Tema 4 (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 22
Fecha de subida 11/02/2015
Descargas 63
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Tema 4. POLIMORFISME ESTRUCTURAL DEL DNA CORBAMENT (“BENDING”) EN L’ESTRUCTURA DEL DNA Hi ha diversos motius que justifiquen el corbament del DNA. Des del punt de vista estructural, cal que el DNA sigui capaç de corbar-se per tal de poder introduir-se dins del nucli de la cèl·lula.
Per una altra banda, el DNA necessita el corbament per la funció ja que per exemple, l’operó arabinosa té el punt d’inici de la transcripció però, hi ha proteïnes reguladores que depenent com es produeixi la interacció l’operó tindrà activitat o no. Observem a la figura A els diferents llocs de regulació que trobem a l’operó d’arabinosa. A la figura B veiem un loop de repressió on no hi ha activitat. En la figura C, gràcies al corbament del DNA, s’ha pogut elaborar correctament la interacció per formar el dímer d’AraC fent que l’operó esdevingui actiu. Si el DNA no es deixés doblegar, les proteïnes no podrien interaccionar entre sí i per tant no es podria activar.
DIFICULTAT DEL CORBAMENT DEL DNA Si tenim un DNA lineal i volem que es corbi podríem fer que es convertís en un semicercle. Aquest corbament és energèticament més o menys difícil en funció de la longitud del DNA, expressada en parelles de bases.
Si estudiem energèticament la reacció, observem que la corba ens indica que com més llarg és el DNA, més fàcil és corbar-lo.
Això és així perquè els trossos llargs reparteixen la tensió en una longitud més gran i per tant no costa tant doblegar-lo.
L’energia que s’ha d’aplicar és menor perquè no estàs forçant tant l’estructura. Si ens hi fixem a l’esquema podem determinar que no estem parlant d’energies petites sinó que el treball que hem de fer és gran, de 5 a 10 Kcal/mol.
Associat a aquest tema hi ha una magnitud que hem de tenir en compte i que rep el nom de “persistence length” que ho podem traduir com longitud de persistència del DNA. Aquesta magnitud ens indica la longitud del DNA que quan es troba en dissolució a temperatura ambient es manté com una entitat rígida.
Imaginem que tenim DNA de diverses longituds, hi ha una determinada longitud que és tal que en dissolució a temperatura ambient es mantindrà com a una barra rígida; a partir d’aquesta longitud, el DNA en dissolució tindrà formes corbades diverses. Si el DNA és molt més llarg al que té longitud de persistència es corba molt de forma aleatòria.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 La longitud de persistència té a veure amb l’energia tèrmica de la dissolució a temperatura ambient. Sabem que a qualsevol temperatura, les molècules d’aigua, de solut o de DNA tenen una determinada energia cinètica. Per tant, temperatura ambient, el DNA pateix xocs amb les molècules d’aigua; aquestes molècules d’aigua tenen una energia cinètica però que no és suficientment gran com perquè a les que estan per sota de la longitud de persistència provoqui un corbament.
La longitud de persistència és d’aproximadament 150 – 200 parelles de bases i a partir de 1000 parelles de bases es produeix el corbament aleatori. Cal tenir present que a mesura que augmenta la temperatura, més curvatura hi ha.
CORBAMENT INTRÍNSEC O INDUÏT PER PROTEÏNES El corbament del DNA pot ser intrínsec o bé induït per proteïnes. Fins ara hem parlat de DNA lliure en dissolució i de seqüència aleatòria. Ara plantegem coses més concretes i és que el DNA dins de la cèl·lula el podem trobar corbat degut a proteïnes que el corben, inclús si tenen longituds inferiors a la de persistència.
Per una altra banda, trobem seqüències particulars que fan que el DNA estigui corbat per sí mateix, és a dir, està intrínsecament corbat. D’aquest tipus de seqüències no hi ha gaires i s’han estudiat poques. Més endavant veurem un estudi d’un DNA particular.
Exemple 1. Corbament de DNA induït per proteïnes: DNA mitocondrial de tripanosomes El DNA mitocondrial dels tripanosomes (tipus de protozou) són molts minicercles de DNA circular concatenats. Aquest DNA es coneix amb el nom de Kinetoplast DNA (kDNA).
Aquest DNA té de particular que es pot extreure dels tripanosomes i linealitzar mitjançant un tall estratègic amb un enzim de restricció. A la imatge de l’esquerra veiem dues molècules de DNA que corresponen a dos minicercles de tripanosoma que han estat linealitzats, A la imatge de la dreta observem una mena d’anella oberta petita que ha volgut elaborar un corbament bastant pronunciat. A la imatge de la dreta, observem com aquest tros té tendència a corbar-se i formar petits cercles que no estan tancats covalentment. Per tant, podem dir que tenen la propietat intrínseca de formar un cercle i de corbar-se molt.
S’ha pogut determinar que en aquest DNA hi ha unes seqüències concretes que tenen tendència a fer estructures circulars per corbament intrínsec.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Exemple 2. Corbament induït per proteïnes: repressor 434 i histones El repressor 434 quan s’uneix de forma natural al DNA provoca que quedi corbat i per tant, podem dir que aquesta proteïna indueix el corbament.
El corbament més important del DNA és el que produeixen les proteïnes histones entre les quals trobem H3,H4, H2B, HA... el conjunt d’histones són capaces de corbar un tros de DNA de menys de 200 pb i li fan donar dues voltes, és a dir, corben el DNA 360° dues vegades. Recordem que la longitud de persistència és de 200 pb i per tant, les histones corben el DNA per sota d’aquesta longitud.
L’angle de corbament és determinat agafant l’eix de DNA que està en la zona esquerra i agafant l’eix de DNA de la zona dreta. L’angle de corbament o l’angle de bent és el que veiem a la imatge.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 SIGNIFICAT DEL CORBAMENT Per tal de veure què vol dir que el DNA es corbi el que farem és observar un fragment de DNA, a la imatge veiem un esquema realista on s’indiquen les parelles de bases. A aquest DNA li farem un corbament de 45°, per cada costat, és a dir un corbament total de 90° que cal tenir present que no és gaire important si ho comparem amb els anteriors. Trobem diverses possibilitats: (a) En el punt de canvi abrupte d’angle, les parelles de bases estan molt forçades. Si observem la gràfica inferior i representem l’angle de roll respecte el número de la parella de base, veiem que quan es passa pel punt 0 i el punt 10 l’angle de roll es torna molt elevat, és a dir, són punts de molta tensió i de gran impediment estèric.
(b) En aquest cas, en comptes de repartir en dos llocs el corbament ho fa d’una manera em 5 de manera que, es genera tensió en més d’una zona. A la gràfica veiem que l’angle de roll continua tenint canvis abruptes en 5 llocs però la tensió queda millor distribuïda.
(c) Veiem altres situacions en les quals hi ha dues zones de tensió però en comptes que caigui tot en una parella de bases i la que ve després, ho reparteix en diverses parelles de bases i acumula la tensió. En conseqüència, en la gràfica de l’angle de roll hi ha dues zones que tenen un cert angle de roll.
(d) Si la tensió es reparteix de manera harmoniosa per totes les parelles de bases aconseguint també com a conjunt un angle de 90º. En aquest cas, veiem al gràfic que l’angle de roll té valors sinusoïdals però no hi ha cap valor abrupte de manera que la tensió es reparteix de manera uniforme.
Com a conclusió podem dir que si un agafa un tros de DNA curt i el corba, està alterant profundament l’estructura de la doble hèlix.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 CORBAMENT INTRÍNSEC Aprofitant els estudis que es van elaborar sobre el kDNA, aprofundirem en el corbament intrínsec del DNA.
El DNA de tripanosoma mitocondrial (kDNA) ha estat estudiat per tal d’observar el corbament intrínsec i l’investigador Crothers (1986) va ser molt important en aquest àmbit.
Mitjanant mètodes electroforètics va estudiar aquest DNA tan curiós que es forma de manera espontània; l’electroforesi va ajudar molt ja que depenent com tallaven el DNA obtenien una mena de C o una mena de S, degut al corbament intrínsec. Aprofitant les diferències de mobilitat va poder esbrinar què estava passant amb aquest DNA que de manera intrínseca es corba.
El resultat que van trobar, combinat amb la seqüència que té aquest DNA és bastant sorprenent. Van observar que el DNA es corba degut que hi ha seqüències repetides de 5 o 6 A cada cert temps. Recordem que seqüències del tipus AAAAA i TTTTT són estructures molt rígides. Així doncs, entre les juntures de dos trams rectes es genera un corbament i que són d’aproximadament 20° Com que aquestes repeticions es donen 18 vegades en el kDNA obtenim un total de 360° i això permet demostrar que es formin les estructures circulars intrínseques.
Cal tenir present que la projecció és d’un cercle però tridimensionalment està obert i en un mateix pla. Per una altra banda, podria ser que aquesta seqüència en comptes de donar un cercle tancat adquirís una estructura de ziga – zaga però en el cas del kDNA adquireix aquesta forma.
Per tant, cada 5 o 6 parelles de bases es produeixen angles d’interfase que fa que estiguin en un mateix pla. Si les passes es fessin algunes cada 3 pb, altres cada 5, altres cada 8, etc. donarien juntures amb angles diferents i per tant, no estarien en el mateix pla.
Si recordem el gràfic de la pàgina anterior, podem dir que la figura b és la que il·lustra l’estudi elaborat per Crothers ja que el kDNA és abrupte i amb determinats punts d’angle de roll. Per una altra banda, la figura que correspon als nucleosomes és la d on el plegament és monòton.
A la imatge superior dreta veiem que els talls es podien elaborar per diferents llocs. Si es tallava per 1 obteníem fragments amb mobilitat molt petita i si es tallava per 2 obteníem fragments amb mobilitat màxima; per tant, hi havia una gran dependència entre la mobilitat i el lloc de tall. Això era així perquè quan es tallava per 1, el fragment de DNA tenia forma de C, en canvi, si es talla per 2 obteníem un fragment on gairebé no hi ha curvatura. Aquest fet els hi va permetre trobar el centre de la seqüència que produïa la curvatura.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Proteïna TBP En el moment en el qual es va poder cristal·litzar una estructura es va fer un gran avanç en el coneixement sobre el corbament del DNA. A la imatge veiem TBP que és la primera proteïna que quan hi ha la transcripció s’uneix al DNA, a partir d’aquest moment s’uneixen altres proteïnes com factors de transcripció o la DNA polimerases. La proteïna TBP s’uneix a la caixa TATA que conté una seqüència molt especial i que té a veure amb la transcripció. Sabem que aquesta seqüència s’anomena així perquè conté una estructura d’aquest tipus.
En 1873, van ser capaços de fer cristalls que contenien la caixa TATA i la proteïna TBP. Un cop elaborat el cristall, mitjançant difracció de raigs X, van determinar quina era la estructura de la TATA box en funció de la TBP.
Van observar un DNA, que conté la seqüència TATA, molt deformat de manera que, la proteïna TBP corba molt el DNA sense alterar la seva covalència (L es manté constant). Tot i que aquesta estructura no sigui de DNA circular, podem considerar que aquest corbament és equivalent a un augment local de W. Això s’explica perquè considerant L constant, quan hi ha un corbament la T disminueix locament, de manera que, es produeix un desenroscament del DNA (W augmenta) d’aproximadament 14° per parella de bases.
Els autors van arribar a la conclusió que per l’efecte de pinça que elabora aquesta proteïna és lògic que es produeixi un desenroscament ja que ha d’entrar i posteriorment s’ha de produir la transcripció, per la qual cosa es requereix que el DNA s’obri.
La seqüència TA no és una seqüència qualsevol i és que quan trobem una purina i seguidament una pirimidina s’ha de produir un cert angle de roll per aconseguir que es produeixi un bon solapament de bases i a més, un slight significatiu.
Com que el DNA és una estructura contínua, aquests canvis poden provocar alteracions en l’estructura. En concret, vam dir que si tenim un slight significatiu equival a un canvi en l’angle de twist, de 35° a 28°. Quan hi ha successius pisos de purina i pirimidina, el DNA està canviant l’angle de twist, és a dir, s’està desenroscant.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 La conclusió addicional és que si tenim un DNA i aquest conté regions que són del tipus GC, com que tenen 3 ponts d’hidrogen, direm que fan unions fortes; En canvi, les regions que tenen T i A direm que són més dèbils ja que tenen ponts d’hidrogen. Per una altra banda, les regions que alternen les bases són unions intermèdies.
Cal tenir present que les regions que presenten T i A no només són dèbils pel fet de presentar un pont d’hidrogen menys a cada parella de bases sinó perquè a més, varien el seu angle de twist i per tant són regions d’unions molt febles. És a aquestes regions “very weak” a les quals s’uneix la proteïna TBP BASES MAL APARELLADES S’han fet cristalls d’oligonucleòtids que contenen bases mal aparellades i posteriorment s’ha elaborat un estudi de l’estructura de DNA que resulta, per tant, quan parlem de bases mal aparellades ho podem fer amb propietat. Quan es va realitzar l’estudi es va veure que entre G i A es poden formar ponts d’hidrogen de manera que, tot i haver-hi un mal aparellament es pot formar una doble hèlix.
A la imatge veiem representat parelles de bases mal aparellades però en aquest cas tenen la “sort” de tractar-se d’una purina i una pirimidina; per tant, la distància que hi ha entre els carbonis del sucre (lloc que determina el solc petit) correspon a la distància típica que es dóna en una doble hèlix normal. En aquest cas, la tensió que representen les bases mal aparellades en l’estructura de la doble hèlix no és molt gran.
En canvi, si les dues bases mal aparellades són bases grosses, la distància entre carbonis augmenta fins a 12,3 Å, és a dir, l’estructura se surt de la mida normal. Una solució que adopten les bases per resoldre aquest problema és elaborar un canvi en la conformació; en comptes de tenir conformació anti les dues bases, la A passa a syn i la G es queda en anti.
Amb això aconseguim que la orientació d’A canviï i que la distància entre els carbonis que s’uneixen a la ribosa sigui de 10,7 Å, és a dir, molt més similar a la distància que trobem en una hèlix normal (10,3 Å).
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Quan es van estudiar els oligonucleòtids es va trobar que el canvi de conformació de la A a syn no era la única solució al problema de les bases mal aparellades. En diverses ocasions, quan s’elaborava l’anàlisi per raigs X es podia veure que totes dues bases es mantenien en la conformació anti. Per tant, en aquest cas la doble hèlix és normal i on trobem GA s’engruixirà una mica i després es tornarà a encongir. Això es va trobar en un oligo on trobàvem bases alterades consecutivament i pot ser aquest el motiu pel qual la doble hèlix no es veia tan alterada.
BASES DESAPARELLADES També podem trobar oligos en els quals en la hibridació hi ha bases que no hi caben i que estan desaparellades, en aquest cas, la doble hèlix continua formant-se però, aquestes bases es troben fora de l’estructura. En la gran majoria dels casos, les bases que es troben desaparellades elaboren un loop que les exclou tot quedant a la part externa de la hèlix.
Cal tenir present però, que no sempre s’exclouen les bases desaparellades ja que s’han trobat casos de cristalls on les bases tot i no tenir parelles, com que són planes, són capaces d’intercarlar-se com si es tractessin d’un agent intercalant.
ESTRUCTURES INDUÏDES PER LA TENSIÓ SUPERHELICOÏDAL Veiem a la imatge un DNA que sembla un DNA lineal però imaginem que està dins d’un cercle. Si dins d’aquest DNA hi ha tensió superficial es poden produir fenòmens estructurals per tal d’alliberar aquesta tensió. Concretament hi ha 4 estructures que permeten fer-ho.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Estructures intramoleculars Formació de bombolles Quan es formen bombolles en un DNA amb tensió superhelicoïdal el DNA es desenrosca totalment en una part del DNA.
S’ha demostrat que per cada 10 pb que passen a la bombolla es genera una volta positiva de W; per tant, si hem de contrarestar 4 unitats positives de W, a la bombolla trobarem 40 parelles de bases.
Cal tenir present que la bombolla es produirà en la part de la seqüència on trobem T i A, sobretot en llocs on la seqüència sigui del tipus TATA. Recordem que aquestes zones són d’interaccions febles.
Formació de hairpins Una altra solució per relaxar la tensió superhelicoïdal és elaborant estructures del tipus hairpin (pinça, “horquilla”). Quan un hairpin va acompanyat d’un altre hairpin a l’altre banda es poden fer complementacions entre aquestes dues zones i obtenim estructures en forma de creu anomenades cruciformes. Per cada 10 parelles de bases que trobem en un cruciforme es relaxa una volta positiva de W, és a dir, el mateix que en el cas anterior.
Cal tenir present que una estructura hairpin no es pot elaborar a qualsevol lloc ja que cal que el DNA que estem estudiant sigui del tipus palindròmic. A més, per tal que el DNA tingui tendència a elaborar aquestes estructures ha de presentar tensió superhelicoïdal.
Estudi de la formació de bombolles i hairpins Nucleasa S1 Per tal d’estudiar o demostrar que es forma un hairpin o una bombolla hem de recórrer a la nucleasa S1 que talla el DNA monocadena. Per tant, si tenim un cercle que deixa de ser doble cadena perquè s’ha produït una d’aquestes estructures, la nucleasa serà capaç de tallar el DNA. Mitjançant una electroforesis o microscòpia podrem determinar si un DNA està tallat o no i en conseqüència si presenta alguna d’aquestes estructures o no.
Observem a la imatge una seqüència de DNA tipus palindròmica de manera que, aquestes seqüències són complementàries entre sí i si s’uneixen poden elaborar hairpins.
Com que volem fer un experiment del tipus electroforètic, volem veure les bandes bé i a més a més, amb una precisió de seqüència. Per començar ens hem de centrar únicament en una de les dues estructures palindròmiques i això ho podrem aconseguir fent una marca radioactiva en un punt (veurem més endavant com es fan); si revelem el gel per una autoradiografia únicament veurem aquella cadena que hem marcat.
Els autors digereixen amb la nucleasa S1 els hairpins de manera que, esperem que s’elaborin talls en la llaçada que és monocadena i observarem únicament en l’autoradiografia aquells trossos que estan marcats.
Si ens fixem en el gel, els autors senyalen la seqüència que trobem, és a dir, a quina base correspon cada banda. Això ho poden fer gràcies que el DNA està marcat. Per tant, considerant que l’extrem marcat és el 3’, si el tall es fa molt a prop d’aquest serà molt petit; en canvi, en aquelles zones allunyades de 3’ obtindrem trossos més llargs.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Observem també que els autors sotmeten el dúplex a la nucleasa S1 als mateixos temps i obtenen digestió. Això és degut que als extrems de la doble hèlix hi ha monocadena ja que quan el DNA es troba en dissolució xoca amb les molècules d’aigua, que tenen energia tèrmica. Per tant, es produeix un equilibri entre la doble hèlix perfecta i la doble hèlix lleugerament oberta que és susceptible en els extrems a la nucleasa S1.
Psoralen Tenim una altra eina que ens permet determinar si s’han format bombolles o hairpins i és el psolaren que té una estructura plana i és capaç d’intercalar-se en el DNA. Aquesta molècula té un plus i és que si posteriorment la irradies a una longitud d’ona adequada, forma enllaços covalents. Concretament, si irradiem a 360 nm, el psolaren té unes propietats químiques que li permeten establir enllaços covalents amb les T. Si posteriorment irradiem a 354 nm, el psolaren és capaç d’elaborar una altra unió covalent per l’altre costat.
Per tant, es forma una mena d’entrepà on el psolaren ha fet una mena d’entrepà on elabora enllaç un enllaç covalent amb la cadena de Watson i un altre amb la de Crick.
Cal tenir present que el psoralen únicament interaccionarà allà on hi hagi doble cadena ja que en monocadena no es pot intercalar i per tant, no es produeix la reacció. Així doncs, si hi ha una bombolla no es produirà reacció amb psoralen. En canvi, quan trobem un cruciforme podrà reaccionar amb tota la creu excepte allà on sigui monocadena. Les bombolles produeixen un efecte hipercròmic en el DNA (són de cadena senzilla) però, aquest no es pot detectar ja que no són molt grans.
10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Trobem diferents efectes del psoralen segons quina sigui l’estructura de DNA:  Si tenim DNA circulars que tenen tensió superhelicoïdal i formen una bombolla, quan afegim psoralen es dipositarà sobre totes les parts on hi ha doble cadena. Quan augmentem la temperatura o el pH estem fent que les cadenes se separin i és sota aquestes condicions en les quals fem extensió sobre una reixeta de microscòpia.
Si trobem bombolles en el DNA les podrem observar quan fem la foto ja que hem induït la seva separació; els parts de doble cadena com que estaven unides covalentment amb el psoralen no s’hauran separat.
 Si no trobem bombolles en el DNA, apliquem el psoralen i a continuació augmentem temperatura o pH, la doble hèlix no es dissociarà ja que ha estat reforçada pel psoralen. Per tant, veuríem estructures circulars.
 Si tenim estructures cruciformes i després d’aplicar psoralen establim condicions desnaturalitzants, a microscòpia observaríem l’estructura cruciforme ja que és de doble cadena i el psoralen es podria distribuir.
Gràcies a això es va demostrar que existeix l’estructura cruciforme.
Amb el psoralen podem determinar quina és l’estructura que adopta el DNA i això és gràcies a què després d’aplicar el compost fem una fusió. S’ha d’aplicar el psoralen abans de fer la fusió perquè aquestes estructures són làbils i per tant, és molt probable que si no ho fem, quan fem l’extensió a la reixeta per veure al microscopi òptic es tornin estructures helicoïdals. Així doncs, el fer primer un procés de covalència i posteriorment una fusió ens permet determinar l’estructura induïda per la tensió que forma el DNA.
Experiment fet amb hairpins Es va elaborar un experiment en el qual es va fer una construcció química, és a dir, van fer una molècula de DNA alterada químicament. En condicions normals, en un hairpin hi ha possibilitats d’elaborar ponts d’hidrogen i a més, la cadena comença per 5’ i termina per 3’. El DNA que van construir comença per 3’ i arriba al 5’ abans de fer el hairpin i aquí l’ajunten amb un altre extrem 5’; per tant, comencen per 3’ i acaben per 3’. Cal saber que també van elaborar un altre DNA que començava per 5’ i acaba per 5’.
Amb això van voler demostrar que estructures com aquestes eren capaces de continuar formant una doble hèlix normal.
En condicions normals, la doble hèlix s’elabora amb cadenes antiparal·leles i els autors van aconseguir una doble hèlix amb cadenes paral·leles. Aquest fet provoca un canvi en la conformació de les bases i obtenen una nova estructura anomenada estructura de Watson i Crick del tipus revers. En aquesta forma reversa la T gira 180° i ara la unió amb el carboni 1’ de la ribosa es fa a dalt en comptes de fer-se a baix.
11 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Triple hèlix Una altra estructura que es pot elaborar per contrarestar la tensió superhelicoïdal d’un DNA circular és una triple hèlix.
Per cada 10 parelles de bases que passen a la triple hèlix tenim un increment de W d’una unitat positiva.
La condició que s’ha de complir per tal que es produeixi una triple hèlix és que en un determinat tram de las seqüència totes les bases siguin del tipus purina. Això ha de ser així perquè la part de la cadena que no ha de ser exclosa sigui del tipus pirimidina. La polipirimidina és capaç d’elaborar ponts d’hidrogen per “l’esquena” de la doble hèlix de manera que, es forma un pis de doble hèlix; aquests ponts d’hidrogen que s’elaboren s’anomenen de tipus Hoogsteen. A la imatge podem observar com queda exclosa una part de la cadena.
A la imatge veiem que es produeix un canvi d’una base T a una C. L’enllaç Hoogsteen per les C implica que el pH ha de ser àcid que és imprescindible per tal que es formin aquests ponts d’hidrogen, és a dir, és imprescindible per formar la triple hèlix. Cal tenir present que la formació de la triple hèlix és molt artificial perquè ha d’haver-hi un pH àcid.
Estudi de la triple hèlix Si afegim nucleasa S1 a un DNA que forma triple hèlix es tallarà tot i no podrem diferenciar aquesta estructura de les anteriors (bombolla i cruciforme). Per tant, hem de buscar altres tècniques que siguin més efectives.
Una manera efectiva és mitjançant tècniques que empren reaccions químiques; existeixen una gran varietat i a continuació veurem un exemple. Per elaborar aquest experiment es va fer servir el cloroacetat aldehid (CAA) que és un reactiu que té la propietat de reaccionar quan tenim cadenes del tipus monocadena.
Els autors van fer reaccionar el CAA amb un tros de DNA que sospitaven que elaborava una triple hèlix. Van veure que aquest compost reaccionava sobretot en les puntes negres que veiem marcades a la imatge. La regió amb més reacció fa referència a: GGGGGG i això ho van interpretar com que aquesta és la seqüència que permet que es generi la triple hèlix.
Si s’elabora la triple hèlix estem excloent les G de manera que el CAA podrà interaccionar amb aquestes bases perquè estan en monocadena.
Cal tenir present que si es tractés d’una bombolla, aquest compost podria interaccionar amb totes dues cadenes i per tant trobaríem marcatge en totes dues. Si es tractes duna bombolla, aquest compost podria interaccionar amb les dues cadenes ja que totes dues son monocadenes.
12 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 La triple hèlix es forma amb C que permeten que es formin els ponts d’hidrogen tipus Hoogsteen, i a un pH baix. Els autors demostren que si afegim el catió magnesi, que és molt abundant a la cèl·lula, quan fem reaccionar la seqüència amb el CAA, la majoria de llocs de reacció es donen a la seqüència CCCCC; per tant, es forma una triple hèlix on en lloc d’excloure’s G s’exclouen C. Per tant, és possible que DNA on hi hagin polipurines s’aconsegueixin formar hèlix triples.
Transició de DNA B a DNA Z Perquè es produeixi un DNA Z cal que hi hagi seqüències alternants purina – pirimidina i aplicar una gran concentració de clorur de sodi. S’observa que la tensió superhelicoïdal pot provocar que, si s’escau en una regió alternant amb una concentració de sal prou elevada es pot provocar el canvi de DNA B  DNA Z.
El sistema en produir DNA Z per tensió superhelicoïdal, per superhèlix i això provoca la relaxació de la tensió ja que quan es forma DNA Z desapareix un tros de DNA B, que es troba en una altra forma. Sempre hi ha dos passos necessaris: desaparició de doble hèlix cap a la dreta (DNA B) i aparició de la doble hèlix perduda formada cap a l’esquerra (DNA Z). Així doncs aquesta formació té un doble valor; provoca la pèrdua de tensió superhelicoïdal perquè part del DNA deixa de ser tips B i aquest marxa a formar una hèlix cap a l’esquerra.
13 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Suposem un cas en que 12 parelles de bases han passat a DNA Z. Abans per cada 10 parelles de bases que passàvem a la forma de bombolla o cruciforme o triple hèlix era un increment de W unitari però en la formació de la forma Z obtenim la pèrdua de dues voltes de tensió superhelicoïdal (increment de 2 unitats de W). Aquest traspàs de 12 parelles de bases a la forma Z del DNA provoca que, en quant al teorema topològic:  L’increment de T queda definit com un valor negatiu: ∆T = -2,14 per dos motius o Perdem un tros de DNA B. Com que el DNA B presenta 10,5 parelles de bases per volta i es perden 12 parelles de bases això suposa l’eliminació d’aproximadament de 1,14 unitats de T (voltes) degut al fet que aquestes 12 parelles de bases deixen de formar part de volta d’hèlix cap a la dreta.
o Eliminació d’una unitat de T degut a la formació d’una vota d’hèlix en direcció contrària, és a dir, cap a l’esquerra.
 Com que no s’elabora cap tall, increment de L és nul, de manera que és l’increment de W el que ha de suportar el canvi generat en T. Definim ∆W = +2,14 Quan un DNA circular conté inserida una seqüència alterada de G-C de 16 unitats experimentalment es demostra el seu pas a la conformació Z del DNA.
Possible funció: regulació genètica S’ha vist que possiblement accions a distància relacionades amb el DNA Z que també es poden induir per la tensió superficial poden estar relacionades amb la regulació genètica.
Regulació positiva Tenim un activador que fa que la polimerasa pugui funcionar i per tant, el gen està en marxa. Si es produeix per acció a distància la formació de DNA Z en aquesta zona i recordem que perquè es formi aquest cal una alternança de purina – pirimidina (hi ha seqüències naturals que la presenten) la proteïna activadora no es pot unir perquè s’ha variat l’estructura del DNA i per tant, el gen queda inhibit.
Regulació negativa Tenim un repressor, la polimerasa no es pot unir i per tant, el gen no funciona. Si hi ha tensió superficial apareix una estructura de DNA Z i aleshores el repressor es desprèn i el gen s’activa.
14 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Estructures intermoleculars Llaços D (D-loops) Es produeix quan el DNA de doble cadena interacciona amb una altra cadena de DNA. Tenim una doble hèlix a la que se li produeix una obertura (continua la doble hèlix) perquè hi ha una cadena de DNA que fa un complex amb les dues cadenes pròpies i això provoca una llaçada tipus D.
Els concatàmers són vàries cadenes circulars que estan ficades unes dins les altres. Un exemple és un concatàmer dimèric, és el kDNA (DNA dels Kinetoplasts).
R – loops Aquests s’observen de manera transitòria durant la transcripció, on es forma una bombolla i en aquest cas el que forma el complex amb el DNA és el RNA, que es va produint durant la transcripció. La llaçada de DNA s’anomena R1.
Nusos intermoleculars En aquest cas també es poden produir nusos, que al ser intermoleculars uneixen dos cadenes de DNA formant un uns.
Aquests també poden ser intramoleculars.
Unions Holliday Aquestes s’observen quan hi ha intermediaris de recombinació genètica. Aquest entrecreuament és que tenim una cadena i una altra i hem generat un traspàs de DNA, la cadena de DNA doble allibera una de les dos i aquesta continua formant una doble hèlix, pertanyent a una segona cadena, que marxa i envaeix l’altre, de manera que es genera un entrecreuament.
Aquesta estructura es va demostrar per cristal·lografia d’oligos de manera que es coneix a la perfecció perquè es va obtenir un bon diagrama de difracció en que es veu el intercanvi de cadenes.
15 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Hèlix quàdruples Aquesta és la formació de 4 hèlix. Això va ser un tema que es va considerar teòricament però certament al laboratori de Rich (on també es descobreix el DNA Z) van fer cristalls amb la seqüència (GGGGTTTTGGGG) i aleshores es va demostrar cirstal·lograficament que certament es formaven aquestes hèlix quàdruples.
L’estructura d’aquesta hèlix és la que es mostra en l’esquema en que les T s’uneixen amb una petita llaçada, mentre que les G es formen en piràmides.
Les que s’uneixen per mitjà de ponts d’hidrogen són les G, que s’aparellen amb dues més.
Des de fa anys ja se sabia que els cromosomes tenen una seqüència d’aquest tipus i això ha fet especular que potser els terminals d’aquests cromosomes elaboren aquest tipus d’hèlix el que ajudaria a que el DNA quedes connectat (de forma no covalent) entre cromosomes. Aquest és un tema que encara no està determinat i ningú sap si això es produeix a la cèl·lula però el que si se sap és que les hèlix quàdruples es poden produir en el laboratori.
Aquesta hèlix quàdruple és la primera que es va trobar, demostrada amb l’estructura cristal·lina, però un altre grup, treballant amb una altre tècnica que permet conèixer l’estructura tridimensional amb absoluta seguretat (ressonància magnètica nuclear) va elaborar aquesta imatge.
Trobem una hèlix quàdruple; és una estructura molt interdigital on trobem amb un color més clar una cadena i de color més fosc l’altre. Ambdues cadenes podem observar com formen al mig ponts d’hidrogen i formen una doble cadena i si ens fixem en el dibuix només en les línies més fosques, per exemple, elles també formen una doble cadena. La formació de les dobles cadenes es veu a que la doble cadena més fosca està a dins la doble cadena més clara i això es pot anomenar una interdigitació de dues dobles hèlix.
La primera doble hèlix té les dues cadenes paral·leles i en sentit contrari a la segona doble hèlix (que també les té paral·leles). En aquest cas només hi ha citosines com a bases nitrogenades. Si una cadena s’intercala entre una altra és com si entressin agents intercalants, provocant un desenroscament de la doble hèlix uns 20 graus a cada passa, de manera que a cada passa té una T que passa de 36 a aproximadament 16.
16 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Triple hèlix Aquestes triples hèlix no són com les que hem vist sinó que són triples hèlix que involucren a més d’una molècula de DNA (poden ser 2 molècules o bé 3 cadenes). En la imatge tenim una triple hèlix normal en la qual s’ha afegit una cadena simple (amb una banda més fosca). Aquesta cadena fosca perquè passi ha de ser una polipiridimida, tenim bases petites que són les que formen els ponts d’hidrogen tipus Hoogsteen i a més a més, ha d’existir una càrrega positiva perquè es produeixi (en general és el mateix principi que en les explicades anteriorment però intermolecular).
Els autors d’aquest treball científic aprofiten l’experiment no per demostrar que es formen triples hèlix sinó que a més, fan servir aquesta oportunitat per demostrar que són capaços de generar una nucleasa artificial (nucleases químiques o de disseny).
Així doncs aquesta tercera cadena que introdueixen (marcada més fosca) en l’extrem té unida una T marcada amb un asterisc perquè té unida artificialment una molècula de EDTA de forma covalent i per la síntesi química. Aleshores, en presència de ferro aquest s’uneix al EDTA (quelant de cations). En 16 hores de reacció a 0 graus aquesta estructura és capaç de tallar del DNA de manera que es produeix un tall de la doble cadena provocat per aquesta nucleasa; és el ferro unit al EDTA el que talla el DNA, la seva presència.
El DNA natural conté seqüències polipurina i polipirimidia de manera que això potencialment és el lloc de formació de triple hèlix intermolecular. S’ha trobat que el cloroacetaldehid, un reactiu que interacciona amb monocadenes generades de triple hèlix, reacciona in vivo de manera que podria ser que el DNA natural generés aquest tipus d’estructura.
Possible funció: regulació genètica Aquesta triple hèlix, hipotèticament pot estar relacionada amb la regulació genètica.
Regulació positiva o negativa Suposem que una polimerasa funciona perquè la proteïna blanca és un activador i per tant, el gen està funcionant. Si en aquesta regió o la següent hi ha la possibilitat perquè es satisfan les condicions de polipurina i polipirimidina i l’estructura del DNA té superhelicoïlicitat es pot disparar un mecanisme per relaxar aquesta tensió superhelicoïdal que faci aparèixer allà on pot una triple hèlix. Així doncs, en el loop corresponent apareixerà una triple hèlix que pot provocar el salt de la polimerasa i l’activador de manera que el gen no funcionarà. Aquest cas actuaria com una inhibició d’aquesta expressió; la inhibició es donaria per l’aparició d’una triple hèlix en una zona on hi ha tensió superhelicoïdal i per tant, és una pressió a distància.
17 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Regulació per “single strand binding proteins” Es pot tractar també d’un gen que no funciona perquè el repressió no permet que la unió es produeixi. Per una acció a distància apareix una triple hèlix i un loop de manera que la polimerasa no es veu reprimida per aquest repressió i el gen es pot expressar.
Hem de tenir present que els mecanismes de la triple hèlix són totalment hipotètics però aquestes, experimentalment existeixen.
ESTRUCTURES ARTIFICIALS: PNA El PNA és una estructura generada pels químics que mimetita (imita) el DNA de manera que té una base (ribosa) i un fosfat. Si polimitzem la molècula tot i que aquesta no sigui DNA té propietats semblants a aquest; el PNA té una estructura amb una base i amb una sèrie de carbonis, que en comptes de realitzar una estructura tancada com en el cas del DNA en aquest cas generen una estructura oberta, que no és un anell. Aquesta estructura repetida (n) vegades, és a dir, quan formem un polímer de PNA obtenim propietats similars a les del DNA.
El PNA és anomenat així pels seus enllaços peptídics de manera que es pot entendre també com una repetició de pèptid – nucleòtid – àcid, tantes vegades com sigui necessari. Aquestes cadenes tenen la propietat d’unir-se amb el DNA normal i formar híbrids PNA-DNA, que també presenten la propietat de formar Loops D i triple hèlix. Si ens fixem en la següent imatge observem com el PNA s’ha introduït en una doble cadena, el que genera una triple hèlix, o bé que el PNA envaeixi la doble hèlix per formar una llaçada amb un D-loop.
Observem una gràfica on es compara el comportament enfront de la temperatura de fusió en funció de la concentració salina. En negre veiem representant un DNA – DNA, és a dir, una doble hèlix de DNA que si no hi ha concentració salina la temperatura de fusió és baixa, però a mesura que augmentem la concentració salina també augmenta la temperatura de fusió, fins un punt en que aquesta s’estabilitza. En blanc trobem representat un híbrid PNA – DNA, ens fixem que la temperatura de fusió és alta independentment de la concentració salina i això és d’aquesta manera perquè aquest híbrid no té el fosfat, de manera que el PNA no té càrrega i no elabora repulsions amb ‘altre cadena, el que li proporciona estabilitat enfront la fusió.
18 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 En aquest gràfic en canvi es considera un híbrid de DNA i en l’altre cadena o bé un DNA monocadena o bé un PNA i el que es tracta és de veure què passa quan la primera base d’aquest DNA no és complementària a la primera base o bé d’una altra molècula de DNA o bé al PNA. Observem en la primera fila en que el valor de X pot equivaldre a qualsevol base, però les molècules només seran complementàries quan x = C (citosina) i per tant, es consideren sempre totes les possibilitats, de les quals 3 no seran complementàries i 1 sempre ho serà.
Per cada cas representem la temperatura de fusió; la barra negra representa el cas del PNA mentre que la barra a ratlles es refereix a un híbrid de DNA – DNA. Si observem la gràfica veiem que les barres de PNA sempre són més altes, el que ens torna a indicar l’estabilitat del híbrid PNA – DNA enfront l’híbrid DNA – DNA quan l’aparellament no és correcte.
Interès del PNA: teràpia gènica Imaginem un exemple en que es vol buscar inhibir l’expressió gènica produïda per una proteïna, de manera que el que volem és que no s’expressi aquesta proteïna, inhibir la seva producció. Hi ha diferents estratègies però en generals els mètodes de teràpia gènica han de satisfer una sèrie de característiques:  El mètode ha de permetre l’entrada a la cèl·lula, és a dir, el PNA ha d’entrar en la cèl·lula (en general pot fer-ho)  Estabilitat de la molècula i estabilitat d’aquesta en la cèl·lula (sabem que el PNA en la cèl·lula no és reconegut com un material aliè i per tant, no és atacat)  Especificitat de seqüència perquè el fàrmac funcioni (el PNA, independentment de com actuï el podem dissenyar a nivell de seqüència)  Alta afinitat i estabilitat (el PNA és molt semblant al DNA de manera que presenta característiques similars i a més, és estable en l’interior cel·lular) Basant la teràpia gènica en el PNA (ja que satisfà totes les característiques anteriors) cal diferenciar entre dos estratègies diferents.
19 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 La primera estratègia és la formació de triple hèlix; suposem un medicament que provoca la triple hèlix amb el DNA que conté la proteïna que nosaltres volem inhibir. Sabem que la formació de triple hèlix d’aquest DNA provocarà que no es pugui transcriure de manera que, no es formarà el missatger i tampoc no es formarà proteïna. Com que el PNA no té càrrega (no té fosfat) és més estable que el DNA de manera que utilitzarem PNA per establir una unió més forta de la triple hèlix i per tant, tenim més capacitat d’inhibició.
Una altre manera és una estratègia antisense, que consisteix en tenir una seqüència que sigui complementaria al missatger del transcrit, que hauria de ser l’encarregat de produir proteïna. En aquest cas però, la producció de proteïna no es donarà perquè si tenim la cadena complementària respecte el missatger podem elaborar una doble cadena, el que inhibirà la traducció. Un altre cop, com que el medicament estarà format per PNA aquest és més estable i per tant, més efectiu.
Hem de tenir present que també existeix un model de XNA, amb altres aplicacions.
APLICACIONS DEL DNA A LA NANOTECNOLOGIA L’aplicació del DNA en la nanotecnologia té un pes molt important en la investigació actual. Anys enrere, a principis del descobriment de la nanotecnologia aquesta era denominada química supramolecular ja que intentava estudiar les interaccions no covalents interatòmiques. En general els químics sempre s’havien interessat per les interaccions covalents però es van adonar que les molècules unides per interaccions no covalents formaven estructures molt grans i estables (això ja era conegut pels bioquímics).
El món de la biologia i la natura ha actuat durant els darrers anys d’investigació i descobriment com inspiració, el que es coneix com bioinspiració, és a dir, la natura serveix per inspirar als químics a generar nous productes i tot ho aprenen de l’observació de productes que proporciona la natura. Així doncs, la química supramolecular s’inspira en la química i s’interessa per allò que va més enllà de les molècules, s’inspira en els enllaços no covalents entre diferents molècules que permet la formació de grans estructures estables. Química supramolecular però, és un nom primogènic, actualment aquesta ciència es coneix com la nanotecnologia; que permet, imitant a la natura,a entrar en una nova etapa de producció en que s’utilitzaran tècniques de producció basades en l’autoassociació, és a dir, la producció de materials a escalar molecular, atòmica, tal com les cèl·lules ho elaboren i tal com ni els químics ni la indústria química ho saben fer.
Ens podem referir a aquesta ciència també com bionanotecnologia, si el seu camp és més aplicat a la biologia.
El DNA nanotecnològic (article novel DNA construction, de Nadrina C-seeman) pretén fer construccions supramoleculars i s’ha pensat en el DNA perquè es pot entendre aquest com una meravella de la natura. El DNA té una gran capacitat de complementació de manera que, si es respecten les seves propietats es pot arribar a construir estructures cruciformes, on es poden dissenyar fins i tot la unió de 4 cruciformes per generar estructures tridimensionals. Per mitjà de disseny també es poden generar trames tridimensionals a voluntat.
20 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Aquest aspecte serveix perquè es pretén, utilitzant els conductes tridimensionals coma mínim, generar circuits nanoelectrònics perquè si aconseguim que les estructures tinguin característiques electròniques hem de tenir present que el DNA ens permet la seva localització on vulguem, el que obra molt el món de la construcció i la medicina.
Un exemple d’aplicació és el mètode basat en el DNA per la formació racional de nanopartícules en materials macroscòpics: si observem la figura veiem que són boletes d’or que es poden produir fàcilment i aquestes s’uneixen en els tiols (-SH). Aleshores, segons el disseny dels autors, es generen oligos amb un grup tiol en l’extrem 3’ de manera que, en barrejar una col·lecció d’aquests oligos amb les boletes d’or s’uniran entre ells, el que generarà una seqüència d’oligos en que la cua està lliure en dissolució però el cap està unit en les boletes.
El segon pas és afegir un altre oligo més sofisticat ja que és la cadena de Watson i la cadena de Crick en que la zona central és complementària i per tant, queda com una monocadena. Elaborem les condicions d’hibridació el que provocarà que l’oligo elabori un pont d’hidrogen i unirà les boletes. Així doncs, al final tindrem una constructe que contindrà boletes d’or posades a l’espai d’una manera determinada i a una distància determinada entre elles. Els autors diuen que aquesta estratègia podria fer possible sistemes òptics, estructures dissenyades amb propietats específiques.
DINÀMICA ESTRUCTURAL DEL DNA Estudiarem la dinàmica estructural del DNA per mitjà de 2 treballs (2 exemples diferents), ens referim a dinàmica estructural del DNA allò que afecta o està directament relacionat amb l’estructura secundària del DNA.
Exemple 1: Dinàmica estructural d’un DNA circular Aquest és un estudi de dinàmica molecular i correspon a uns autors que es van plantejar què passaria des del punt de vista cinètic si tinguéssim un DNA de linking number alterat, és a dir, si tinguéssim un DNA amb tensió. En l’exemple que estudiarem els autors parlen d’un DNA amb la següent tensió: ∆L = +4. Sabem que si tenim un DNA amb un dèficit o un excés de linking number per tenir-lo pla (en t=0) hauríem de fer un esforç. Si elaborem un experiment computacional de dinàmica per veure com evolucionarà l’estructura sabem que el temps sempre s’expressa com 50 femtosegons (10 -15 segons) i per tant, sempre cal multiplicar el número per 50.
Així doncs l’experiment consisteix en situar a temps t=0 aquest DNA en pla i mirar al llarg del temps la seva tendència a formar superhèlix, fins que al final aconsegueix formar 4 voltes superhelicoïdals (es segueix en el temps un esquema de formació de diferents voltes superhelicoïdals). Hem de tenir present que el DNA no actua com una molècula estàtica en aquesta última posició sinó que per l’agitació tèrmica dels àtoms al llarg del temps va oscil·lant, es recargola una mica més i menys i per tant, tenim una forma fluctuant de manera que es tracta d’un procés dinàmic (permet justificar molts aspectes del DNA). Aquest estudi és vàlid tant per un DNA circular com un DNA lineal.
21 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T4 Exemple 2: cinètica de la circularització del DNA Aquest experiment consisteix en agafar fragments de DNA que tenien des de 230 pb a 260 pb, de manera que tenim una col·lecció de fragments de DNA amb diferent longitud. El que es va plantejar és que si tenim una col·lecció de fragments de DNA, tenint en compte que els extrems d’aquesta molècula (DNA) són extrems cohesius i que cadascuna de les molècules té un aparellament central de doble cadena però en els extrems té monocadena de manera que actuen com extrems cohesius (on els dos extrems són complementaris).Si els fragments presenten extrems cohesius en principi podem elaborar un cercle quan interaccionin entre ells per formar una estructura circular, que es pot tancar totalment si fem servir una ligasa. L’autor el que es planteja és si la velocitat de formació d’aquest DNA circular està relacionada amb la longitud inicial d’aquests. Recordem que en la col·lecció de fragment les seves longituds no són gaire diferents.
Aquesta facilitat química per la qual es planteja l’autor es mesura en termes de cinètica química, com més ràpid és un procés més fàcil és que es produeix de manera que el que elaboren són cinètiques de circularització. Amb els resultats s’elabora una gràfic en que en l’eix d’ordenades (y) es representa la velocitat de circularització mentre que en l’eix d’abscisses (x) es representa els aparellaments de bases. El que s’esperaria inicialment d’aquest gràfic seria una caiguda lleugera amb soroll però no esperaríem una gràfica sinusoïdal.
Si observem el gràfic veiem que la distància entre els dos pics és de 10 parelles de bases, de manera que, un cop més la periodicitat de 10 en el DNA queda reflectida i recollida en aquesta prova. La relació entra la dependència relacionada amb la doble hèlix és veritat però tampoc no és tant trivial a com afecta al circularització i en el dibuix el popi autor ens ajuda a veure com en aquest cas, la periodicitat de 10 pb afecta a la cinètica.
El següent dibuix ens mostra dues situacions extremes: en la imatge superior viem com el DNA ha elaborat la volta completa però encara està encarant els extrems cohesius de manera que la ligasa encara no ha estat afegida. En l’altre imatge en canvi, els extrems estan en fase i tot i que no hi hagi ligasa, com que el DNA té una longitud adequada perquè s’elabori una volta els extrems s’encaixen perfectament.
Quan tenim una col·lecció de diferents fragments hem de tenir present que hi ha trossos que són capaços d’elaborar tot el cercle i encarar els extrems cohesius però hi ha d’altes (com per exemple 245 pb) que poden elaborar el cercle però no encaren bé els extrems perquè hem de tenir present que s’ha de respectar l’estructura de W&C i per tant, els extrems no arriben a tocar-se i no s’encaren correctament. Entremig, quan de les situacions, quan estiguin a una distància que no sigui múltiple de 10 els extrems estaran malament encarats (situació a) mentre que si tenim un múltiple de 10 ens trobem en un mínim de la gràfica i per tant, els extrems estan ben encarats (situació b). Així doncs, veiem, en representar les dades un reflex de l’estructura interna del DNA. Hem de tenir present que el DNA que no estigui en fase també elaborarà el cercle covalentment tancat però amb na probabilitat menor i per tant, amb una velocitat menor. Cal saber que tot i que els extrems estiguin mal encarats com que hi ha agitació tèrmica el DNA també es mourà i per tant, es pot encarar correctament, elaborant la unió no covalent, que desprès, amb la introducció de la ligasa es tornarà una unió covalent.
Com més llarg és el DNA menys energia necessites per corbar-lo i és per aquest motiu que el pic cada vegada que augmenten (pb) és més alt.
22 ...