Tema 2 (Replicació DNA) (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Nutrición Humana y Dietética - 1º curso
Asignatura Biologia Molecular i Genòmica
Año del apunte 2014
Páginas 6
Fecha de subida 29/01/2015
Descargas 31

Descripción

Apunts Biologia del primer i segon parcial (2n Semestre NHD)

Vista previa del texto

Biologia molecular i genòmica TEMA 2.- REPLICACIÓ DEL DNA Replicació del DNA Replicació: és la duplicació completa del genoma. És semiconservativa (el DNA de les cèl·lules filles conserva únicament una de les dues cadenes parentals) i és un procés on intervenen una gran quantitat de proteïnes de manera coordinada.
DNA POLIMERASES: Per funcionar necessiten una cadena senzilla de DNA que actua com a motlle, els 4 desoxirribonucleòtids (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), a més de Mg2+ com a cofactor i un fragment d’RNA complementari del motlle, amb un grup hidroxil-3’ lliure que actua d’encebador. No poden iniciar la síntesi incorporant el primer nucleòtid.
- Llegeixen la seqüència de la cadena motlle en la direcció 3’ a 5’.
- Catalitzen l’elongació de la nova cadena en la direcció de 5’ a 3’.
Mecanisme de catàlisi: catalitzen l’atac nucleofílic d’un hidroxil 3’ lliure sobre el fosfat més intern del dNTP (fosfat α) que s’addicionarà, formant un enllaç fosfodièster, sempre que el nucleòtid a incorporar sigui complementari al del motlle. Necessiten l’ió Mg2+ per estabilitzar els intermediaris de la reacció.
Paràmetres característics: - Processivitat: número de nucleòtids que addicionen en cada cicle d’unió al motlle.
- Velocitat: nº de nucleòtids incorporats per segon.
- Fidelitat: capacitat d’elongar la cadena sense cometre errors de complementarietat; relació entre el nº de nts incorrectes i el d’incorporats.
La geometria en l’aparellament de les bases contribueix a la fidelitat de la replicació del DNA ja que únicament els aparellaments correctes tenen cabuda al centre actiu de la DNA polimerasa.
Principals tipus de polimerases procariotes: - DNA-polimerasa I: incorpora nucleòtids que falten i corregeix errors en la replicació, elimina els primers d’RNA.
La de E. coli és monomèrica i té tres dominis amb diferents activitats enzimàtiques:  Exonucleasa 3’ a 5’: trenca els enllaços fosfodièster a partir dels extrems 3’ hidroxil lliures quan detecta que l’últim nucleòtid incorporat no és complementari del motlle. És una activitat que corregeix els errors de la polimerasa abans de seguir polimeritzant.
 Exonucleasa 5’ a 3’: trenca enllaços fosfodièster a partir dels extrems 5’ fosfats lliures. Pot eliminar nucleòtids i la funció principal és eliminar els encebadors d’RNA utilitzant en la replicació així com corregir lesions en el DNA.
Biologia molecular i genòmica TEMA 2.- REPLICACIÓ DEL DNA Per poder copiar les cadenes amb la finalitat de marcar-les, amplificar-les o seqüenciar-les, s’utilitza el fragment Klenow de la DNA polimerasa I.
- DNA-polimerasa II: participa en la reparació del DNA.
- DNA-polimerasa III: és la principal responsable de la síntesi de DNA en la replicació, ho fa de forma ràpida i processava.
És tracta d’un complex multienzimàtic de gran mida amb moltes subunitats formant una estructura dimèrica asimètrica, amb tres tipus d’activitat catalítica en diferents subunitats:  Polimerasa 5’ a 3’ que elonga les noves cadenes (subunitat α).
 Exonucleasa 3’ a 5’, correctora d’errors de la replicació (subunitat ϵ)  Carregadora dels anells β al voltant de les cadenes (complex γ).
Mecanisme que utilitza: una molècula d’holoenzim replica dels dues cadenes del DNA (cada monòmer sintetitza una de les cadenes). S’associa a unes subunitats en forma d’anell, abraçadores β, que acobla al voltant de la doble hèlix, proporcionant gran processivitat i velocitat a la polimerasa.
El carregador de l’anell de la DNA és un complex proteic amb 5 subunitats amb activitat controlada per ATP.
 NO té activitat exonucleasa 5’ a 3’ (eliminadora de primers).
En el cas de l’E.coli la funció de síntesi és realitza amb velocitat elevada i processivitat, al contrari de la funció de reparació que és més lenta.
SÍNTESI D’ENCEBADORS: DNA-primasa (RNA-polimerasa).
Catalitza la síntesi dels encebadors (primers) d’RNA de la replicació, la inicia. Els seus substrats són els ribonucleòsids trifosfat: ATP, GTP, CTP i UTP a més de Mg2+; llegeix la seqüència motlle i polimeritza de 5’ a 3’ un fragment d’RNA (no té activitat correctora d’errors, exonucleasa 3’).
L’aparellament del primer d’RNA a la cadena motlle proporciona una pauta conformacional de doble cadena, i un extrem hidroxil-3’-lliure, a la DNA-polimerasa III.
TRANSCRIPTASA INVERSA (TR): polimerasa que sintetitza cadenes de DNA (bicatenari) utilitzant com a motlle una cadena d’RNA. El DNA sintetitzat és una còpia complementària de l’RNA motlle i es denomina c DNA (DNA còpia); és útil per la clonació de la seqüència codificant dels gens eucariotes que està present de forma lineal en l’RNAm.
ETAPES DE LA REPLICACIÓ Inici: Origen de la replicació en E.coli - El cromosoma d’E. coli té un únic origen de replicació (oriC)  Té seqüències pràcticament idèntiques, en tàndem, molt riques en A i T: punt d’inici de separació de les cadenes.
 Té seqüències repetides orientades en diferent sentit, que són el punt d’unió de la proteïna DNAa, iniciadora d ela replicació.
 És una regió rica en seqüències GTAC (dianes palindròmiques de metilació).
Biologia molecular i genòmica TEMA 2.- REPLICACIÓ DEL DNA - El cromosoma d’E. coli és un replicó (DNA que es replica a partir d’un únic origen de replicació).
El inici de la replicació consta de tres passos: 1. Metilació i fusió de la doble hèlix en oriC;  Senyal d’inici: metilació de les seqüències GATC d’oriC, per l’enzim metilasa Dam.
 Unió de la proteïna DnaA (iniciadora) a seqüències específiques de l’oriC metilat, generant un superenrotllament helicoïdal que afavoreix la desnaturalització de les seqüències adjacents riques en AT.
 Formació d’un complex obert d’iniciació.
 Acoblament de la helicasa DnaB a les dues cadenes del complex obert. Trenca els ponts d’H i separa les cadenes: formació de dues forquetes de replicació.
 La proteïna d’unió de la cadena senzilla; SSB protegeix i ajuda a mantenir les cadenes separades en les forquetes de replicació.
 El procés requereix l’energia d’hidròlisi de l’ATP.
2. Formació de les dues forquetes de replicació;  La replicació es bidireccional a partir del complex obert en oriC, es formen dues forquetes de replicació que avancen en sentits oposats fins que s’ha replicat tot el cromosoma.
 Les dues cadenes de DNA d’una forqueta de replicació són sintetitzades per un únic dímer asimètric de la DNA polimerasa III.
 Proteïnes de la forqueta de replicació (conjunt: replisoma): - Helicasa (DnaB): separa les cadenes, desnaturalitzen la doble hèlix permetent l’avanç de la forqueta de replicació. S’uneixen al DNA monocatenari i migren segons la seva especificitat (5’ a 3’ o al revés); trenquen els ponts d’H de les bases, en un procés depenent d’ATP.
- Proteïna d’unió a DNA de cadena senzilla (SSB): evita la renaturalització de les candenes).
- DNA-primasa: sintetitza els primers dels fragments d’Okazaki.
- DNA-polimerasa III: elonga les cadenes.
- DNA-polimerasa I: elimina els primers d’RNA (exonucleasa) dels fragments d’Okazaki i els substitueix per DNA.
- DNA-lligasa: uneix tots els fragments de la cadena retardada. Lliga els extrems 3’-hidroxil lliures amb extrems 5’ fosfat formant enllaços fosfodièster, la reacció utilitza NAD+ (procariotes) i ATP (eucariotes).
- Topoisomerasa II: elimina el superenrotllament positiu dels davant de la forqueta generat per la separació de les cadenes.
3. Síntesi dels primers  La DNA-primasa sintetitza els primers, petits fragments d’DNA complementaris de les cadenes motlle.
Biologia molecular i genòmica TEMA 2.- REPLICACIÓ DEL DNA  La DNA-polimerasa III copia les dues cadenes elongant els primers.
→ Cada monòmer de l’enzim s’uneix a una de les cadenes motlle (parentals) i sintetitza la nova cadena complementària.
→ Llegeix els motlles en la direcció de 3’ a 5’, a mesura que avança amb la forqueta de replicació.
→ Replica les dues cadenes del DNA simultàniament, de 5’ a 3’: - Sintetitza una de les cadenes de forma contínua a partir d’un únic primer; és la cadena guia o conductora.
- L’altra cadena la sintetitza de forma discontínua, en fragments d’Okazaki. Requereix tants primers com fragments; és la cadena retardada. La DNA polimerasa III forma un llaç en la cadena que li permet llegir el motlle en la direcció correcta (3’ a 5’) i sintetitzar fragments curts en la direcció de 5’a 3’.
La síntesi d’aquesta cadena comença quan ja s’han replicat 1000-2000 nts en la cadena conductora.
Finalització de la cadena retardada: DNA polimerasa III elonga les dues cadenes, la polimerasa I degrada els primers d’RNA i afegeix els nts que falten entre els fragments d’Okazaki de la cadena retardada, i són lligats per la DNA lligasa.
Terminació de la replicació: acaba on es troben les dues forquetes de replicació, en seqüències de l’extrem oposat a l’oriC: Ter. Aquest conté múltiples còpies d’una seqüència que es troben dipositades en dos grups d’orientació oposada, són punts d’unió de la proteïna Tus.
Els complexos Tus-Ter aturen les forquetes de replicació bloquejant el pas de l’helicasa, controlen l’arribada coordinada de les dues forquetes i eviten la sobrereplicació. Només actua un complex Tus-Ter, atura una les forquetes i l’altra s’atura al contactar amb la forqueta aturada.
La replicació genera cromosomes encadenats que han de ser separats per una topoisomerasa de tipus II.
REGULACIÓ DE LA REPLICACIÓ DEL DNA EN E.COLI Durant la divisió cel·lular cada cèl·lula ha de rebre una única còpia completa del genoma, una nova replicació ha de començar abans que la divisió s’hagi completat. En el cas dels procariotes, no hi ha interval de temps entre la replicació i la divisió.
L’inici de la replicació ha d’estar regulat per: - La metilació del DNA, per la metilasa Dam.
- Els nivells disponibles de la proteïna iniciadora DnaA lligada a ATP.
- Nivells disponibles de la proteïna SeqA, que bloqueja les seqüències hemimetilades d’oriC, provocant que no es pugui iniciar un nou cicle. Quan la proteïna abandona oriC la Dam metilasa actua i s’inicia una nova replicació amb la unió a DnaA.
Biologia molecular i genòmica TEMA 2.- REPLICACIÓ DEL DNA SEMBLANÇES EN LA REPLICACIÓ: EUCARIOTES I PROCARIOTES.
 És semiconservativa i bidireccional a partir dels orígens de replicació.
 Es necessiten encebadors d’RNA.
 Se sintetitzen simultàniament les dues cadenes del DNA de 5’ a 3’.
 La síntesi d’una cadena és contínua i la de l’altra és discontínua (replicació semidiscontínua), en fragments d’Okazaki.
 La regulació recau en el seu inici; quan comença continua seqüencialment fins el final (replicació seqüencial).
REPLICACIÓ DEL DNA EN EUCARIOTES La replicació la duen a terme dues DNA polimerases que treballen sincrònicament en la forqueta de replicació. No són enzims dimèrics i es necessita una polimerasa per a cada cadena.
El genoma nuclear eucariota té múltiples cromosomes a replicar, de gran longitud i lineals. Els cromosomes nuclears d’eucariotes tenen múltiples orígens de replicació, hi ha un interval de temps (fase G2 i S) entre la replicació i la mitosi, quan s’està dividint no es pot replicar.
Les polimerases són més petites i tenen menys subunitats que les bacterianes; l’activitat exonucleasa de 5’ a 3’ (eliminadora d’encebadors d’RNA) és un enzim independent; la primasa sintetitzadora d’encebadors està associada a una activitat polimerasa (Pol α).
- El complex DNA Pol α/primasa sintetitza els encebadors d’RNA i un petit fragment de DNA de la nova cadena..
- La DNA Pol δ i DNA Pol ϵ són més processives que la DNA Pol α i les responsables de l’elongació de les cadenes.
- La processivitat és deguda a que s’associen a un anell que envolta el dúplex de DNA que s’està formant.
Orígens de replicació: en tenen molts, així com replicons. Tenen seqüències riques en AT, és una replicació bidireccional i no s’activen tots els orígens de replicació alhora, sinó per regions i de forma regulada.
Inici de la replicació a.) Formació dels complexos pre-replicatius: està regulada i coordinada amb el cicle cel·lular. Requereix dues fases: - Selecció de replicó i formació d’un complex pre-replicatiu (pre-RC), en la fase G1.
- Activació del complex pre-RC, en la fase S. Es desenrotlla el DNA i es recluten les DNA-polimerases.
El complex pre-RC està format per:  El complex proteic de reconeixement de l’origen (ORC).
 Les proteïnes carregadores de l’helicasa.
 L’helicasa de la forqueta replicativa.
Biologia molecular i genòmica TEMA 2.- REPLICACIÓ DEL DNA b.) Activació dels complexos pre-RC: s’activen per fosforilació catalitzada per proteïnes quinases (actives a la fase S del cicle cel·lular), una vegada fosforilades es separen del complex i al pre-RC activat s’hi uneixen les DNA-polimerases i altres proteïnes auxiliars i s’inicia la replicació: l’helicasa separa les cadenes i es formen les forquetes de replicació.
L’activitat de les quinases regula la formació i activació del complex pre-RC: assegura que el genoma es repliqui només un cop en cada cicle cel·lular. Durant el cicle se sintetitzen i degraden una família de proteïnes petites, les ciclines, aquestes s’uneixen i activen les quinases específiques: quinases dependents de ciclines, que activades, activen els pre-RC. En les fases S, G2 i M, on les quinases estan activades, no es poden formar nous complexos pre-RC.
c.) Finalització de la replicació en els extrems dels cromosomes lineals eucariotes: per cada replicació, un DNA lineal s’escurça perquè els extrems 3’ de les cadenes parentals no es poden copiar, quedant a l’extrem 3’ de la cadena motlle una extensió protuberant de cadena senzilla. En l’extrem 5’, les cadenes retardades són més curtes que les motlle, i a l’extrem terminal falta un espai per a iniciar un nou fragment d’Okazaki, però el primer de l’últim fragment és eliminat i no pot ser reemplaçat per DNA.
TELÒMERS: seqüències específiques de DNA no codificant, dels extrems dels cromosomes lineals, que s’associen a proteïnes. Protegeixen la informació gènica que es perdria per escurçament de l’extrem del cromosoma en cada replicació.
Les seqüències telomèriques són DNA repetitiu agrupat (DNA-satèl·lit) - Múltiples repeticions directes en tàndem d’un oligonucleòtid curt.
- L’extrem 3’ sobresurt respecte l’extrem 5’ de la cadena complementària. Aquest extrem esta protegit per una estructura, llaç T, on participen diverses proteïnes TBP. L’enllaç segresta i protegeix l’extrem de l’acció de les nucleases i dels enzims de reparació del DNA. Si els telòmers s’escurcen excessivament, no s’hi poden unir les proteïnes i els extrems queden desprotegits: els enzims reparadors fusionen extrems de diferents cromosomes, el DNA es torna inestable i es perd la viabilitat cel·lular.
Paper de la telomerasa en la replicació dels cromosomes lineals: els telòmers poden ser regenerats per la telomerasa (enzim associat a RNA), el component proteic és una transcriptasa reversa i el fragment d’RNA associat és de mida variable segons l’espècie i té una seqüència complementària a la seqüència telomèrica.
En la majoria de es cèl·lules no hi ha activitat telomerasa, esta present a cèl·lules d’elevada proliferació. L’escurçament dels telòmers és marca d’envelliment i diana terapèutica.
Extensió dels telòmers per la telomerasa: la telomerasa elonga l’extrem protuberant 3’, produint una cadena motlle suficientment llarga per a que se sintetitzi un primer terminal i es copiï l’extrem. Una exonucleasa elimina el primer i queda un extrem curt 3’ protuberant, però el telòmer s’ha allargat.
...