TEMA 7 – PCR (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Tècniques instrumentals bàsiques
Año del apunte 2015
Páginas 20
Fecha de subida 29/05/2015
Descargas 38
Subido por

Vista previa del texto

TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Tema 7 – PCR – Reacció en cadena de la pólimerasa PCR – Fonaments de la tècnica La PCR serveix per l’amplificació in vitro de seqüències específiques. Aquesta amplificació ve determinada per la presència de dos primers (un per cada monocadena). Tenim un DNA genòmic a partir del qual amplificarem una regió concreta.
Usarem la capacitat de la DNA polimerasa de funcionar in vitro sempre i quan tingui les següents premisses: - Primers amb l’extrem 3’ hibridat (la polimerasa va en direcció 5’3’) Nucleòtids DNA motlle La polimerasa va afegint nucleòtids als extrems 3’OH si estan hibridats correctament.
El què delimita la mida del producte de la PCR és la distància que hi ha entre els primers. És a dir, nosaltres dissenyarem dos primers que hibridaran amb una seqüència de DNA, un en el sentit 5’3’ i un en el sentit 3’5’. En funció dels bp que hi hagi entre els dos, el fragment a amplificar serà més llarg o més curt. Llavors, en funció de si els fragments amplificats són més llargs o més curts, programarem un temps o un altre en la PCR, perquè els primers acabin d’amplificar quan toca.
129 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Tu sempre saps la mida del teu producte, i en funció d’això gradues el temps de la PCR.
En una PCR té lloc una amplificació cíclica. Tu tens nombrosos cicles d’amplificació en els quals sempre repetirem els mateixos passos.
FASES DESNATURALITZACIÓ Per tal que els primers puguin hibridar hem de tenir el DNA en forma de cadena senzilla. El primer pas doncs és una desnaturalització inicial del DNA.
Aquesta fase (desnaturalització inicial) és més prolongada que la desnaturalització cíclica (la que té lloc en cada cicle), ja que en un primer moment tens el DNA completament en forma de doble cadena. La primera dura uns 3-5 minuts, mentre que en cada cicle la desnaturalització dura 30 segons – 1 minut.
Aquesta desnaturalització inicial té lloc a 95ºC.
ANNELING O HIBRIDACIÓ Després de la desnaturalització, es baixa la temperatura entre 55-60ºC i a aquesta temperatura és a la qual hibriden els primers.
EXTENSIÓ DE LA CADENA Posteriorment, tornem a augmentar la temperatura a uns 72ºC (pot variar en funció de la DNA polimerasa que haguem escollit) i té lloc la polimerització.
Aquest cicle es repeteix entre 30 i 40 vegades (no se sol superar el valor de 40 ja que comences a obtenir productes no específics d’amplificació).
Anem a veure cada etapa més profundament.
Partint del DNA genòmic, acabem obtenint, com a producte majoritari, el DNA comprès entre les dues seqüències primers. Això és degut a que el teu DNA genòmic inicialment es troba en baixes concentracions. A mida que es donen els cicles d’amplificació i el propi DNA amplificat és el seu propi motlle, cada cop s’acoten més les longituds amplificades.
És a dir, en la primera amplificació, per molt que ho puguis regular, no pots arribar a ajustar el temps d’extensió a nivell de nucleòtid i pot ser que s’amplifiqui una mica més de la zona que tu has determinat entre primers. Però a mesura que aquests productes actuïn coma a motlle, quan el primer torni a hibridar ho farà en la zona que determinarà la seva mida final, cada cop tindrem més fragments amplificats, i aquestes seran les molècules majoritàries.
Aquest augment de còpies que són limitades a la regió entre els dos primers és exponencial.
130 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Al cap de X rondes d’amplificació, fonamentalment tindrem el nostre fragment amplificat. Ho veiem en la següent imatge.
D=desnaturalització del DNA dúplex.
T = Hibridació dels primers (templado) E = elongació, extensió dels primers Com veiem, les dues noves cadenes són més curtes que el DNA de partida.
Com han de ser els primers? Per tal que la polimerasa pugui sintetitzar, hem de tenir un primer per cada cadena. Cada un ha de tenir un 3’OH hibridat. És important ubicar-los bé, perquè si els posem del revés ubicarem cap a fora de la nostra regió.
El primer de l’extrem 5’ del gen ha de tenir la seqüència de la cadena amb sentit (la que, per conveni, es reporta en les bases de dades). Aquest amplificarà la cadena complementària.
El primer de l’extrem 3’ del gen ha de tenir la seqüència de la cadena reverso complementària a la cadena amb sentit (reverso perquè sempre s’escriu en sentit 5’3’).
La gràcia de la PCR és saber d’on hem de treure els primers i sobretot saber la seqüència de cada un.
131 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 De les 4 noves cadenes, en 2 el creixement no pot sobrepassar la posició del primer – comença a delimitar-se l’amplificació del fragment diana.
Al final del 3r cicle comencem a veure còpies que corresponen únicament al fragment diana.
Augmenta la proporció dels fragments corresponents a la diana (són els que tenen l’estrelleta).
132 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 ESPECIFICITAT I RENDIMENT En cada cicle, una molècula ens en donarà dues més.
El rendiment teòric tenint en compte aquesta amplificació exponencial seria 2 elevat al nombre de cicles.
𝑵 = 𝟐𝒏 Amb 25 cicles: 𝑵 = 𝟐𝟐𝟓 = 𝟑, 𝟓 ∗ 𝟏𝟎𝟔 Aquest rendiment teòric no és el rendiment real – a partir d’un cert nombre de cicles, deixem de tenir una amplificació exponencial. A això ho anomenem efecte Plateau (corba en negre).
Això es dóna per 3 motius diferents: - Disponibilitat de substrat – primers, nucleòtids...
Estabilitat dels reactants a la Tª de desnaturalització – va disminuint l’activitat enzimàtica de la polimerasa.
Inhibició de la DNA polimerasa pel producte final – la presència de DNA de doble cadena les inhibeix.
Les PCRs tenen lloc en els termocicladors, un equip que té diferents ventiladors i màquines de refrigeració per poder canviar la temperatura ràpidament i amb una alta precisió (en mig minut pot pujar de 25 a 95 ºC). Aquests dispositius han seguit un procés d’evolució des que es van inventar.
En els primers termocicladors s’havien de canviar les mostres de lloc (tenies diferents zones a diferents temperatures).
Posteriorment, es posaven totes les mostres en el mateix lloc, però havies d’estar vigilant el tub. Però en un inici s’usava el fragment Klenow de la DNA polimerasa de E. coli enlloc de la Taq polimerasa (Thermos aquaticus) que s’usa actualment.
Més tard, es van dissenyar termocicladors que tenien un dispositiu regulador de la temperatura per no haver de canviar el tub. Tot i això, el problema era que la tapa era de plàstic, per lo qual a 95ºC la mostra començava a evaporar-se i no es podien fer tants cicles com ara.
La primera solució va ser posar una capa d’oli mineral sobre el líquid per evitar les evaporacions, i així no es modificava el volum de la PCR. L’únic problema era que per treure la reacció, la pipeta es veia contaminada amb l’oli mineral.
133 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Actualment, els dissenys actuals porten una tapa amb un dispositiu metàl·lic que escalfa, i la tapa, en estar igual de calenta que la mostra, evita condensacions en la part superior.
DISSENY DE L’ASSAIG Haurem de tenir en compte pel disseny de la PCR la selecció de la regió a amplificar, el disseny dels primers i l’optimització de la reacció.
És important la qualitat del DNA que usem en la PCR, doncs ha d’estar lliure de contaminants que puguin limitar l’amplificació.
També és important que no tingui nicks en la cadena, ja que aquests interrompen l’amplificació. Quant més llarg és el producte que volem amplificar, més important és aquest fet (per qüestió de probabilitat).
SELECCIÓ DE LA REGIÓ A AMPLIFICAR L’elecció de la zona que volem amplificar depèn de l’objectiu del nostre anàlisi. Això depèn de dos factors: - - El tipus d’anàlisi (si volem detecció, clonatge o quantificació). En la detecció, voldrem un producte d’entre 200 i 500 pb. En el clonatge, dependrem de la mida del gen que vulguem clonar. En la quantificació (qPCR), la mida de la seqüència que volem amplificar (anomenat amplicó) oscil·la entre 75 i 150 pb.
Tipus de regió que volem amplificar – regions comunes o regions específiques. La nostra PCR pot servir per detectar bactèries en algun fluid corporal, o pot servir per detectar quin tipus de bactèria està causant un tipus de malaltia.
Això ho resolem usant algoritmes d’anàlisi de seqüència – alineaments múltiples de seqüència (bioinformàtica). Podem fer servir BLAST, que busca regions que localment tinguin identitat amb la nostra seqüència, o un alineament múltiple (es fa també amb proteïnes) per veure en quines zones de la seqüència hi ha zones conservades.
Això és molt important a l’hora de dissenyar els primers.
Els primers els hem de dissenyar en llocs on no hi hagi tendència de formació d’estructures secundàries, ja que ens disminuiria la hibridació i per tant el rendiment.
DISSENY ESPECÍFIC DELS PRIMERS - Els primers han de ser específics pel què volem amplificar.
S’han d’hibridar de manera estable Han de ser compatibles.
134 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 ESPECIFICITAT Hem de tenir en compte els següents aspectes: - L’especificitat s’aconsegueix bàsicament buscant les zones de seqüencia apropiades.
Hem de tenir en compte també que la longitud ha de ser superior a 17 nucleòtids (si són més curts donen poca especificitat).
S’aconsella entre un 50-60% de GC (sempre que la seqüència ho permeti). Quant més alt el %GC, més estable és la hibridació, ja que tindrem més enllaços triples que dobles.
FORMACIÓ DEL DÚPLEX ESTABLE AMB EL MOTLLE Hem de tenir en compte els següents aspectes: - Tm i Ta dels oligonucleòtids Astringència en la hibridació Presència d’estructures secundàries MELTING TEMPERATURE (Tm) És la temperatura a la qual el 50% està en forma de monocadena i el 50% en doble cadena.
Aquesta Tm determina la temperatura d’hibridació o anneling dels primers.
La Tm dels primers acostuma a estar entre 60-70 ºC. El rang però es pot veure ampliat fins a 55-80ºC: 55ºC és el mínim tolerable perquè tal, i el màxim és 80ºC ja que és la Tm a la qual es fa amb els primers de clonatge.
Per determinar la temperatura d’hibridació es té en compte la zona homòloga. En els primers de clonatge tenim la zona homòloga, enzims de restricció i uns nucleòtids extres perquè es pugui ancorar l’enzim de restricció. La meitat del primer no hibrida inicialment. Per poder digerir el producte de la PCR necessites tenir en el primer el lloc de l’enzim de restricció. Per tal que l’enzim talli, necessites uns nucleòtids extres perquè pugui ancorar-se i tallar. Quan determines la Tm, has de tenir en compte tots aquests productes que estàs incorporant en el primer, i es poden assolir els 80ºC.
135 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 La Tm de cada primer es calcula considerant el següent (no cal saber-se les equacions): - Composició de bases - Concentració salina de la reacció - Considerant els paràmetres de la doble hèlix ANNELING TEMPERATURE (Ta) La Ta a la qual els primers hibriden és normalment 5 graus inferior a la Tm.
Ens hem d’assegurar que els primers hibriden amb el motlle abans que els motlle es torni a renaturalitzar. La Tm del producte – la Ta ens ha de donar > de 30ºC.
PRESÈNCIA D’ESTRUCTURES SECUNDÀRIES És molt important evitar la formació d’estructures secundàries, ja que et segresta el primer i no permet la hibridació.
Hi ha varis tipus: - Hairpin – la mateixa molècula dins d’ella mateix (unió intramolecular) Self-Dimer – la molècula amb una igual a ella (unió intermolecular) Dimer – el primer d’un extrem amb el primer de l’altre extrem.
El què és important d’aquestes estructures és: - G – si la seva formació és espontània.
Si hi ha 3’ que estiguin hibridats amb el motlle.
Si queda motlle.
136 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Tot això és important perquè els primer estan en excés respecte la seqüència que vols amplificar. Llavors, si estan hibridats entre ells mateixos, no tindràs ni primers ni polimerasa amplificant la teva seqüència diana.
COMPATIBILITAT El que ja hem dit, que no hi hagi seqüències complementàries entre si i que la Tm dels primers forward i reverse ha de ser o igual o 5ºC inferior a la Tm.
També es pot usar un software per fer el disseny dels primers, com per exemple: Primer3plus, Netprimer i Oligo.
OPTIMITZACIÓ DE LA REACCIÓ Anem a veure tota una sèrie de paràmetres que podem modificar en una PCR. El més important de tot és: - Especificitat màxima Rendiment màxim Evitar contaminacions (evitar falsos positius) Els components de la reacció són: - DNA motlle – important evitar nicks o impureses Encebadors – 0.1 – 1 μM Buffer – Recomanat pel fabricant de l’enzim (10x) MgCl2 – Cofactor de la polimerasa dNTPs – En excés, els 4 dNTPS a concentracions equimolars (20-200 μM) Enzims – 1U/50 μL A nivell d’aquests components de la reacció, podem manipular la quantitat de magnesi. El magnesi és un cofactor de la polimerasa i a més la presència de Mg2+ estabilitza la formació de la doble hèlix.
Si tenim una PCR no específica (veiem més d’una banda en el gel), hauríem de disminuir la quantitat de magnesi per tal que sigui més específica.
En funció del tipus d’aplicació que vulguem fer, podem escollir diferents característiques de la polimerasa: - Processativitat – comprovació de si hi ha hagut recombinants Fidelitat – activitat exonucleasa 3’5’ per reparar i corregir els errors. És important sobretot pels clonatges, per comprovar recombinants.
Mida del producte final – per a productes llargs es necessiten polimerases especials.
137 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS - PARCIAL 2 Extrems generats en el producte Estabilitat a altes temperatures – ho són durant bastant de temps.
Els paràmetres del cicle són la temperatura, el temps i el número (quants en farem).
- Les temperatures i el temps requerit per cada pas del cicle: o 1. Desnaturalització inicial – 95ºC, 2-5 min (Hot start) o 2. Desnaturalització del cicle – 94-95ºC, 30s – 1min o 3. Hibridació – 50-60ºC, 30s-1min (Ta=Tm primers -5ºC (20nt, 100% match) o 4. Extensió – 68-72ºC, 1min/kb de producte o 5. Elongació final – 68-72ºC, 5-7 min  Repetirem els passos 2-4 entre 25-32 cicles.
Un dels paràmetres més importants és el temps de desnaturalització inicial. Aquest depèn del tipus del motlle que uses – amb plasmidis, 2-3 minuts; amb DNA genòmic, 4-5 minuts (per la mida).
A nivell d’aquests paràmetres, també podem optimitzar la temperatura d’hibridació. Si veiem inespecificitat, hem d’augmentar la temperatura d’hibridació.
La temperatura d’extensió depèn de la DNA polimerasa (cada una té una temperatura òptima).
El temps d’extensió depèn de la velocitat, que sol ser d’1min/kb. És important acotar aquest temps d’extensió, per evitar productes no desitjats majors que el teu producte (és un indeseable).
APLICACIONS Algunes serien: - - Clonatge de seqüències de DNA eucariotes amb RT-PCR Mutagènesi dirigida Quantificació (de DNA o RNA) amb qPCR Identificació d’extrems 5’ i 3’ del mRNA Seqüenciació Identificació de polimorfismes o Diagnòstic de malalties o Proves de paternitat o Medicina forense Diagnòstic Classificació i genotipat Només veurem el clonatge de seqüències de DNA eucariotes amb RT-PCR i la quantificació amb qPCR.
138 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 RT-PCR Reverse Transcriptase – PCR. Es tracta d’una PCR que passa el RNA a cDNA.
Aquestes PCRs s’utilitzen per aconseguir el DNA complementari i poder analitzar l’expressió d’un mRNA, per amplificar el material genètic d’un retrovirus, i sobretot per clonar gens d’eucariotes. El clonatge de tots els gens eucariotes en bacteris que tenen introns es realitza d’aquesta manera. De fet aquest mètode va sorgir per donar resposta a aquest fet.
ESTRATÈGIES DE RT-PCR La metodologia comença sempre per aïllar el mRNA. Un cop el tenim aïllat, podem seguir diferents tipus de protocols. Concretament, tenim 3 estratègies diferents.
- Specific priming. Tenim un mRNA en abundància. D’aquest mRNA, utilitzant un dels primers específics per fer el cDNA, amplifiquem només el fragment que ens interessa.
Tot seguit, amb l’altre primer i la polimerasa, obtenim el nostre fragment en forma de doble cadena.
- Oligo (dT) priming. Creem el cDNA utilitzant oligo dT (compost per Timines, s’uneix per complementarietat a la cua de poly-A dels mRNA). Degradem el mRNA amb RNAsaH o incubant-lo amb solucions bàsiques. Finalment utilitzem els primers específics per amplificar aquest cDNA que hem obtingut. Aquesta estratègia serveix per tots els gens que tinguin cua de polyA.
139 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS - PARCIAL 2 Random priming. La tercera estratègia passa per fer servir hexanucleòtids (oligos de seqüència degenerada que hibriden amb qualsevol seqüència). Amb aquests obtenim un pool de cDNA i a partir d’aquest pool es fa l’amplificació específica.
Les polimerases que s’utilitzen són reverso transcriptases d’origen viral – s’aillen els enzims de retrovirus. Les més comunes són: - AMV-reverse transcriptase M-MuLV-reverse transcriptase METODOLOGIA La RT-PCR es pot fer en un sol pas o en dos, en funció de l’objectiu de l’estudi: - One Step RT-PCR. Es dóna la retrotranscripció i la PCR en el mateix pas. Ho posem tot al mateix tub, ho incubem a 37ºC (temperatura a la qual treballen les reverso transcriptases) i després es dóna la PCR automàticament.
- Two Step RT-PCR. Es fa la retrotranscripció per obtenir el pool de cDNA generats. Tot seguit podem fer PCRs per a diferents gens i en diferents moments.
Real-Time PCR (qPCR) Aquesta PCR es diferencia de la PCR normal pel fet que pots fer la detecció en temps real dels productes de PCR. Això és degut que inclourem fluoròfors a la reacció que ens permetran seguir l’amplificació a temps real.
CARACTERÍSTIQUES El paràmetre específic de la qPCR és la CT o CQ, de Threshold cycle o Quantification cycle.
Aquest valor correspon al número del cicle de la reacció d’amplificació en el qual la fluorescència procedent de la mostra s’eleva significativament i supera el llindar de la fluorescència inespecífica del fons, també anomenada background.
140 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Aquest valor s’obté a l’inici de la fase exponencial de creixement de la fluorescència. Amb aquest valor podem determinar la quantificació absoluta i relativa.
Normalment la mida dels amplicons acostuma a ser menor en les qPCR (oscil·la entre 75-150 pb). Això és important si analitzem mostres de mRNA, ja que aquest és molt làbil. Això significa que usant amplicons curts, encara que el mRNA no estigui en condicions òptimes, obtindrem resultats, perquè amb 75pb de producte que estigui sencer ja podrem fer determinacions.
La qPCR també permet una identificació precisa dels productes: - - Podem fer la identificació precisa associada a les corbes de melting.
Podem fer la identificació precisa emprant sondes específiques per un producte determinat.
TIPUS DE qPCR El paràmetre que determina els tipus de qPCR són els fluoròfors. Tenim: - Els fluoròfors corresponen a molècules intercalants del DNA. Entre aquests compostos trobem: o SYBR Green – més econòmic. Ens permet la identificació precisa associada a les corbes de melting. (el que explicarem) o Eva Green – fluoròfor saturant. Posem un fluoròfor al costat de l’altre al llarg de la doble cadena. Això ens permet fer unes corbes de fusió molt precises, ja et detecta les disminucions de la fluorescència. Detectarem tots els canvis que tenen lloc a mesura que es desnaturalitza la doble cadena. Això s’utilitza per la detecció d’al·lels diferents, ja que les temperatures de melting no són les mateixes i tens canvis en les seqüències.
141 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS - PARCIAL 2 Sondes d’hibridació específiques, les quals contenen els fluoròfors.
o Taqman (el que explicarem) o Molecular Beacons o FRET o Eclipse Probes, Amplifuor, Scorpions, QZyme Primers, LUX … SYBR GREEN METHOD El SYBR Green té unió inespecífica al dsDNA. Si tens més d’un producte en la teva reacció, la quantificació no serà la correcta, ja que no discrimina entre els productes correctes i els incorrectes.
S’utilitza aquesta molècula perquè veiem un augment de fluorescència associat a la formació del producte, ja que quan tenim el DNA en forma de cadena senzilla tenim molt poca fluorescència, i quan passem a doble cadena la fluorescència augmenta 1.000 vegades.
La fluorescència es mesura durant el pas d’extensió al final de cada cicle.
142 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Com sabem si tenim un sol producte? Al final de la PCR fem una corba de melting.
En aquesta es mesura la disminució de la fluorescència en el temps. Fent la derivada de la corba obtenim un pic que correspon a la Tm del producte que hem amplificat. Amb una PCR inespecífica, veuríem més d’un pic.
Aquest és un gràfic corresponent a una PCR on tenim dos productes diferents i dímers de primers. Aquests dímers els podem identificar perquè tenen una Tm molt inferior als productes normals de PCR.
Amb un resultat com aquest, no podrem usar aquest assaig per quantificar res, ja que hi ha més d’un pic de desnaturalització.
143 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 TAQMAN Tenim els dos primers específics, una sonda que té una molècula fluoròfor (senyalada com a R, de Reporter) i una molècula senyalada com a Q que és un Quencher d’aquest fluoròfor.
Aquest el que fa és impedir que s’emeti la fluorescència, perquè absorbeix l’energia. Per tal que es doni el quenching, les dues molècules han d’estar en proximitat.
Mentre R estigui unit a Q no tindrem fluorescència. Quan hi ha amplificació, la polimerasa degrada la sonda (activitat 3’5’ exonucleasa). En degradar la sonda, se separen R i Q i es dóna la fluorescència.
Aquesta fluorescència serà específica de l’amplificació del producte desitjat. Però aquest mètode és molt més car que el SYBR Green. Amb aquest mètode, per cada fragment que vols amplificar, has de sintetitzar la sonda específicament amb un R i un Q.
De totes maneres s’usa molt per la detecció de varis productes en un mateix tub, el que anomenem múltiplex Real Time PCR. El que haurem de canviar són les parelles de fluoròfor i quencher per poder detectar l’emissió a diferents longituds d’ona i saber quins productes corresponen a cada cosa. En el següent gràfic tenim l’espectre d’excitació: 144 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 I en el següent gràfic tenim l’espectre d’emissió: En aquesta PCR tindríem cinc parelles R-Q, per tant obtenim 5 espectres d’emissió a longituds d’ona diferents que ens permeten detectar què hi ha a cada mostra segons les ratios.
EVALUACIÓ DEL PROCÉS D’AMPLIFICACIÓ Anem a veure el procés de quantificació.
En primer lloc, anem a veure els paràmetres de la recta.
- Coeficient de correlació (r) - Eficiència (E). L’eficiència de la reacció es calcula fent dilucions seriades del material de partida. Cada cop tenim menys material, per tant el valor de CQ anirà augmentant (tenim menys motlle). És a dir, sabem que el valor de CQ depèn de la quantitat de molècules de partida. Per tant, si cada cop en tenim menys, el cicle al qual detectarem la fluorescència correspondrà a un número més alt, perquè hauran de passar més cicles perquè observem fluorescència.
Amb aquestes dilucions, dibuixem una recta patró, de la qual en podem calcular el pendent (slope).
L’eficiència correspondrà a: −𝟏 𝑬 = (𝟏𝟎𝒑𝒆𝒏𝒅𝒆𝒏𝒕 ) − 𝟏 Si tenim un 100% d’eficiència (una amplificació perfecta), significarà que a cada cicle aconseguim el doble de producte.
Una pendent perfecta correspon al valor de 3,3, que l’obtenim aïllant el pendent en la següent equació: −𝟏 𝟏 = (𝟏𝟎𝒑𝒆𝒏𝒅𝒆𝒏𝒕 ) − 𝟏 −𝟏 ∗ 𝒍𝒏𝟏𝟎 𝒑𝒆𝒏𝒅𝒆𝒏𝒕 𝒑𝒆𝒏𝒅𝒆𝒏𝒕 = −𝟑. 𝟑𝟐𝟏𝟗 𝒍𝒏𝟐 = L’eficiència l’expressem en %.
145 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 És important conèixer les eficiències de cada PCR per poder escollir el mètode adient de quantificació, i per saber què està passant en la PCR.
Amb una eficiència del 130%, estem detectant més molècules de les que es poden detectar a partir del teu motlle, per tant estem obtenint inespecificitats.
QUANTIFICACIÓ ABSOLUTA Un cicle de diferència és el doble de material, per tant, hem de tenir molta precisió a l’hora d’interpretar els gràfics. Una mateixa recta patró pot usar-se per calcular el número de còpies que hi ha d’un virus per ml/sang (càrrega viral).
146 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 QUANTIFICACIÓ RELATIVA Quan fem una quantificació relativa, no parlem de valors en termes absoluts, sinó que parlem dels valors de l’expressió d’un gen, de la quantitat de motlle de partida, etc. utilitzant un valor de referència.
Tenim dos mètodes per fer una quantificació relativa d’una qPCR: el Mètode Livak o ddCt i el Mètode Pfaffl.
MÈTODE LIVAK Aquest mètode s’utilitza quan les eficiències són més grans de 90% i quan la diferència d’eficiències entre el gen que volem comprovar i el que utilitzem com a referència és menor del 5%.
Volem veure les diferències relatives entre una condició inicial i un tractament o algun tipus de modificació que haguem fet nosaltres (volem veure si l’expressió es veu afectada).
Ho explicarem mitjançant un exemple. Volem veure si augmenta l’expressió del p53 (gene target) a nivell de mRNA en cèl·lules cancerígenes respecte cèl·lules sanes.
Nosaltres partirem d’una mostra control i una mostra amb cèl·lules tumorals. En ambdues mostres tindrem el gen de referència. Aquest gen normalment forma part dels anomenats housekeeping genes, ja que la seva expressió és més o menys constant en totes les mostres.
Entre aquests gens trobem la tubulina, l’albúmina, rRNA, i el que farem servir nosaltres, la gliceraldehid 3-fosfat DH.
D’una banda observarem el CQ o CT en p53 en les cèl·lules control, i tot seguit observarem el CT en la nostra mostra de cèl·lules tumorals.
D’aquesta manera podrem fer una ratio d’expressió. Els passos a seguir per fer aquesta ratio són: 1. Normalitzar CT del gene target en front el CT del gen de referència.
Calculem la variació de CT (CT) entre el gene target i el housekeeping gene en ambdues mostres. En la mostra control (calibrator) la diferència és de -1,5 cicles, i en les cèl·lules tumorals (test) CT és de -3,9 cicles.
147 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 2. Normalitzar dCT de les mostres problemes en front del dCT del calibrador.
Amb això, calculem el CT, que és la variació de la mostra problema menys la variació de la mostra control.
Aquest valor correspon al número de cicles d’amplificació que hi ha de diferència. Normalment la diferència es reporta com Relative fold differences (les diferències en quantitats relatives).
3. Calcular la ratio d’expressió.
Per calcular aquesta diferència, com sabem que en cada cicle el material genètic es duplica (2n), elevarem 2 a CT.
Aquest valor ens indica que les cèl·lules tumorals expressen el gen p53 5,3 vegades més que les cèl·lules sanes o control.
MÈTODE PFAFFL Quan no es compleixen les condicions pel mètode Livak (quan les eficiències són inferiors al 90% i quan la diferència d’eficiències entre el gen que volem comprovar i el que utilitzem com a referència és major del 5%), procedim a fer el següent: Obtenim una ratio entre l’eficiència de la nostra mostra problema i l’eficiència de múltiples mostres controls (s’usen 3 gens de referència per una major normalització). En el denominador posarem la mitjana obtinguda de les ratios per cada un dels 3 gens de referència.
148 ...