Tema 9: Mutagènesi i selecció de mutants (MB) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Microbiología - 1º curso
Asignatura Microbiologia
Año del apunte 2016
Páginas 3
Fecha de subida 09/04/2016
Descargas 51
Subido por

Vista previa del texto

TEMA  9:  Mutagènesi  i  selecció  de  mutants   1.Mutacions  com  a  generació  de  variabilitat   La  variabilitat  genètica  es  produeix  en  part  gràcies  a  les  mutacions,  aquestes  es   produeixen  per  alteracions  o  mutacions  degut  a:       1.1  Errors  de  la  DNA  polimerasa     Són  mutacions  espontànies,  succeeixen  durant  el  cicle  vital  normal  de  la  cèl·lula.     La  DNA  polimerasa  s’encarrega  de  replicar  el  material  genètic.  Aquesta  presenta   tasses  d’error  molt  baixes,  ja  que  té  activitat  exonucleasa  que  li  permet  reparar   per  si  mateixa  els  errors  durant  la  inserció  de  bases  errònies.  Els  errors  durant   la  replicació  es  troben  al  voltant  de  10-­8  a  10-­9  per  cada  base  en  cada  cicle  de   replicació  (equival  a  8*106  pagines  text  sense  cap  error).     -­Substitució,  eliminació  o  addició  de  bases.   -­Canvi  en  el  marc  de  lectura     1.2  Mutació  per  element  mòbils     Són  mutacions  espontànies,  succeeixen  durant  el  cicle  vital  normal  de  la  cèl·lula.     Els   fenòmens   de   transposició   succeeixen   amb   una   freqüència   10-­4,   aquests   elements  mòbils,  provoquen  salts  de  seqüències  de  genoma  d’un  lloc  a  una  altre,   i  poden  provocar  mutacions.     -­Provoquen  la  inserció  de  fragments  de  DNA  en  gens.       1.3  Lesions  del  DNA   Són  mutacions  induïdes  per  agents  químics,  físics  i  biològics  que  incrementen  la   tassa   de   mutació   espontània,   i   per   tant   indueixen   a   mutacions   (agents   mutàgens),  degut  a  que  danyen  directament  o  alteren  químicament  el  DNA,  a   més  també  poden  interferir  en  els  mecanismes  de  reparació.     -­Anàlegs  de  bases   -­Agents  intercalants.     -­Dímers  de  timina.     Lesions  en  el  DNA  no  reparades  correctament  produïdes  per  agents  mutagènics   exògens  o  endògens:     -­Agents  exògens:  aquestes  mutacions  es  poden  produir  per:  radiació  UV,   gamma,  X,  i  agents  químics  i  físics.  Es  troben  fora  de  les  cèl·lules.   -­Agents  endògens:  aquests  els  produeix  la  propia  cèl·lula  i  són  producte   del  propi  metabolisme  cel·lular  que  provoquen  lesions  perjudicials.     Les  lesions  que  tots  dos  provoquen  són  diferents  com  en  el  cas  de  la  radiació   UV  que  provoca  aquests  dimers  de  timina,  o  els  trencaments  de  doble  cadena,   o  també  hi  ha  espècies  reactives  que  prodeuixen  oxigen  en  el  cas  dels  endògens   o  d’altres.  També,  un  típic  agent  exògen  són  els  derivats  del  sofre  (Gas  mostassa   1a  Guerra  Mundial,  el  qual  és  tòxic).               2.  Mecanismes  de  reparació   En  front  de  les  alteracions  trobem  mecanismes  de  reparació,  que  conté  la  pròpia   DNA  polimerasa  i  també  en  el  cas  dels  elements  móbils,  però  fronts  les  lesions   del   DNA   per   agents   mutagènics   endògens   i   exògens   troben   diferents   mecanismes  que  si  estan  en  altes  concentracions  no  trobarem  mutacions,  però   en  el  cas  que  no  es  reparin  aquestes  lesions  pre-­mutagèniques  s’acabaran  fixant   i  produint  una  mutació.     Els  mecanismes  de  reparació  reparen  correctament  els  errors  i  contribueixen  a   mantenir  l’estabilitat  del  genoma  amb  una  taxa  de  mutació  baixa.       L’eficàcia  d’aquests  mecanismes  no  es  la  mateixa  en  tots  els  procariotes,  alguns   poden   ser   més   resistents   resistents   a   la   radiació   UV   i   menys   a   la   radiació   ionitzant,  degut  a  la  eficiència  dels  mecanismes  de  reparació.       Tot   i   això,   quan   hi   ha   una   acumulació   de   lesions   es   difícil   que   es   produeixi   reparació   i   s’indueix   un   sistema   extrem   de   reparació   anomenat   SOS   o   de   reparació  per  emergencia,.  Quan  hi  ha  moltes  lesions,  la  forqueta  de  replicació   no  pot  avançar,  i  per  tant  si  es  para  la  cèl·lula  morirà,  llavors,  s’utilitza  aquets   mecanisme  mitjançant  unes  DNA  polimerasa  IV  (de  la  familia  de  Sam/Imp/Muc)   i  DNA  polimerases  V  (anàlegs  a  DinP)  específiques  que  no  tenen  la  capacitat  de   reparar,  és  a  dir,  de  tornar  enrere,  però  que  són  capaces  de  copiar  a  través  de   la   lesió   i   quan   l’han   superada   permet   retornar   la   DNA   polimerasa   normal.   En   aquest  moment  de  saltar  la  basa  es  col·loquen  bases  aleatòries  per  tal  de  passar   la  lesió  com  es  pugui.  Es  tracta  d’un  mecanisme  de  translesió,  que  produeix  que   la  cèl·lula  sobrevisqui  a  les  lesions  però  acaben  induint  a  mutacions.       S’estableix  un  equilibri  entre  els  elements  que  modifiquen  i  danyen  el  DNA  i  els   mecanismes  de  reparació  per  tal  d’assegurar  una  tassa  de  mutació  baixa  i  per   tant  que  la  cèl·lula  sobrevisqui.  Això  és  el  que  s’anomena  equilibri  genètic.     2.  Rastreig  de  mutants  nutricionals   Existeixen  diversos  mètodes  per  trobar  determinats  tipus  de  mutants:     1)     La   tècnica   de   rèplica   en   placa:   permet   detectar   els   mutants   nutricionals   defectius.   Amb   ajuda   d’un   tros   de   vellut   estèril   o   de   paper   de   filtre   es   fa   una   rèplica  de  les  colònies  de  una  placa  mare  en  una  altra  placa  amb  agar  però  sense   el  nutrient.  En  aquesta  tècnica  seleccionem  els  no  mutants.       Les   colònies   progenitores   creixeran   amb   normalitat   i   les   mutants   no.   Així   la   incapacitat   d’una   colònia   per   créixer   en   la   placa   de   rèplica   que   conté   el   medi   mínim   indica   que   es   tracta   d’una   colònia   mutant.   La   colònia   de   la   placa   mare   corresponent  a  la  taca  absent  en  la  placa  de  rèplica  i  es  pot  agafar,  purificar  i   caracteritzar.   Un   mutant   amb   necessitat   nutricional   per   al   creixement   se   l’anomena  auxòtrof  i  el  progenitor  del  qual  deriva  rep  el  nom  de  protòtrof.     Malgrat   es   de   gran   utilitat,   el   mètode   de   replica   en   placa   no   deixa   de   ser   un   rastreig.   Si   tractem   les   colònies   amb   agents   mutagènics   ens   serà   més   fàcil   d’obtenció  de  mutants  ja  que  estarem  incrementant  la  freqüència  de  mutació  tot   i  que  a  vegades  són  difícils  de  trobar  perquè  es  produeixen  en  baixa  freqüència.       2)  Resistència  front  a  antibiòtics   En   aquest   cas   en   comptes   s’aplica   la   penicil·lina   que   és   un   antibiòtic   que   afavoreix   els   mutants,   ja   que   al   aplicar-­se   en   una   colònia   amb   salvatges   i   mutants,   després   del   tractament   obtindrem   únicament   les   cèl·lules   mutants   ja   que  són  els  únics  que  tenen  resistència  i  potser  algun  salvatge  que  s’ha  escapat   de   l’efecte   de   la   penicil·lina.   Llavors,   podem   veure   com   és   el   cas   contrari,   es   tracta   d’una   selecció   per   el   mutant   i   no   en   contra   d’ell,   es   a   dir,   selecció   dels   resistents.       3)  Mutants  de  pigmentació   Algunes   mutacions   són   seleccionables   i   confereixen   alguna   avantatge   o   desavantatge   als   organismes   que   les   presenten,   com   són   els   casos   anteriors   (resistència   a   antibiòtic   o   necessitat   d’algun   nutrient   concret).   És   relativament   fàcil   detectar   i   aïllar   mutants   seleccionables,   però   també   hi   ha   mutacions   no   seleccionables  com  la  pèrdua  o  guany  de  coloració  d’un  organisme  pigmentat.   Aquests   mutants   no   presenten   avantatge   ni   desavantatge   respecte   els   progenitor,   i   únicament   els   podem   detectar   mitjançant   un   anàlisi   d’un   gran   número  de  colònies  buscant  les  “diferents”  en  un  procés  anomenat  de  rastreig  o   screening.                             [acasals]  Més  apunts  a:  https://unybook.com/perfil/acasals     ...