Cultius Cel·lulars Tema 7 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2015
Páginas 3
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 6

Vista previa del texto

1 2 3 4 5 6 7 TEMA 7. CONTAMINACIONS DE CULTIUS.
7.1 TIPUS DE CONTAMINACIONS Ens podem referir a contaminació de varis tipus, però la més important de totes i la que més costa de controlar és la biològica. La contaminació física fa referència a les condicions externes al medi: temperatura, vibracions, radiacions UV, radiacions ionitzants. La contaminació de tipus químic té a veure amb la concentració dels components que apliquem als cultius. Així, posar una concentració inadequada d’algun compost és considerada una contaminació química. També té a veure amb el material amb el qual treballem els cultius, principalment plàstic i vidre.
7.2 CONTAMINACIÓ PER MYCOPLASMA La pitjor contaminació biològica és la contaminació per mycoplasma. Per fer-nos una idea de la capacitat d’infecció i propagació que té, un sol cultiu infectat d’aquest bacteri en un laboratori és suficient perquè en menys de sis setmanes hagi contaminat absolutament tot el material de treball, cultius i aparells inclosos.
La contaminació per mycoplasma és per errors de manipulació i falta de condicions higièniques, doncs la majoria d’exemplars d’aquesta espècie procedeixen de persones humanes. Mycoplasma té efectes nocius en les cèl·lules: els produeix alteracions cromosòmiques, canvis en el metabolisme d’àcids nucleics i aminoàcids, alteracions en la taxa de creixement i la seva capacitat d’adhesió a membranes cel·lulars indueix canvis en la morfologia i comportament de les cèl·lules en cultiu. A vegades les cèl·lules infectades amb mycoplasma adquireixen característiques de cèl·lula transformada, tot i que realment no ho estiguin.
Per detectar les contaminacions per mycoplasma podem aplicar dos mètodes: els directes i els indirectes.
Mètodes directes: els fan sols els laboratoris especialitzats en microbiologia. Consisteix en agafar els mycoplasma dels cultius infectats i fer-los créixer en agar. Al cap de 3-4 setmanes es podran visualitzar en microscopi unes colònies en forma d’ou fregit que ens revelaran la presència de mycoplasma en el cultiu.
Mètodes indirectes. Podem fer, per exemple, una 1 tinció del DNA. Podem utilitzar els fluorocroms Hoechst i DAPI, i observar els resultats en microscopi de fluorescència. Aquests fluorocroms tenyeixen el material genètic. Si veiem que, a més del nucli cel·lular, hi ha unes estructures fibril·lars extranuclears que també estan tenyides, indica la presència de mycoplasma. És un sistema molt simple que no va bé quan hi ha contaminacions petites, doncs no les detecta.
Això és un mètode per detectar “endogenous infection”. També podem utilitzar cèl·lules indicadores. Fem créixer dos tipus de cèl·lula: unes infectades i les altres no. Agafem el medi de les cèl·lules contaminades i les posem en el medi de cèl·lules no contaminades. Posteriorment apliquem els fluorocroms i amb el mateix mètode que abans mirem si hi ha DNA extranuclear o no.
Un altre mètode indirecte és la 2 PCR. En aquesta tècnica, apliquem primers que reconeixen regions específiques del DNA de mycoplasma. Tenim dos tipus de primer: un que reconeix gairebé totes les espècies d’aquest bacteri i un altre que només reconeix els de ripus acoleplasma.
3 Detecció d’activitat adenosina fosforil·lasa. És un enzim propi de mycoplasma. Si afegim MPDR, l’enzim la converteix en una molècula tòxica. Per tant en presència de mycoplasma les cèl·lules es moriran. És per això que cal fer un cultiu específic a part per fer aquest test i prou.
4 Mycoalert. És un substrat que, en presència d’ADP i Mycoplasma, és capaç d’esdevenir ATP i amb aquest acoblar una reacció que produeixi llum. En aquells cultius on hi hagi contaminació apreciarem un increment de la luminiscència.
Ens permet detectar quantitats molt petites de mycoplasma i el temps d’anàlisi és molt curt.
Un cop hem detectat la presència de mycoplasma en els nostres cultius, podem fer dues coes: eliminar els cultius i fer neteja del material (millor opció) o intentar salvar el cultiu. En el segon cas, l’única solució és tractar amb antibiòtics específics per aquest bacteri, doncs no podem posar-ne un que ataqui la paret cel·lular perquè no en té.
En els laboratoris amb grans quantitats de medi de cultiu s’han desenvolupat estratègies per assegurar que els medis no estan contaminats abans de començar a cultivar-hi. Poden fer o bé 1 tractament amb temperatura elevada durant pocs segons o bé 2 tractament amb raigs UV a temps curts. El tractament a alta temperatura és prou alt per matar a bacteris, fongs i virus però no desnaturalitza les proteïnes del medi. Cap dels dos sistemes altera la viabilitat cel·lular i la producció.
7.3 CONTAMINACIÓ PER BACTERIS I FONGS.
Bacteris. Són fàcilment detectables: fan que un cultiu es torni tèrbol i de color groc a causa del viratge del pH.
És important treballar sense antibiòtics perquè així es posen en evidència les contaminacions. A més els antibiòtics modifiquen algunes característiques cel·lulars. Per recuperar un cultiu la solució és posar-hi antibiòtics.
Llevats i fongs. Si al cap de setmana has begut cervesa o has fet pa, pot ser que contaminis les mostres el dilluns amb espècies d’aquests organismes. Els fongs creixen fent fibres observables al microscopi; a simple vista es veuen formant un tel a la superfície del cultiu. És important vigilar a la primavera i a l’estiu, doncs hi ha moltes espores a l’aire. Per recuperar el cultiu podem tractar amb antifúngics però com sempre la millor opció és llençar el material i començar de nou.
Virus. Són difícils de detectar. Podem apreciar més fàcilment les contaminacions degudes a virus amb efectes citopatogènics. Cal tenir en compte que els virus són espècie-específics, i que si una mostra de cèl·lules de vedella està contaminada amb un virus aquest no s’extendrà a la resta de cultius de cèl·lules d’altres espècies.
...