Tema 6. Enzims (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Bioquímica I
Año del apunte 2014
Páginas 12
Fecha de subida 02/02/2015
Descargas 11
Subido por

Vista previa del texto

Tema 6. Enzims ELS ENZIMS COM A CATALITZADORS Els catalitzadors són substàncies que disminueixen l’energia d’activació d’una reacció i n’augmenten la velocitat. Els enzims són un tipus de catalitzadors que presenten l’avantatge de poder actuar en condicions menys extremes. Són específics i més susceptibles a regulació.
Els enzims, i els catalitzadors en general, no determinaran mai el sentit d’una reacció sinó que aquest estarà determinat termodinàmicament per la ΔG0 i la relació entre les concentracions de producte i reactiu. Un enzim accelerarà la reacció sigui quin sigui el seu sentit. En la reacció els enzims no es consumiran ni es veuran alterats.
Velocitat de reacció i constant de velocitat Quan la reacció estigui en equilibri la velocitat serà 0: k1[A] = k-1[B].
La relació entre els productes i els reactius és la constant d’equilibri, per tant també ho serà la relació entre les constants de velocitat.
Energia d’activació Els reactius, per convertir-se en productes, han de superar mitjançant col·lusions una certa energia d’activació a causa de que existeix un estat intermedi amb una energia de Gibbs elevada. L’energia d’aquest estat indicarà com de fàcil serà que es doni la reacció. Una energia d’activació alta implica una major dificultat per assolir-la i per tant una menor velocitat.
Si A+ i A es troben a l’equilibri: ΔG = 0  -ΔG1o = RT ln [A+]/[A] L’augment de la concentració del reactiu, l’augment de la temperatura o la disminució de l’energia d’activació acceleraran la reacció. Els catalitzadors actuen disminuint l’energia d’activació mitjançant l’estabilització selectiva l’estat de transició.
Relació entre la velocitat de la reacció amb catalitzador (V 1C) i sense (V1) La creació d’un nou enllaç d’hidrogen estabilitza l’estat de transició selectivament disminuint l’energia d’activació en 10KJ/mol: És possible determinar com més ràpid es vol que sigui la recció.
Centre actiu Els enzims presenten un centre actiu on s’uneix el substrat de manera específica i s’estabilitza l’estat de transició.
Dos models diferent expliquen com es produeix aquesta unió. Segons el model del pany i la clau la unió entre el substrat i l’enzim és molt precisa, ja que el centre actiu té una conformació determinada a la que només es pot unir un substrat determinat. Si bé aquest model es molt útil per explicar l’especificitat enzimàtica, no és sempre correcte i no explica l’estabilització de l’estat de transició.
El model d’acoblament induït es basa en la flexibilitat dels enzims. A mesura que el substrat interactua amb l’enzim, el centre actiu anirà canviant de forma i estabilitzarà l’estat de transició.
Un anticòs que uneixi preferentment l’estat de transició d’una reacció funcionarà com un enzim (abzim) catalitzant aquesta reacció Creació de compostos quirals Els enzims són capaços de crear compostos quirals (òpticament actius) a partir de compostos no quirals (òpticament inactius). La síntesi d’un enantiòmer a partir d’un compost inactiu serà indicatiu de la participació d’un enzim.
Coenzims En la catàlisi enzimàtica poden participar coenzims, molècules orgàniques presents al centre actiu. Dos coenzims importants són l’NAD+ i el FAD, que participen en reaccions d’oxidoreducció.
Els metalls són importants com a cofactors (coenzims metàl·lics).
Exemple de mecanisme de catàlisi: les proteases estat de transició Les proteases són enzims que trenquen els enllaços peptídics de les proteïnes mitjançant una molècula d’aigua. El mecanisme d’acció en diferents proteases serà diferent i podran classificar-se en funció de la seva naturalesa. En les serin-proteases, per exemple, serà molt important la presència de serina, mentre que en les metal-proteases serà rellevant el metall.
Hi ha també treonin-peptidases, cisteïn-peptidases...
Aminoàcids de butxaca Els aminoàcids de butxaca són rellevants per conferir especificitat a les serin-proteases, enzims amb un residu de serina que catalitzen la hidròlisi dels enllaços peptídics. En són exemples la tripsina i la quimotripsina. Les diferents serin-proteases tallen les cadenes d’aminoàcids per l’extrem carboxil d’aminoàcids específics.
Acció de la quimiotripsina 1) Unió no covalent del polipèptid amb la cadena lateral de la butxaca hidrofòbica 2) Transferència de l’hidrogen cap a la His. La Ser s’activa, ataca el carboni i es forma el primer estat de transició tetraèdric 3) Transferència de l’hidrogen al fragment C-terminal que s’allibera. El fragment N-terminal queda unit a la proteasa mitjançant la Ser.
4) Unió d’una molècula d’aigua al complex en el lloc del pèptid alliberat 5) Transferència d’un protó de la molècula d’aigua a la His i formació del segon estat de transició tetraèdric.
6) Alliberació del segon fragment: es trenca l’enllaç acil, el protó torna a la Ser i l’enzim recupera el seu estat inicial.
Aquest procés podria dividir-se en tres fases: 1) L’hidroxil de la Ser195 de la quimiotripsina ataca al carboni de l’enllaç peptídic (1) 2) 1a etapa de la reacció: acilació  formació del primer estat de transició tetraèdric (2, 3) 3) 2a etapa de la reacció: desacilació  formació del segon estat de transició tetraèdric (4-6) Aminoàcids Asp102-His57-Ser195 com a relé de càrrega Carboxipeptidasa La carboxipeptidasa és un exemple de metalproteasa i utilitza un àtom de zinc per estabilitzar l’estat de transició.
CINÈTICA ENZIMÀTICA Equació de Michaelis-Menten La representació següent mesura la concentració dels diferents elements d’una reacció en funció del temps.
k1 k2 k-1 La formació del producte dependrà de la constant K2 i de la concentració del complex enzimsubstrat.
La reacció es dividiria en un estat pre-estacionari durant la qual es forma el complex enzim-substrat i un estat estacionari durant el qual la concentració del complex es manté constant, es va formant i degradant a la mateixa velocitat.
Al llarg de la reacció disminueix la concentració de substrat, augmenta la de producte i disminueix inicialment la d’enzim lliure mantenint-se després força constant.
Quan s’estudia una reacció es treballa amb l’estat estacionari, ja que la concentració del complex enzimsubstrat es manté constant i correspon a la major part el temps de la reacció.
En l’estat estacionari ES es forma tant com es descomposa, per tant: *KM = relació entre constants d’associació i dissociació També sabem que la concentració d’enzim lliure és igual a la concentració total d’enzim menys la concentració d’enzim unit a substrat, i és més senzill obtenir la concentració total d’enzim que la concentració d’enzim lliure i d’enzim unit a substrat.
El gràfic obtingut amb aquesta equació relaciona la velocitat de la reacció a diferents concentracions de substrat i té una forma similar al de la unió de l’oxigen a l’hemoglobina.
Observem en aquesta equació que KM està sumada a una concentració, per tant té unitats de concentració.
1. Què passa si la concentració de S és molt gran? ([S] tendeix a infinit) Es tracta d’una reacció saturable, un augment de la concentració de substrat porta la reacció cap a una velocitat màxima. Aquest fet indica que la reacció està catalitzada per un enzim.
2. Què passa si [S] = KM? KM dóna informació sobre el grau d’afinitat. Com més petita sigui major serà l’afinitat: es necessitarà menys concentració perquè reaccioni el 50%.
3. A vegades el complex ES no dóna directament E + P sinó que primer forma el complex EP.
k1 k2 k3 k-1 KCAT engloba totes les constants després de la descomposició del complex enzim-substrat i té unitats de segon-1. Inclouria k2 i k3.
4. Què passa si la concentració de substrat és molt petita? La velocitat tendirà zero.
5. Índex de perfecció enzimàtica L’índex de perfecció enzimàtica és la relació entre k CAT i kM (kCAT/kM). No pot superar un valor de 108 i permet determinar com funciona l’enzim. Un valor elevat indicarà que l’enzim funciona bé, mentre que una relació baixa indicarà que funciona malament. Per comparació de l’índex de perfecció enzimàtica és possible definir quin és el substrat preferit per un enzim o quin enzim és preferible per un substrat.
Així doncs, tot i donar valors diferents, Kcat i Km són valors rellevants per a la determinació de l’activitat d’un enzim.
Mètodes de representació Si bé la representació obtinguda amb l’equació de Michaelis-Menten permet conèixer de manera senzilla la velocitat màxima, es busca una representació que doni una línia recta ja que d’aquesta manera serà molt més fàcilment interpretable.
1. Representació de Lineweaver-Burk o de dobles inversos Amb aquesta representació només s’obtenen valors cap a la dreta ([S] baixa). La velocitat màxima, que correspondria a una [S] infinita, és un valor impossible per la qual cosa s’ha d’obtenir extrapolant la recta.
x=0  informació sobre velocitat màxima y=0  informació sobre KM El principal problema d’aquesta representació són els possibles errors en el càlcul de la concentració de solut. Pot passar per exemple que en una dissolució el solut no es dissolgui del tot.
2. Representació de Eadie-Hofstee Velocitat en funció de V/[S] En aquesta representació és més senzill determinar si algun punt s’allunya de la recta i identificar així errors. Serà més fàcil l’aparició d’errors quan es treballi amb concentracions elevades, doncs s’augmenta el risc de que la dissolució no sigui completa.
El pendent de la recta indicarà kM.
Per determinar que un enzim presenta cooperativitat ha de tenir estructura quaternària (més d’un lloc d’unió) i no ha de seguir aquesta representació.
Reaccions de més d’un substrat De manera global, les reaccions enzimàtiques poden classificar-se en funció del nombre de substrats i de productes. En bioquímica la majoria de reaccions són uni o bi i les representacions anteriors serveixen únicament per les del tipus uni-uni, amb un substrat i un producte. La presència de més d’un substrat implicarà més d’una kM.
Les reaccions del tipus bi-bi poden classificar-se en funció de l’ordre en que es produeixin.
Poden donar-se a l’atzar o de manera seqüencial, i dins d’aquestes trobaríem el subtipus pingpong.
Representacions de Lineweaver-Burk Es manté fixa la concentració d’un substrat i es modifica l’altre, obtenint-se representacions molt indicatives visualment.
1. Bi-Bi Ping-Pong Rectes paral·leles 2. Bi-Bi seqüencials Rectes convergents INHIBICIÓ Serà un inhibidor qualsevol compost que disminueixi la velocitat d’una reacció enzimàtica. La representació de Lineweaver-Burk permetrà indicar de quin tipus d’inhibició es tracta. Alguns reactius específics d’aminoàcids poden actuar com a inhibidors enzimàtics irreversibles formant una unió covalent.
Tipus d’inhibidors  Inhibició competitiva L’inhibidor reacciona amb el centre actiu de l’enzim i impedeix la unió del substrat. La velocitat màxima es manté ja que augmentant la concentració de substrat es dificulta la unió de l’inhibidor i és possible assolir la mateixa velocitat. Serà necessària una major concentració de substrat per a una mateixa velocitat ja que l’afinitat disminueix i augmenta la kM.
 Inhibició no competitiva L’enzim presenta un lloc d’unió per al substrat i un altre per a l’inhibidor. La unió d’inhibidor a l’enzim l’anul·la i no permet que el complex enzim-substrat actuï. La velocitat màxima, que depèn de la concentració d’enzim, es veurà disminuïda però no es veurà afectada l’afinitat, doncs el substrat s’uneix igual a l’enzim.
 Inhibició mixta Afecta l’afinitat i fa que part de l’enzim no actuï correctament.
Les següents representacions de Lineweaver-Burk amb i sense inhibidor permeten observar les diferències entre els diferents tipus d’inhibicions. En una inhibició competitiva (1) les dues rectes coincidiran en l’eix d’ordenades, indicant que es manté la velocitat màxima. En canvi, en una inhibició no competitiva (2) les dues rectes coincideixen en l’eix d’abcisses, indicant que es manté kM. No es coincidirà cap dels dos valors en un cas d’inhibició mixta (3).
Majoritàriament interessarà saber si la inhibició és competitiva pura o mixta. La inhibició competitiva pura serà més específica.
Disseny d’inhibidors específics Coneixent el centre actiu d’un enzim és possible dissenyar inhibidors específics.
Acció del TPCK sobre la quimotripsina La quimotripsina actua sobre cadenes polipeptídiques dividint-les després d’aminoàcid hidrofòbic.
El TPCK actua introduint-se a la butxaca hidrofòbica, com ho faria un aminoàcid hidrofòbic d’una cadena polipeptídica, i forma un enllaç covalent que impedirà l’actuació de l’enzim.
Si en lloc de fenilalanina el compost tingués lisina, un aminoàcid bàsic, actuaria sobre la tripsina amb un procés similar.
Cribratges d’alt número de compostos (high-throughput screening) Els cribratges d’alt número de compostos s’utilitzen per obtenir noves molècules bio-actives.
Es basa en el disseny d’un assaig sensible i automatitzable i en la utilització d’una col·lecció àmplia de substàncies ja siguin sintètiques o obtingudes de la natura. Després de la validació dels positius s’analitzen les molècules positives (activitat, especificitat) i es modifiquen els compostos. El cribratge es repeteix per intentar obtenir substàncies fàcils d’obtenir i barates.
Per exemple, tenim unes mostres on la presència de proteasa implica la pèrdua del color verd. En conjunt de mostres amb proteasa s’afegeix un possible inhibidor en cada una i s’analitzen els resultats. La presència de color verd en una mostra amb proteasa indicarà que la substància afegida inhibeix l’enzim.
CONCEPTES IMPORTANTS Entendre com un enzim accelera la velocitat d’una reacció i quantificar aquest efecte.
Definir qui és el lloc de l’enzim on es catalitza la reacció i quines característiques té.
Entendre la utilitat de conèixer el mecanisme d’una reacció i definir les proteases segons el seu mecanisme de catàlisi.
Entendre quin significat tenen els paràmetres KM; KCAT i VMAX (així com l’índex de perfecció enzimàtica) i com es calculen a partir de representacions gràfiques.
Recordar com es classifiquen les reaccions enzimàtiques en funció del número de substrats, número de productes i de l’ordre d’entrada i sortida i com es pot determinar gràficament aquest ordre.
Conèixer com es classifiquen els inhibidors enzimàtics, com es determina si són competitius o no i quina constant d’inhibició tenen.
Entendre com es poden trobar o dissenyar inhibidors irreversibles i específics per un enzim.
...