Pràctiques de genètica (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura Genética
Año del apunte 2016
Páginas 9
Fecha de subida 12/03/2016
Descargas 15
Subido por

Vista previa del texto

PRÀCTIQUES DE GENÈTICA 1. INTRODUCCIÓ En aquestes pràctiques s’utilitza com a material biològic a l’espècie Drosophila melanogaster, també coneguda com a mosca de la fruita o el vinagre. Aquesta espècie es va introduir en l’experimentació l’any 1909 per Castle i Morgan i ha permès descobrir nombroses lleis genètiques.
D.melanogaster és un insecte (dípter) holometàbol que durant el seu cicle biològic passa per la fase de larva, pupa, imago i insecte adult. La durada del cicle depèn de la temperatura (9 dies a 25ºC on la fase d’ou dura 22h, la de larva i pupa 4 dies).
1.1 Diferències entre mascles i femelles A la fase adulta, les diferències entre mascles i femelles són diverses i clares: Característiques Femella Mascle Mida Gran Petita Forma del cos Final de l’abdomen punxegut Final de l’abdomen arrodonit (rom) Extrem de l’abdomen (part distal) A la cara dorsal es veuen els A la cara dorsal presenta una taca diferents segments. A la part ventral fosca sobre els últims segments no té res. Trobem la placa vaginal i abdominals, a la part ventral es pot la placa anal veure un punt de color negre.
Trobem l’arc genital de color terrós Potes Llargues Més curtes que les femelles i tenen pintes sexuals 1.2 Manipulació de les mosques Per realitzar encreuaments experimentals o bé, observar i classificar els individus, cal anestesiarlos. Per fer-ho, s’utilitza la cambra d’anestèsia que consisteix en un flascó tapar amb un cotó impregnat amb èter etílic (substància anestèsica). És important no sotmetre les mosques a una exposició molt llarga a l’èter (més de 30 segons) ja que llavors moren (ales i potes en posició perpendicular).
Les mosques queden anestesiades durant uns 5-10 minuts, si es comencen a moure cal reeteritzar. Si s’eteritzen moltes vegades poden presentar problemes d’esterilitat.
Els individus que després de la classificació ja no són necessaris són sacrificats en un flascó amb alcohol 70º.
1.3 Obtenció de femelles verges Una femella pot emmagatzemar i utilitzar l’esperma d’una inseminació per a la major part de la seva reproducció, per tant, per a realitzar els encreuaments cal disposar de femelles verges a la generació parental (P). Per a obtenir-les, es retiren totes les mosques del flascó on estan eclosionen les pupes, d’aquesta manera dins el flascó només hi ha individus verges (els que estan naixent).
2. ANÀLISI D’UN MUTANT I DETERMINACIÓ DEL SEU GRUP DE LLIGAMENT L’objectiu és analitzar la naturalesa d’una mutació problema (dominància o recessivitat) i el tipus d’herència (autosòmica o lligada al sexe).
Dominància i recessivitat: en un locus amb 2 al·lels, l’al·lel que codifica per la característica que s’expressa a totes les generacions és el dominant. L’al·lel que no s’expressa en combinació amb el dominant, és el recessiu.
Autosòmic o lligat al sexe: és autosòmic quan el loci que el controla es troba a un cromosoma somàtic (no sexual) i és lligat al sexe quan es localitza al cromosoma sexual (X, en aquest cas).
2.1 Observació de mosques salvatges i mutants Soca Salvatge (+) Soca d’ulls Soca d’ulls taronges blancs Taronges Blancs + + + + + + + + + + + + + + + + vestigial sepia Soca Ebonny Soca àpterus + + Vermells no Color dels ulls brillants amb una taca Negres negre al centre Planes, Forma de les ovalades i ales més llargues Vestigials Àpter (sense ales) que el cos Forma de les Llargues, quetes (pels) rectes i llises Forma de les Curtes i antenes ramificades Color del cos Marró clar, groguenc Tot el cos negre + 2.2 Tipus de creuament El creuament pot ser dominant o recessiu, i autosòmic o lligat al sexe. A les nostres pràctiques farem servir el creuament de femella salvatge amb mascle mutant. Tot i que el creuament de femella mutant i mascle salvatge és millor. Nosaltres fes servir aquest perquè donem per suposat que les dues herències són recessives i perquè amb el creuament bo no aconseguiríem saber si es tracta d’una herència autosòmica o recessiva amb només dues setmanes de creuaments.
3. GENÈTICA MOLECULAR Cal una tècnica d’anàlisi i una mostra de referència. En general s’utilitzen tècniques d’anàlisi basades en l’amplificació del DNA perquè són ràpides, repetibles, fàcils d’interpretar i no requereixen coneixements específics per cada tipus diferent de mostra. Tot i això, aquests protocols no funcionen en mostres molt processades a causa de la degradació que pateix la molècula de DNA.
Es pot extreure DNA de gairebé qualsevol tipus de mostra biològica, l’únic requeriment és que hi hagi cèl·lules nucleades.
Una de les tècniques d’anàlisi basades en l’amplificació del DNA és el PCR (descrita al 1987 per K.Mullis). El PCR permet fer in vitro moltes còpies (amplificar) d’un fragment concret del genoma (una mida màxima de 2 o 3 kilobases, Kb). Té dues grans qualitats: 1. Especificitat: només amplifica una secció molt concreta del genoma 2. Robustesa: amplifica a partir de mostres poc purificades 3.1 Quan farem servir PCR? - En l’amplificació del DNA a partir d’una mostra de saliva - En la identificació de l’espècie d’origen a partir de productes làctics - En la caracterització molecular el mutant d’ulls taronges de D.melanogaster 3.2 Procediment - Extracció de DNA: cal obtenir una adequada quantitat i qualitat de DNA a partir del material biològic. Hi ha dues etapes per aïllar i purificar el DNA: 1. Homogeneïtzació: trencament de les estructures cel·lulars que protegeixen el DNA perquè pugui ser accessible als reactius i es fa a través de mètodes físics, químics, enzimàtics o una combinació. La intensitat de la homogeneïtzació dependrà de la dificultat de trencament de les estructures biològiques 2. Separació i purificació: separar el DNA de les estructures a les que s’associa de manera natural (per exemple: les proteïnes amb dissolvents orgànics) - PCR: es fan servir dos encebadors oligonucleotídics o primers (20 parells de bases) de seqüència coneguda. Els primers actuen com a encebadors perquè la DNA polimerasa III sigui activa i pugui amplificar el fragment de DNA. Com cada còpia pot servir de motlle per a una nova amplificació, el nombre de còpies creix exponencialment. El PCR té 3 etapes: 1. Desnaturalització (90-95ºC): separació de la doble cadena de DNA, formant dues senzilles 2. Unió dels encebadors (50-60ºC): els encebadors s’uneixen al DNA motlle de la cadena senzilla. La temperatura de melting depèn del contingut de C-G i de la llargada del DNA. Es pot escollir una temperatura entre 50 i 60ºC, però com més baixa és aquesta menys especificitat a l’hora de fer el PCR 3. Elongació de la cadena de nova síntesi (70-74ºC): la polimerasa afegeix nucleòtids 2n  x  nº  de  copies  inicials   n  à  cicles   En el nostre PCR fem un total de 36 cicles. El nombre de cicles depén de la llargada del DNA, la polimerasa III perd especificitat (fals positiu).
PRÀCTICA I: La identificació de l’espècie d’origen de productes làctics Es va fer un PCR espècie-específiques. En aquest tipus de PCR es fan servir tres tipus de PCR, un per cada espècie: vaca, cabra i ovella, per tal d’identificar a quin tipus de formatge pertanyen les nostres mostres.
Com les mostres pertanyen a vaca, ovella o cabra aquest PCR ens ha estat molt útil. En el cas de que una de les mostres no pertanyés ni a vaca, ni a ovella ni a cabra aquest PCR no funcionaria. Aquest PCR només amplifica per vaca, ovella i cabra, si una de les nostres mostres no fos de cap d’aquestes tres espècies no amplificaria. Per tal de que amplifiques hauríem de fer un altre PCR amb els primers d’una altre espècie per veure si per aquesta amplifica.
En termes de quantitat, aquesta tècnica no és molt bona ja que els formatges estan processats i en ells hi ha molt poca quantitat de DNA i la qualitat d’aquest DNA és molt dolenta, per això la extracció de DNA d’aquesta pràctica és tan laboriosa (la millor PCR en termes de quantitat és la que s’ha realitzat a la pràctica de l’extracció de DNA de la saliva, mentre que la millor en termes de qualitat és la de les mosques.) Durant el protocol d’extracció de DNA s’utilitzen els següents reactius: - Tampó TT: conté detergent SDS que trenca les membranes - Proteïnasa K: és un enzim que trenca proteïnes. Hi ha 2 tipus de proteïnes, estructurals i enzims/funcionals. Volem trencar els dos tipus. Pel que fa als enzims, ens interessa trencat l’DNAases - NaCl: sal que s’uneix a les proteïnes i fa que aquestes precipitin - Etanol absolut: deshidrata, crea un ambient hidrofòbic llavors provoca que el DNA precipiti ja que aquest és hidrofílic - Etanol 70%: rehidrata la molècula de DNA i renta les sals - Tampó TE: conté sals especifiques que mantenen el DNA Després de l’extracció, es realitzen tres PCRs: - Per productes d’origen oví (OA = nom científic Ovis Aries). Primers/encebadors: OA12S959/OA12S1130 - Per productes d’origen cabrum (CH). Primers/encebadors: CH12S144/CH12S469 - Per productes d’origen boví (BT): primers/encebadors BT12S916/BT12S1171 El “12S” indica que s’amplifica el gen 12S ribosomal Per fer els PCRs és fa un “mix” de diferents reactius: Volum (30µl) N=12 mostres, hi ha 9 grups a la clase + 1 control positiu + 1 control negatiu + error de pipeteig Tampó 3 µl 36 µl MgCl2 0.9 µl 10,8 µl Primer 1 (de cabra, ovella o vaca) 0.6 µl 7,2 µl Primer 2 (de cabra, ovella o vaca) 0.6 µl 7,2 µl dNTP 3 µl 36 µl Taq polimerasa 0.15 µl 1,8 µl Aigua 20.75 µl 249 µl Mostra 1 µl 1 µl En primer lloc cal posar l’aigua i per últim la Taq.polimerasa. S’obtindrà un volum final de 348 µl, es repartiran 29 d’aquests µl a cada grup (12 grups).
- Tampó: obtenir condicions òptimes en el PCR perquè treballi la Taq.polimerasa - Primers: determinen el fragment amb el qual es vol treballar - MgCl2: és un cofactor de la Taq. Polimerasa - dNTP: nucleòtids - H2O: per fer les diferents dilucions Cada grup tindrà tres pots: amb PCR de vaca, amb PCR de cabra i amb PCR d’ovella. Dins els pots hi posaran la seva mostra de formatge per tal de determinar quin tipus de formatge és.
A més a més per a tot el grup classe, es farà: - Un control negatiu - Un control positiu: és un teixit d’adult conegut (de cabra, vaca o ovella) que és una mostra que se sap segur que ha d’amplificar. D’aquesta manera s’eliminen falsos positius - Una mostra d’error de pipeteig A continuació es fa una electroforesi en gel d’agarosa: aquesta tècnica s’utilitza per a la comprovació de la qualitat del DNA. L’agarosa és un polisacàrid compost per agar, és insoluble en medis aquosos a temperatura ambient. Només es dissol a 100ºC i quan es refreda forma un conjunt de fibres, les molècules de DNA es desplacen pels seus porus quan se’ls hi aplica un camp elèctric. El DNA té càrrega negativa i es desplaça per l’agarosa en funció de la seva mida.
Per veure el DNA s’utilitza bromur d’etidi (molt mutagen à guants), agent intercalant que es col·loca entre les dues cadenes de DNA i emet fluorescència quan s’il·lumina amb llum utraviolada.
Resultats: El formatge 1 és una barreja de cabra, vaca i ovella. El formatge 2 és d’ovella, el formatge 3 és de vaca i el formatge 4 és de cabra.
Els resultats són els esperats encara que el formatge 2 també amplifica una mica per cabra i vaca, això és degut a que hem fet sevir una temperatura de nealing baixa (50ºC) i hauríem d’haver fet servir una temperatura de nealing més elevada (més propera a 60ºC) per tal de que el PCR fos més específica PRÀCTICA II: SOCA D’ULLS BLANCS Procediment: 1. Agafem 6 mascles i 6 femelles salvatges 2. Posem 3 mascles i 3 femelles dins d’un tub (omplim dos tubs) 3. Deixem que es reprodueixin, encreuament 4. Observem descendència Descendència esperada: El caràcter d’ulls blancs presenta una herència de tipus autosòmica recessiva. La generació parental (P) consisteix en femelles salvatges amb genotip AA i mascles mutants amb genotip aa.
En la generació F1 tots els individus presenten fenotip Aa i són salvatges, per tant podem afirmar que el caràcter d’ulls blancs és recessiu. En la generació F2 apareixen femelles mutants això ens indica que es tracta d’una herència autosòmica recessiva. Però no només apareixen femelles mutants sinó que a més apareixen dos caràcters més: mosques amb ulls taronges i mosques amb ulls marrons. En total tenim: mosques amb ulls blancs, mosques salvatges, mosques amb ulls marrons i mosques amb ulls taronges. Això és degut a que estem davant d’un cas de dihibridisme clàssic on un caràcter és controlat per més de dos loci.
Hi ha dues rutes enzimàtiques, la d’homocroms i la de pterines. La ruta enzimàtica d’homocroms crea la pigmentació marró i hi actuen els gens cn i st, mentre que la de pterines crea la pigmentació vermell brillant i hi actua el gen bw. El bloqueig d’alguna de les rutes per una mutació provoca la expressió de l’altra ruta.
En els nostres experiments hem fet servir dues soques diferents de mosques, la Brown Scarlett (gens bw i st) i la Cinnaber Brown (gens cn i bw). Els gens bw i cn es troben en el mateix cromosoma 2, per tant, estan lligats. En el cas de que un d’ells muti, l’altre també mutarà, per tant pot ser que s’inhibeixin les dues rutes (ulls blancs) o que no s’inhibeixi cap de les dues. Per altra banda, el gen st es troba al cromosoma 3, si st i bw estan en cromosomes diferents és més fàcil que aparegui la proporció 9:3:3:1.
Un grup de la classe tindrà la soca Brown Scarlett mentre que l’altre grup tindrà la soca Cinnabr Brown. Per veure si entre elles segueixen la mateixa proporció es farà un Xi2 (explicada més endavant).
A més a més, intervé el locus white. Si aquest està mutat es pot generar un bloqueig parcial i que els ulls siguin vermell brillant, o bé, que el bloqueig sigui total i els ulls siguin blancs.
Xi2 i taula de contingència Observades Salvatge Taronge Marró Blanc A 133 17 26 26 202 B 82 46 20 6 164 215 63 56 32 Esprades Salvatge Taronge Marró Blanc A 118,66 34,77 30,9 17,66 202 B 96,33 28,22 25,07 14,33 164 215 63 56 32 Xi2 observada = 34,62 Xi2 observada > Xi2 esperada à significatiu Xi2 esperada = 7,82 Ho: segueixen la mateixa proporció Graus de llibertat: (n-1)·(m-1) = 3 Ha: no segueixen la mateixa proporció Alfa = 0,05 Rebutgem Ho PRÀCTICA III: SOCA D’ULLS TARONGES El caràcter d’ulls taronges presenta una herència lligada al sexe recessiva. La generació parental consisteix en femelles salvatges amb genotip + m m + i mascles mutants amb genotip m>. Per tant, en la generació F1 les femelles + presenten un genotip m m i els mascles m+>, ambdós són heterozigots salvatges. Per últim, la generació F2 presenta individus mascles mutants amb genotip m>, mascles salvatges amb genotip m+> i femelles salvatges amb + + genotip m m . com en la F2 només tenim femelles salvatges podem afirmar que es tracta d’una herència lligada al sexe recessiva ja que sinó també tindríem femelles mutants a la F2.
Procediment: 1. Agafem 6 mascles i 6 femelles salvatges 2. Posem 3 mascles i 3 femelles dins d’un tub (omplim dos tubs) 3. Deixem que es reprodueixin, encreuament 4. Observar descendència Xi2 Per tal de veure si segueixen la proporció 1 mutant : 3 salvatges (1/4) Xi2 observada = 17,34 Xi2 observada < Xi2 esperada à no significatiu Xi2 esperada = 3,84 Ho: segueixen la proporció 1:3 Graus de llibertat = 1 Ha: no segueixen la proporció 1:3 Alfa = 0,05 Acceptem Ho PRÀCTICA IV: Amplificació del DNA a partir d’una mostra de saliva Durant aquest protocol s’utilitzen els següents reactius: - Tampó TT: conté detergent SDS que trenca les membranes - NaCl: sal que s’uneix a les proteïnes i fa que aquestes precipitin - Etanol absolut: deshidrata, crea un ambient hidrofòbic llavors provoca que el DNA precipiti ja que aquest és hidrofílic - Tampó TE: conté sals específiques que mantenen el DNA En aquesta pràctica s’han realitzat dos PCRs, un per humà i l’altre per bacterià. Els primers del PCR humà amplifiquen per una regió de control mitocondrial mentre que els primers del PCR bacterià amplifiquen pel gen 16S ribosomal bacterià, és a dir, no per un tipus de bacteri específic.
En els resultats hem obtingut que en el PCR humà amplifiquen bandes que no coincideixen amb l’amplificació del DNA humà, això ens indica que hi ha més DNA bacterià que humà. Per altra banda, en l’amplificació del bacterià, aquells amb una banda prima vol dir que presenten un tipus de bacteri, mentre que aquells que mostren una banda més gruixuda vol dir que tenen més tipus de bacteri.
...