèrdua d’heterozigositat per Carcinoma de colon-recte tots els marcadors, però també per uns marcadors i no per altres. Diagnòstic genètic molecular En quins casos poden trobar-nos en que hi ha pèrdua d’heterozigositat per uns marcadors Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA Marcadors polimòrfics de la regió 17p (p53) i per uns altres no, per la mateixa regió analitzada? Aquest fet podria ser explicat per una Carcinoma de colon-recte deleció, per exemple. Només afectarà la En quins casos trobarem LOH per un part d’una regió que analitzes però en la marcadors però no per a d’altres en la mateixa regió analitzada? part que no estigui afectada per la deleció no hi trobarem res, només trobarem informació significativa als marcadors que estiguin inclosos en aquesta regió de la deleció. Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA Molts cops ens trobarem que la pèrdua d’heterozigosi afecta uns marcadors però noa tots. TEMA 3. Tècniques de blotting 25 9.3. CONFUSIONS DELS CASOS DE LOH En aquest exemple que tenim a continuació podem veure dues bandes i si ens fixem, en teoria no hi ha pèrdua d’heterozigositat en cap cas (comparant les cèl·lules tumorals amb les cèl·lules sanes). Les mostres que veiem a la imatge corresponen a cèl·lules sanes de la bufeta urinària i cèl·lules tumorals d’aquest mateix òrgan. En la gran majoria de casos de càncer veuríem una pèrdua d’heterozigositat, però en aquest cas això no es produeix. Ara bé, podem veure que en el primer gel les bandes de les cèl·lules tumorals són més intenses que les de les cèl·lules sanes. Per altra banda, si ens fixem en el segon gel, les Diagnòstic genètic molecular bandes de les cèl·lules sanes són més intenses que les bandes de les cèl·lules tumorals. Pel que fa al tercer cas, és al contrari, les bandes de les cèl·lules tumorals són força més LOH intenses. Sovint en els tumors sòlids es troben cèl·lules normals que L’explicació a aquest fet és que al analitzar les poden donar bandes de menor intensitat que poden cèl·lules tumorals es poden haver “col·lat” confondre els casos de LOH cèl·lules sanes. És a dir, els teixits que ens donaran per estudiar no sempre seran homogenis, hi pot haver cèl·lules tumorals infiltrades en la biòpsia que ens han passat per analitzar. Per tant, tindríem teixit normal junt amb teixit tumoral i evidentment, com que hi ha els dos al·lels presents, també apareixeran les dues Detecció de mutacionsbandes però en aquest cas, una molt menys intensa que l’altra (segon cas). i metilacions en el DNA Detecció de mutacions en el DNA En molts casos veurem que les bandes continuen estant però hi ha un canvi d’intensitat important d’una respecte l’altre: només hi ha una part del material analitzat on s’ha produït la pèrdua d’heterozigositat i l’altra part és resultat d’una mostra heterogènia on hi ha barrejat tant teixit tumoral com sa. En aquest cas, doncs, fixant-nos en la intensitat de les bandes, diríem que l’informe és erroni perquè sí que hi ha pèrdua d’heterozigositat. 10. ENZIMS EMPRANTS EN EL DIAGNÒSTIC GENÈTIC MOLECULAR Finalment, també podem detectar canvis epigenètics (modificacions químiques de les bases nitrogenades mitjançant Southern blot): metilacions de les citosines poden alterar la diana de restricció original de l’enzim degut a que hi ha enzims sensibles a les metilacions. Per això, mitjançant Southern blot utilitzem enzims de restricció que sensibles i insensibles a les metilacions per tal de poder comparar. El més freqüent és el parell d’enzims isoesquizòmers següents: • HpaII. • MspI.
TEMA 3. Tècniques de blotting 26 Aquests enzims detecten la mateixa diana: CCGG. Aquesta diana pot estar tant a regions promotores o regions de les quals ens interessi detectar metilacions als dinucleòtids CG. Característiques dels enzims: • • HpaII és sensible a les metilacions. Si està metilada, no talla. MspI és insensible a les metilacions. Talla tant si està metilada com si no ho està. Diagnòstic genètic molecular Per tant, mitjançant Southern blot haurem de comparar els dos patrons de tall. Altres tècniques també utilitzen aquests enzims de manera diferent. Utilització d’enzims de restricció que discriminen si les C estan o no metilades • HpaII sensible a la metilació • [Diana CCGG] • MspI no es veu afectat per la metilació • [Diana CCGG] Comparació del fragments generats per la digestió dels dos enzims Detecció de metilacions en el DNA 10.1. APLICACIÓ DELS DOS ISOESQUIZÒMERS Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Diagnòstic genètic molecular a) Sense metilació Imaginem que tenim tres dianes que són reconegudes pels dos enzims i que cap d’elles, en principi, està metilada. Si digerim amb els dos enzims, com no hi ha cap metilació, aquests tallaran les mateixes dianes de forma que obtindrem el mateix patró de restricció en cada cas. Detecció de mutacions i metilacions en el DNA b) Amb metilació Detecció de metilacions en el DNA Si la diana està metilada (tal com veiem a la imatge superior), HpaII no talla, és a dir, seria una situació equivalent a que s’hagués perdut la diana. Per contra, com MspI és insensible a les metilacions, sí que tallarà. Aleshores, el patró de restricció obtingut amb aquest enzim serà el mateix que en el cas anterior (és a dir, sense metilar). En conseqüència, podem utilitzar l’enzim MspI com a patró de referència. Per tant, si hi ha metilació, el patró de restricció de HpaII canvia: desapareixen dues bandes antigues i n’apareix una de nova (suma de les dues anteriors) degut a que no s’ha digerit la diana pels efectes de la metilació. TEMA 3. Tècniques de blotting 27 ular En el cas de pèrdua d’heterozigositat no sempre desapareixen aquestes bandes, sinó que continuen estant. Aquestes són menys intenses, perquè no totes les còpies del DNA estan metilades en el mateix punt i per tant, hi haurà alguns còpies que presenten metilació i altres que no presenten metilació. Ara bé, com sabem que no és degut a una menor quantitat de DNA carregada al primer carril? Ens hem de fixar en la intensitat relativa de les bandes. Si hi ha bandes que tenen bem que no ésla mateixa intensitat i altres menys, és perquè hi ha més quantitat que correspon a una a una menor banda que a l’altra, no perquè la quantitat de DNA total sigui menor. És a dir, si totes les itat de DNA bandes del carril són menys intenses és perquè hi ha menys quantitat de DNA però si una banda perd molta més intensitat que la resta, això significa que hi ha menys quantitat en al primer carril? la pròpia banda. Podem saber quina proporció de molècules presenten metilació de la diana? Per poder determinar la proporció de molècules que presenten metilació hem de mirar el grau d’intensitat del carril i després mirar la pèrdua d’intensitat d’una banda respecte l’altra. es e la Per tant, el percentatge de pèrdua d’intensitat d’una banda indica el percentatge de còpies metilades i còpies no metilades. Aleshores, si no apareix la banda estarà 100% metilat i si només hi ha un 50% de pèrdua d’intensitat, la meitat estaran metilades. Detecció de metilacions en el DNA 10.2. CAS DELS RATOLINS TRANSGÈNICS El grau de metilació de la regió promotora del transgen es determina per comparació de Diagnòstic genètic molecular la intensitat relativa de la banda d’1,04 kb obtinguda per MspI envers a l’obtinguda per HpaII. 5993 M H 6044 M H 6057 M H 6065 M H 1,04 kb Ratolins transgènics. El grau de metilació de la regió promotora del En aquest esquema només es mostren els resultats de la banda que presenta diferents transgen se determina per a comparació de la intensitat relativa de la banda d’1,04 kb obtinguda per MspI envers a l’obtinguda per intensitats en cada mostra (es dona per suposat que la resta té la mateixa intensitat). Els HpaII.
resultats que observem són els següents: • • Dues primeres mostres . La intensitat entre bandes és exactament igual: no hi ha Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de metilacions en el DNA hagut metilació. Dues últimes mostres. La intensitat entre les bandes és diferent: sí hi ha hagut metilació. TEMA 3. Tècniques de blotting 28 Ara bé, es poden donar variacions en l’expressió d’aquestes bandes: hi ha ratolins que mai les expressen i altres en determinats moments. 10.3. MECANISMES DE DEFENSA CONTRA SEQÜÈNCIES ESTRANYES Els transgens inserits es comporten com a seqüències estranyes i com a mecanisme de defensa, les cèl·lules tendeixen a metilar-les per protegir-se. Hi ha casos de gens de còpia única que si es metilen, no s’expressen. A continuació tenim un organisme transgènic al que se li ha inserit un transgen sense cap problema però que no l’ha expressat perquè s’ha metilat i només s’havia inserit una sola còpia. Aquest fet sol passar amb transposons i elements mòbils. La majoria de mamífers metilen per evitar la inestabilitat que generen els ET. En processos tumorals hi ha hipometilacions generales que afecten als ET i que deriven en inestabilitat genòmica i produeixen càncer (el mateix passa amb transgens). Un dels marcadors més importants, pel que fa al DNA, és la citosina metilada (5metilcitosina). Sabem que en el cas dels mamífers aquesta citosina està implicada en la regulació de l’expressió gènica i que una hipermetilació pot silenciar un gen. Per contra, una hipometilació pot reactivar aquesta expressió. Ara bé, fa pocs anys es va trobar que la forma hidroxilada de la citosina metilada (5hidroximetilcitosina) també es pot considerar com un marcador epigenètic més. Diagnòstic genètic molecular Figure 2 Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de metilacions en el DNA Es va trobar que els bacteriòfags de tipus T presentaven aquesta 5-hidroximetilcitosina com a mecanisme de protecció del seu DNA. Aquesta forma hidroxilada es pot glucosidar fàcilment i és aquesta última forma la que impedeix que els enzims de restricció tallin el cromosoma bacterià. Trends in Pharmacological Sciences 2014 35, 384-396DOI: (10.1016/j.tips.2014.05.004) Per altra banda, s’ha trobat que la 5-hidroximetilcitosina està associada a processos d’expressió gènica en cèl·lules de mamífer, especialment en cèl·lules del sistema nerviós. Aquesta forma s’origina a través de l’oxidació de la 5-metilcitosina, de forma que s’hidroxila aquesta molècula obtenint la 5-hidroximetilcitosina. A continuació, hi ha enzims que modifiquen aquesta 5-hidroximetilcitosina donant lloc a la 5-formilcitosina i a continuació a la 5-carboxilcitosina. TEMA 3. Tècniques de blotting 29 Aquestes reaccions es consideren com una part del procés de desmetilació perquè tant la 5-formilcitosina com la 5-carboxilcitosina són escindides per una glucosidasa de la timina del DNA. És a dir, donen lloc a punts bàsics per la reparació per escissió de bases (ja que són bases “rares” i s’escindeixen), reparant retornant una citosina. Inicialment es pensava que podria ser un procés de desmetilació de la 5-metilcitosina però la 5Diagnòstic genètic molecular hidroximetilcitosina es troba associada a canvis d’expressió gènica, sobretot en les cèl·lules del sistema nerviós i en cèl·lules embrionàries. Així com la 5-metilcitosina reprimeix, la 5-hidroximetilcitosina activa la expressió dels gens. Per tant, al obtenir la 5-hidroximetilcitosina, passem de tenir gens reprimits a tenir Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de metilacions en el DNA gens actius. Aleshores, ens pot interessar com a element a analitzar sobretot quan es troba que algunes patologies lligades al sistema nerviós van associades a canvis de patró de metilació o hidroximetilació de les citosines. En conclusió, podem utilitzar aquestes bases com indicadors per estudiar certes malalties. Trends in Pharmacological Sciences 2014 35, 384-396DOI: (10.1016/j.tips.2014.05.004) Si utilitzem aquests isoesquizòmers, com HpaII és sensible a qualsevol metilació, tant sigui 5-metilcitosina com 5-hidroximetilcitosina, no tallarà. Diagnòstic genètic molecular HpaII sensible a la metilació • [Diana CCGG] MspI no es veu afectat per la metilació • [Diana CCGG] Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Per altra banda, MspI talla tant un com l’altra. Per tant, no podrem distingir si es tracta d’un tipus de metilació o d’un d’altre. Ara, el que sí que podem fer és tractar el DNA per transformar la 5-hidroximetilcitosina en glucosil-5hidroximetilcitosina emprant una glucosil transferasa, la qual sí que pot bloquejar l’acció de MspII. Diagnòstic genètic molecular Detecció de metilacions en el DNA HpaII sensible a la metilació • [Diana CCGG] MspI no es veu afectat per la metilació MspI no pot tallar 5-ghmC • [Diana CCGG] Detecció de mutacions i metilacions en el DNA TEMA 3. Tècniques de blotting Detecció de metilacions en el DNA 30 Això vol dir que si es troba en la forma glucosidada, cap dels dos enzims tallarà aquesta diana. Per tant, tindrem la possibilitat de distingir, mitjançant aquests dos enzims, si les citosines que estan metilades són 5-metilcitosines o 5-hidroximetilcitosines. Aleshores, el que hem de fer és treballar amb mostres del DNA que vols estudiar tractant una mostra amb glucosil transferasa i l’altra no. A continuació es procedeix a digerir i si amb l’enzim MspI, si es tracta de 5-hidroximetilcitosina, no s’immutarà (és a dir, tallarà); per contra, si està present la glucosil transferasa, no podrà tallar i en conseqüència, Diagnòstic genètic molecular podrem distingir els patrons de tall. a amb la metilació És a HpaII dir, si sensible no tractes glucosil transferasa no s’altera el patró (l’enzim continua • [Diana CCGG] tallant). Per contra, si tractes amb la glucosil transferasa, si aquesta metilació fos deguda MspIun nopatró pot tallar 5-ghmC MspI no es veude afectat per la metilació a una hidroxilació la 5-metilcitosina donaria alterat. Si tenim 5hidroximetilcitosina, com HpaI no talla com el MspII, obtenim un patró de tall diferent. • [Diana CCGG] En conclusió, en funció del canvi del patró sabrem si tenim 5-hidroximetilcitosina o 5metilcitosina com a causant d’aquesta alteració . Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de metilacions en el DNA Fins aquí arriben els canvis epigenètics que podem detectar mitjançant Southern blot i que podem utilitzar per detectar variacions pel que fa a la quantitat i a canvis de seqüència i variacions que afectin la composició química de les bases nitrogenades: es pot aplicar a la detecció de variacions dels patrons de metilació. Diagnòstic genètic molecular 10.4. LLISTA D’ENZIMS EMPRATS EN EL DIAGNÒSTIC A continuació tenim una llista dels enzims més utilitzats per detectar canvis epigenètics: Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de metilacions en el DNA TEMA 3. Tècniques de blotting 31 El que fem és analitzar els promotors de varis gens. Ara, trobarem que s’han incorporat múltiples enzims que utilitzem en l’estudi de l’anàlisi de canvis epigenètics del DNA. Com Diagnòstic genètic molecular bé hem explicat anteriorment, alguns són enzims que detecten metilacions, és a dir, són específics de dianes que estan metilades. Parella d’isoesquizòmers sensible/insensible a la metilació Control robust que permet assegurar que el canvi en el patró de restricció no és degut a una mutació Endonucleasa específica de metilació Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de metilacions en el DNA Podem utilitzar doncs: • • Enzims isoesquizòmers. Enzims que tallen per les metilacions. Els enzims que tallen de forma específica les metilacions (com el McrBC) detecten citosines metilades i tallen quan en troben dues seguides d’una purina quan estan en dues cadenes oposades i a una distància que pot arribar fins a 3 kb. Simplement talla, i si es metila una citosina interna d’aquesta diana no el detectaria, ja que en detecta dues. Per tant, no té la mateixa especificitat. Ara, únicament s’utilitza per detectar citosines metilades. Aquests enzims específics de metilació funcionen al revés que les parelles d’isoesquizòmers, tallen quan hi ha metilació. Podem utilitzar diferents enzims en funció Diagnòstic genètic molecular del que ens interessi estudiar TEMA 3. Tècniques de blotting Detecció de mutacions i metilacions en el DNA Detecció de metilacions en el DNA 32 La parella d’isoesquizòmers ens ofereix un control, de manera que els canvis que trobem en els patrons, sabem que no són deguts a mutacions (les mutacions també poden canviar l’especificitat de la diana, és a dir, si es reconeguda o no per l’enzim). Si utilitzem aquest parell ens podem assegurar que els canvis són deguts a metilacions. De forma contrària, si utilitzem els enzims específics de metilació, els canvis podrien ser originats per mutacions i no per metilacions. Per tant, la informació que donen les parelles d’isoesquizòmers és molt més robusta que la que donen els enzims que tallen únicament Diagnòstic genètic molecular per metilacions (ja que no es pot assegurar). Si ens interessa estudiar el grau de metilació, hidroximetilació o qualsevol altre forma oxidada de la 5-metilcitosina es fan servir tècniques analítiques de cromatografia, espectrometria de gasos, etc. Hi ha tota una sèrie de tècniques analítiques que són molt costoses, no sempre els tenim a mà. Són les tècniques que s’utilitzen per tenir una idea global del nivell d’informació. Poden detectar totes les formes de metilació de la citosina. sistemes de detecció immunològica o anticossos, El més econòmic són els que utilitzen Detecció de metilacions en el DNA tot i que tampoc són econòmics. En els casos de les formes oxidades més rares, normalment hem d’intentar potenciar la senyal perquè n’hi sol haver molt poca i sol ser molt dèbil. En lloc d’utilitzar anticossos secundaris conjugats amb una peroxidasa el que fem és utilitzar anticossos conjugats amb varies biotines tot utilitzant una tercera capa amb estreptomicina per tal d’incrementar el senyal dels grups químics que tenen incorporades les peroxidases. Amb això aconseguim un senyal més potent, ja que igual Diagnòstic genètic molecular algunes formes poden passar desapercebudes. Detecció de mutacions i metilacions en el DNA La 5-metilcitosina sol donar problemes les formes Deteccióno de mutacions i metilacions en el DNA però Detecció dealtres metilacions en el DNA sí. Es poden utilitzar tècniques que permeten distingir la distribució pel genoma (a més de la quantitat de metilació): tècniques de seqüenciació de nova generació. Aquestes tècniques permeten trobar com estan distribuïdes aquestes variants estranyes de les bases nitrogenades. TEMA 3. Tècniques de blotting 33 11. ALTERNATIVES AL BLOTTING Diagnòstic genètictècniques alternatives molecular Aquestes tècniques tenen moltes basades en la PCR, hibridacions in situ fluorescent, etc. Moltes són avantatjoses respecte les tècniques de blotting, més rapides, donen més informació, etc. Moltes vegades el Southern blot ha de complementar aquesta informació, degut a que igual no és del tot precís. Detecció de mutacions i metilacions en el DNA TEMA 3. Tècniques de blotting 34 ...