PCR i Real Time PCR (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Ciencias y Tecnología de los Alimentos - 3º curso
Asignatura Seguretat Alimentària II
Año del apunte 2016
Páginas 3
Fecha de subida 03/04/2016
Descargas 12
Subido por

Vista previa del texto

PCR i Real Time PCR Tècniques moleculars d’anàlisi microbiològica dels aliments PCR RT – PCR  polimerasa inversa Real Time PCR Real Time RT – PCR Passos i cicles de temperatura de una PCR convencional Aquesta tècnica permet amplificar el número de còpies d’un fragment de DNA d’una mostra. La desnaturalització es fa a 95ºC, després es baixa la temperatura a 50 – 60ºC per hibridar l’encebador i que s’uneixi a la cadena complementària de DNA. Els encebadors actuen com a límits de la regió que es vol amplificar. A continuació s’eleva la temperatura a 75 – 80ºC i s’afegeix la DNA pol a la DNA motlle per sintetitzar la cadena complementària.
El paper crític de la temperatura en la hibridació Si la temperatura és molt alta els primers i la cadena motlle romanen dissociats Si la temperatura és molt baixa no es formaran els parells de bases correctes Amb la temperatura correcte els parells de bases es formen només als llocs designats 1 Claus per al desenvolupament de la PCR Polimerases termostables BIOTECNOLOGIA Termociclador  ENGINYERIA Pros i cons de la PCR Capacitat d’amplificació exponencial  contaminacions exponencials freqüents Disseny a mida de seqüències de DNA  múltiples aplicacions Baixa fidelitat de Taq DNA pol No amplifica RNA Altres DNA polimerases termostables Amplificació de RNA: RT-PCR Variació de la PCR en la qual una cadena de RNA s’amplifica per mitjà de la transcriptasa inversa per obtenir còpies de cDNA.
2 Aplicacions de la PCR i la RT-PCR Clonatge Mutagènesi dirigida Diagnòstic Clonatge: disseny experimental de primers Si es lliguen productes de PCR (cadenes dobles) amb errors aleatoris en un vector es clonarà amb aquests errors obtenint moltes còpies de la molècula amb el mateix error.
Diagnòstic: confirmació de resultats de PCR Hibridació de sonda interna Nested i semi-Nested PCR  és una modificació de la PCR que vol reduir el la unió no especifica en productes degut a la amplificació de llocs d’unió a encebadors inesperats.
Quantificació: Real Time PCR Quantificació de DNA amplificat addicionant un grup fluorescent a les cadenes de DNA que es va amplificant.
Quantificació de DNA amplificat per hibridació de DNA amplificat amb una prova fluorescent.
Diagnòstic/quantificació: necessitat de exhaustius controls Control negatiu  per discriminar falsos positius Control positiu  per discriminar els falsos negatius a. Control d’extracció de ADN b. Control RT i Taq DNA pol 3 ...