TEMA 3 Biologia Molecular (BIOMOL) (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 23
Fecha de subida 01/07/2017
Descargas 1
Subido por

Descripción

Inclou els apunts corresponents al tema 3 de l'assignatura Biologia Molecular: Expressió gènica.

Vista previa del texto

Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) TEMA 3: EXPRESSIÓ GÈNICA Com s’ho fan els gens codificats per ser transcrits i traduïts en proteïnes  El control de l’expressió gènica es pot donar en qualsevol etapa del flux d’informació que es dóna entre el gen i la proteïna activa.
Hi ha una gran diferència d’expressió gènica entre procariotes i eucariotes. Com a molt, un 1.5% del genoma codifica per gens que donaran lloc a proteïnes. En una cèl·lula mai s’estan expressant tots els gens, ni en eucariotes ni procariotes. Ha d’haver un mecanisme que reguli aquesta expressió. No és el mateix una cèl·lula del ronyó que una cèl·lula del fetge o de la pell malgrat el genoma és exactament el mateix.
En el cas d’un procariota necessitem regulació perquè ha de poder respondre al seu entorn de manera molt ràpida. Si hi ha lactosa necessita expressar els gens de l’operó Lac però si hi ha glucosa no el necessitarà.
La regulació és significativament diferent en eucariotes i procariotes.
D’entrada, a procariotes (no tenim nucli) el genoma es transcriu i s’obté un mRNA que serà captat per ribosomes i donarà lloc a una proteïna. Transcripció i traducció són simultànies en el temps i l’espai.
A eucariotes tinc un nucli on tinc cromosomes que seran transcrits i fins que aquest mRNA obtingut al procés de transcripció no surt al citosol, no és traduït. Per tant, transcripció i traducció estan separades en el temps i en l’espai. Primer es fa una i després l’altre. Una dins el nucli i l’altre al citosol.
Això és una diferència significativa en el procés de regulació de l’expressió gènica.
Regulació de l’expressió gènica  transcriure un gen i que arribi a proteïna, que faci la seva funció. Qualsevol procés o mecanisme que afecta al flux d’informació des de que tinc codificat el DNA fins que tinc proteïna i sigui funcionalment activa.
Com en procariotes és més simple i a eucariotes més complicat, tindrem a eucariota més punts de regulació de l’expressió gènica.
1 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Punts de control de regulació de l’expressió gènica en procariotes (PREGUNTA D’EXAMEN!) - Transcripció Traducció.
Punts de regulació en eucariotes (PREGUNTA D’EXAMEN!) - - - Quan es realitza la transcripció s’obté un pre-mRNA que ha de madurar per splicing fins a obtenir un mRNA madur.
Perquè siguin traduïts han de ser transportats del nucli cap al citosol.
Un cop madur, al citosol ha de ser traduït.
Per poder ser traduït ha de ser-hi al citosol, hi ha missatgers que estaran a la cèl·lula durant tot el cicle de vida i d’altres que només hi ha minuts. El temps de vida mitja del mRNA és molt important.
Quan ja no interessa un gen perquè ja s’ha traduït s’elimina el mRNA.
Un cop traduït, hi ha proteïnes que no són funcionalment actives i necessiten modificacions post-traduccionals per poder fer-les actives (plegament).
De la mateixa manera que els mRNA tenen un temps de vida mitja, les proteïnes també. Quan són degradades també són un altre punt de regulació de l’expressió gènica.
A banda d’això, puc tenir altres punts de regulació de l’expressió gènica anomenada punts de silenciament de gens.
En conclusió, els punts de regulació de procariotes són menys, transcripció, traducció i a eucariotes hi ha molts més punts de regulació de l’expressió gènica.
El lògic seria que el punt principal de regulació sigui el punt inicial. A nivell de transcripció. (La transcripció d’un gen es regula en l’etapa d’inici de la transcripció). Les cèl·lules eucariotes són complexes i necessiten elements que els permetin diferenciar-se i en canvi en procariotes necessiten ser ràpides en resposta a l’entorn.
L’etapa de transcripció és un punt crític i podem trobar tres tipus de gens: - Gens constitutius: sempre s’estan transcrivint.
En procariotes parlem de gens que codifiquen per components cel·lulars per funcions de manteniment (rRNA, tRNA, DNA i RNA polimerases, proteïnes implicades en síntesi proteica...) - Gens induïbles: gens que normalment no es transcriuen però quan fan falta es comencen a transcriure. Exemple: gens de l’operó Lac.
Són gens no constitutius induïbles que únicament s’expressen quan els seus productes són necessaris pel creixement en determinades condicions.
- Gens reprimibles: normalment s’estan expressant però en alguns moments no són necessaris i es para la seva expressió, es reprimeix.
També trobem, segons el seu nivell d’expressió: 2 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) - - Gens d’alt nivell d’expressió: són aquells gens que tenen un promotor que es diu FORT, és reconegut per la DNA polimerasa i es transcriu, donarà moltes còpies del RNA missatger.
Gens de nivell d’expressió mig: donarà menys còpies de mRNA Gens de nivell d’expressió baix: donarà molt poques còpies de mRNA Els gens de nivell baix i mig codifiquen per gens constitutius. En canvi, els d’alt nivell d’expressió confereixen especificitat, sobretot quan parlem d’expressió gènica en eucariotes. Podem diferenciar una cèl·lula de pàncrees d’una cèl·lula de ronyó...
La transcripció és el punt principal de regulació de l’expressió gènica i l’element crític o important de l’inici de la transcripció és la regió del promotor  Seqüència del genoma normalment ubicada davant dels gens on s’uneix la RNA polimerasa tant a eucariotes com a procariotes (lloc d’unió de la RNA polimerasa). La transcripció està regulada per proteïnes que s’uneixen als promotors o zones del voltant.
Promotors procariotes. Quan jo comparo i alineo diferents seqüències de promotors extraiem una seqüència consens, la seqüència resultat d’anar mirant a les diferents posicions que tenim trobem el mateix nucleòtid. Probabilitat molt elevada de que no variïn entre una seqüència i una altre.
Es poden extreure dues seqüències consens (PROCARIOTES): - Seqüència -10  es pot veure 10 nucleòtids abans de l’inici de la transcripció Seqüència -35 es pot veure 35 nucleòtids abans de l’inici de la transcripció La distància entre aquestes dues regions es troba aproximadament a 17 ±1 pb.
Quan hi ha canvis en les seqüències (seqüències variables) pot donar lloc a que siguin promotors forts, promotors febles o promotors intermedis. Els forts permeten transcriure els gens molts cops perquè la RNA polimerasa el reconeix fàcilment.
Evidentment, quan hi ha diferències de seqüència cada un tindrà el seu i això permet ajustar o tenir que un gen s’expressi més o menys. És a dir, diferències de seqüència permeten ajustar el nivell de cada producte gènic.
Hi ha altres seqüències que regulen l’inici de la transcripció: Hi ha altres seqüències que també regulen el procés de transcripció i són reconegudes per diferents proteïnes, són essencialment de tres tipus: 3 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) - Factors d’especificitat: varia el reconeixement de la RNA polimerasa pel promotor Repressors: reprimeixen l’expressió gènica (repressor Lac en el cas de l’operó Lac) Activadors: activen l’expressió gènica per un determinat gen Hi ha unes seqüències específiques on s’uniran cadascun d’aquests elements.
Diferències significatives entre eucariotes i procariotes.
Promotors de gens eucariotes no tenen una estructura que permetin treure seqüències consens, no hi ha regions -10 i -35 separades 17 pb.
Tenir els gens que participen en un determinat procés agrupats en unes estructures que reben el nom d’operons. Conjunt de gens que participen en un mateix procés s’anomenen gens estructurals i aquests estan sota el control d’un mateix promotor. Apareix una regió anomenada operador on normalment s’hi pot unir una proteïna repressora (OPERADOR  seqüència diana per una proteïna reguladora o repressor que es troba entre el promotor i el primer gen transcrit). El conjunt de gens estructurals + seqüències reguladores = operó, no confondre amb l’operador és només una d’aquestes seqüències reguladores.
Els operons són conjunts de gens relacionats amb una activitat determinada i que tenen un control i regulació comú. S’expressen conjuntament i es comporten com una unitat d’expressió coordinada.
Els operons bacterians estan formats per un complex de gens funcionals que contenen enzims per una determinada via metabòlica: - Gens estructurals  codifiquen per enzims i són traduïts a partir de mRNA únics (policistrònics) Promotor  regió d’unió a la RNA polimerasa Operador  punt d’unió de la proteïna reguladora Regulador  codifica per una proteïna repressora Repressor  (són proteines) s’uneixen a una seqüència específica de DNA per determinar si un gen determinat es transcriu o no (unió a l’operador).
L’OPERÓ LAC: REGULACIÓ POSITIVA I NEGATIVA En quines condicions l’operó lactosa té la màxima expressió? La regulació positiva es dóna quan hi ha la presència de la proteïna reguladora que activa la transcripció. En canvi, la regulació negativa es dóna quan hi ha la presència d’una proteïna repressora que quan està unida a la seqüència diana inhibeix o reprimeix la transcripció. Sovint la repressió es dóna de manera física, és a dir, 4 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) impedeix que la polimerasa s’enganxi al promotor o bé que la polimerasa avanci en el sentit de la transcripció.
Les proteïnes reguladores tenen un lloc d’unió a l’ADN i un lloc al·lostèric (reconeix les condicions del medi (p. Ex. Presència de glucosa) i provoca un canvi conformacional al domini d’unió a l’ADN, la qual cosa pot fer que actiu com un activador o com un repressor, depenent de si es facilita la unió a l’ADN o fa que es dissociï d’aquest.
Activar no és sinònim d’unir-se i desenganxar-se no és sinònim de reprimir.
L’operó de la lactosa està format pels 3 gens estructurals Z, Y i A (que codifiquen per 3 proteïnes) i la part reguladora: o o o Y  codifica per una permeasa (necessària perquè la lactosa entri a la cèl·lula) Z  codifica per la β-galactosidasa que trenca la lactosa en galactosa i glucosa A  codifica per una acetil-transferasa no implicada al metabolisme de la lactosa (transacetilasa), modifica derivats Aquest operó aprofita la lactosa del medi: quan no hi ha presenta nivells d’expressió baixos. El gen que codifica per una proteïna que funciona de manera constitutiva és el lac I i aquesta proteïna està codificada per la regió del repressor lac. Aquest té la capacitat d’interactuar amb la regió operadora i impedeix l’unió de la RNA polimerasa a la cadena (no és total, hi ha una expressió basal).
Aquests tres gens estructurals donen lloc a proteïnes que es transcriuen en un únic mRNA  policistrònic. Sistema de regulació que afecta a 3 gens alhora, o es transcriuen tots de cop o no es transcriu cap. (PROCARIOTES).
El gen Y codifica per una proteïna repressora o REPRESSOR LAC. Aquest gen està prop del gens estructurals però podria estar lluny, no és important pel funcionament de l’operó. El gen Y no forma part de l’operó pròpiament tot i que sigui important pel funcionament.
OPERÓ LAC = PROMOTOR + OPERADOR (que són regions reguladores) + 3 GENS ESTRUCTURALS - Regulació negativa (NO LACTOSA)  Repressor Lac s’uneix a l’operador i no permet la transcripció dels gens de l’operó Lac. Què ens passa quan al medi tenim glucosa però no tenim lactosa?  El bacteri si no té lactosa, el repressor s’uneix a la regió operadora i no es transcriuen els gens. Quan no hi ha lactosa el repressor, codificat per lac I, s’uneix a l’operador, reduint molt la transcripció dels gens estructurals, i evita que la RNA polimerasa s’uneixi. La situació està inhibida. Es tracta d’una unió no covalent, per tant pot ser que hi hagi una petita transcripció i per això trobem nivells basals d’expressió gènica.
5 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) - Regulació negativa (AMB LACTOSA)  quan hi ha lactosa al medi, l’alolactosa s’uneix al repressor que pateix un canvi conformacional i no es pot unir a l’operador. La transcripció pot tenir lloc. La lactosa actua d’inductor i l’alolactosa interacciona amb el repressor lac, que patirà un canvi conformacional que li farà perdre afinitat amb la regió operadora. La DNA polimerasa es podrà unir al promotor.
- Regulació positiva: La regulació positiva no és exclusiva de l’operó lac, hi ha altres proteïnes que també estan regulades per aquest control. Ex: operó de la maltosa, arabinosa, galactosa...  l’AMPc s’uneix a la proteïna receptora d’AMPc o proteïna activadora de catabòlits (CAP). Perquè és positiva?  Si la concentració de glucosa a la cèl·lula és alta, la concentració d’AMPc és baixa.
Perquè CAP pugui funcionar necessitem AMPc i aquest només estarà en alts nivells quan no tinguem glucosa. Si els nivells d’AMPc són elevats, s’uneix a CAP i això s’uneix a la regió del operador i es dóna la transcripció. El repressor, com no hi ha inductor (lactosa) es donarà una repressió dels gens. No es reconeix la regió del promotor. Es tria la glucosa com a font de C i hi ha poca expressió de lactosa.
No hi ha síntesi d’AMPc i això provoca el difícil reconeixement de la RNApol.
6 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Si tinc glucosa i lactosa, com la lactosa és un inductor, s’uneix a un repressor i no es pot unir a l’operador, es pot transcriure una mica els gens de l’operó Lac i la dissociació de l’operador té un efecte molt baix en la transcripció del gens de l’operó.
La repressió per catabòlit no és exclusiva de l’operó lac. Presència d’una proteïna unida a un lloc proper però més amunt del promotor.
Quan hi ha glucosa la cèl·lula no pot sintetitzar cAMP i el CRP o CAP és inactiu, de manera que no pot estimular la transcripció.
7 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM)  Normalment cAMP s’uneix a la proteïna CAP i aquestes dues unides s’uneixen al promotor en l’extrem 5’. Això serà reconegut per la RNA polimerasa i permetrà la transcripció. (en absència de glucosa).
 Com més glucosa hi ha, menys cAMP i per tant no es pot donar la unió cAMPCAP i per tant no hi haurà presència d’aquest complex al promotor en 5’ i es donarà la transcripció de l’operó lac LENTAMENT.
- Si tinc lactosa i no tinc glucosa, em veig forçat a utilitzar lactosa com a font de carboni. L’AMPc s’uneix a CAP i això permet que CAP es pugui unir a la regió promotora (CAP+cAMP s’uneix al promotor) i, un cop unida, en presència d’AMPc i nivells de glucosa baixos fan que la RNA polimerasa queda fortament unida al DNA, al promotor i tinc la màxima expressió dels gens de l’operó lac. La lactosa és necessària per la font de carboni. Es produeix la síntesi de cAMP i s’uneix al lloc proper a la regió promotora. En aquest estat, el sistema tindrà la mateixa eficiència d’expressió. L’expressió dels gens serà major quan menys glucosa hi hagi i més lactosa hi hagi.
A part de l’operó Lac, hi ha altres operons que estan subjectes al mateix sistema de regulació.
Quan no hi ha glucosa la cèl·lula sintetitza cAMP que s’uneix a CRP o CAP. Aquest s’uneix al DNA estimulant la transcripció. CAP és la proteïna activadora de catabòlit o repressor d’AMPc. La conformació de la proteïna canvia i pot interaccionar amb el lloc 8 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) de l’operó. Facilita el reconeixement de la RNA polimerasa amb el seu promotor. Això fa augmentar l’expressió dels gens estructurals. Les regulacions estan coordinades positivament i negativament. (quan no hi ha glucosa hi ha molt cAMP i es dona la unió cAMP-CAP, la qual s’unirà al promotor 5’ i es donarà una elevada transcripció dels gens de l’operó lac).
Quan no hi ha lactosa ni glucosa l’operó queda inhibit per totes bandes.
Reguló: aquell conjunt d’operons que actuen coordinadament perquè tenen un mateix mecanisme de regulació, poden ser per exemple diferents operons que codifiquen per enzims de diferents rutes metabòliques com l’operó Lac.
Hi ha altres regulons com els implicats en la síntesi de les proteïnes heat-shock (quan s’incrementa la temperatura on creixen el bacteris, proteïnes que poden experimentar desnaturalització) o els operons implicats en la resposta SOS (danys en el DNA) que fa reparació del DNA. Aquest conjunt d’operons formen un reguló.
Menys glucosa, més expressió del reguló i més CAP.
Promotors induïbles  operó lac Promotors repressors  operó trp Operó del triptòfan: Regula l’expressió de Trp a la cèl·lula. El triptòfan és necessari per la construcció de cadenes polipeptídiques.
L’operó del triptòfan està format per una sèrie de gens estructurals que codifiquen per 5 enzims que participen en les rutes de biosíntesi del triptòfan. A més, també està format per una regió promotora i una d’operadora. A banda dels gens estructurals, el promotor i l’operador, hi ha un segon mecanisme de regulació que és l’atenuació.
A l’extrem 5’ del mRNA policistrònic hi ha la regió spacer. El segueix la regió promotora i després la regió operadora. Molt més lluny hi ha un gen que codifica per una proteïna repressora que és inactiva quan NO hi ha triptòfan en el medi. Actua de co-repressor. Està controlat per 5 gens estructurals.
9 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Més amunt de la regió on hi ha situat aquest operó, hi ha un gen que codifica per un repressor, una proteïna. Un cop es transcriu aquest gen i es tradueix, dóna lloc al repressor, que en aquest cas és inactiu, és a dir, que no es pot unir a la regió operadora i, per tant, es transcriuen els gens.
Quan el bacteri no té triptòfan, es necessita que els gens s’expressin perquè se’n pugui sintetitzar. Per tant, quan no hi ha triptòfan en el medi, malgrat s’expressa aquest repressor, aquest no es pot unir a la regió operadora i es transcriuen els gens.
 Quan no hi ha triptòfan al medi, el repressor és incapaç d’unir-se a l’operador.
La transcripció pot tenir lloc.
Si en el medi hi ha triptòfan, aquest és capaç d’interaccionar amb la proteïna repressora, promoure el lloc d’unió del triptòfan (que és el co-repressor) i es produeix un canvi conformacional, per tant, el repressor esdevé actiu i, per tant, pot interaccionar amb la regió operadora bloquejant l’entrada de la RNA polimerasa i, per tant, no hi ha la transcripció dels gens.  Quan hi ha triptòfan al medi, aquest s’uneix al repressor que pateix un canvi conformacional i fa que aquest es pugui a l’operador. La transcripció no pot tenir lloc. El repressor s’expressa i el RNA traduït donarà lloc a una proteïna que interaccionarà amb el triptòfan, el qual esdevindrà actiu i s’unirà a la regió operadora. Provoca un canvi conformacional evitant l’unió de la RNA polimerasa i la síntesi de triptòfan.
10 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Aquest operó presenta una regió que està situada dins de tota la part que conté operador i promotor: regió atenuadora o regió líder o pèptid líder quan això es transcriu a mRNA. Aquest sistema de regulació per atenuació, permet una regulació més fina de la síntesi o expressió dels gens de l’operó del triptòfan en funció del triptòfan que hi ha a la cèl·lula.
El fet que es pugui regular per aquest sistema d’atenuació, va lligat al fet que en procariotes la transcripció i la traducció són simultànies en el temps i en l’espai. Per tant, quan es comença a tenir mRNA, l’extrem 5’ d’aquest ja es captat pels ribosomes i comença el procés de transcripció.
Quan s’ha sintetitzat l’extrem 5’ i es comença a transcriure, en l’extrem 5’ hi ha la regió o pèptid líder o atenuadora. A mesura que es comença a transcriure, es comença a traduir simultàniament (tot i que no s’hagi acabat el procés de transcripció). Quan el bacteri té uns nivells de triptòfan elevats, l’extrem 5’ del mRNA pot adoptar diferents estructures secundàries. D’aquestes quatre seqüències, la 3 té capacitat de formar aparellament de bases amb la 4 i formar un stem-loop i a més, també té la capacitat de formar aparellaments de bases amb la 2.
Quan els nivells de triptòfan són alts en el medi i aquest extrem 5’ ha començat a ser traduït, a la seqüència 1 hi trobem dos codons que codifiquen per triptòfan. Amb la 11 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) qual cosa, si hi ha triptòfan en el medi, no hi haurà cap problema en què aquests dos triplets siguin reconeguts pels corresponents tRNA que van carregats amb l’aminoàcid triptòfan.
Per tant, això començarà a ser traduït i, com que es tindrà prou triptòfan, el ribosoma traduirà ràpidament aquesta regió i començarà a agafar la regió 2. Fins i tot abans que 3 i 4 acabin de ser transcrits. Malgrat que la seqüència 2 pot formar aparellaments de bases amb la 3, com que està començant a ser atrapada pel ribosoma, perd la capacitat d’aparellar-se amb la regió 3 i aquesta regió 3 queda lliure per formar aparellament de bases amb la 4. D’aquesta manera, es formarà una estructura anomenada stem-loop o atenuador i promou una aturada del procés de transcripció, ja que bloqueja el pas del ribosoma.
Quan els nivells de triptòfan comencen a baixar, l’extrem 5’ o seqüència líder comença a ser traduït pel ribosoma, hi ha els dos codons que codifiquen per triptòfan.
Si no tenim prou triptòfan, el ribosoma es queda aturat durant un temps perquè no li arriben tRNA carregats amb triptòfan (perquè no n’hi ha prou).
La velocitat de traducció d’aquest extrem 5’ s’alenteix i si passa això, la seqüència 2 no ha entrat dins del canal del ribosoma, amb la qual cosa, com que la transcripció va continuant, la seqüència 2 pot formar aparellaments de bases amb la 3 i es forma una nova estructura que no és capaç d’aturar el procés de transcripció (no fa saltar la RNA polimerasa), la qual cosa li va molt bé perquè si hi ha nivells més baixos de triptòfan, el que es necessita és sintetitzar els enzims corresponents a la ruta metabòlica que permet obtenir aquest aminoàcid. Permet continuar amb la transcripció de l’operó trp.
PRINCIPALS SISTEMES DE REGULACIÓ PROCARIOTA USATS EN BIOLOGIA MOLECULAR Promotors procariotes: - Basats en el fag lambda: promotor pL Basats en el fag T7 Basats en l’operó Lac Basats en l’operó Trp 12 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) - Promotors sintètics (ptac i ptrc) L’operó del triptòfan té dos mecanismes de regulació: - Repressor: el repressor necessita el co-repressor per aturar la síntesi.
Regulació per atenuació: permet ajustar molt més finament l’expressió dels gens de l’operó en funció de les concentracions de triptòfan.
Aquests dos operons són l’exemple típic de l’expressió de la regulació gènica en procariotes. Molt dels promotors tant de l’operó Lac com el del triptòfan s’utilitzen molt en biologia molecular com a promotors per regular l’expressió des gens que ens interessa.
Per induir l’operó Lac es fa servir un anàleg de la lactosa que és l’IPTG (inductor) i en l’altre operó, una manca de triptòfan.
Quin dels dos respondria més ràpidament? El de l’operó lac, perquè és més fàcil afegir que no treure i regular els nivells de triptòfan a la cèl·lula costa.
No sempre hi ha promotors que responen com a inductors d’una substància química: hi ha promotors que responen a un canvi en la concentració salina, a canvis de pH del medi o de temperatura.
→ Promotor pL: en un plasmidi s’hi troben dos gens diferents però que un regula l’expressió de l’altre.
El promotor pL del fag lambda, que es fa servir molt en biologia molecular i expressió de proteïnes recombinants o gens és un promotor molt fort i fàcil d’induir, no requereix un inductor químic. Pot induir la resposta estrès de la cèl·lula. Regula les proteïnes del cicle del fag. Funciona així: PcI : Promotor cI gene: Codifica per la proteína que fa de repressor. Per induir-lo augmentem la T, fent que la prot. desnaturalitzi oL: Operador pL : promotor 2 13 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 1- Es col·loca un gen que interessa (que normalment no és propi de l’organisme) expressar darrera del promotor pL del fag lambda, el qual presenta una regió operadora. En aquest cas, a la soca que s’està expressant el gen hi ha introduït un gen que codifica pel repressor de la regió promotora pL del fag lambda. Per tant, aquest gen és d’expressió constitutiva (s’expressa sempre), per tant, el gen es transcriu, es tradueix i dóna lloc a una proteïna que s’uneix a la regió operadora del promotor pL.
2- Si es manté el bacteri creixent a 23C, aquest promotor és capaç de reconèixer la regió operadora, amb la qual cosa hi ha un bloqueig de l’entrada de la RNA polimerasa i una no expressió del gen que ens interessa. Si s’incrementa la temperatura del cultiu de 30 a 42C, aquest increment de la temperatura és suficient per desnaturalitzar aquest repressor. Per tant, aquesta proteïna es desnaturalitza, per l’estructura, i llavors no és capaç d’unir-se a la regió operadora.
Per tant, amb un increment de temperatura, es desbloqueja aquest promotor i es pot transcriure el gen.
Repressor termosensible: a 30ºC és actiu; a 42 ºC és inactiu i la proteïna es desnaturalitza (així sí que hi havia expressió de pL).
Inconvenient  a 42 ºC l’organisme té febre, afectant als bacteris i a les proteïnes i es pleguen  s’activa el sistema SOS. Hi haurà inestabilitat i és més fàcil perdre el plasmidi.
→ Promotor T7: codifica per RNA polimerasa del fag T7. Només aquesta proteïna pot reconèixer al promotor. Si un gen que es troba sota el control del promotor T7 en un plasmidi qualsevol no es podrà expressar perquè no té la RNA polimerasa del fag T7. Solució  soca DE3  contenen al seu genoma la seqüència que codifica per la RNA polimerasa de T7, està sota control de lacUV5 (que és el promotor del gen que codifica per la RNA pol de T7). L’operó lac s’ha modificat en això perquè s’assembli més a la seqüència consens i sigui més fort. Promotor fort i fàcil d’induir però el lisozim pot esdevenir tòxic. ITPG  serveix d’inductor perquè s’expressi el gen de RNA pol de T7.
14 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Per poder treballar amb el promotor que controla l’expressió de la RNA polimerasa del fag T7 com a regulador del gen que interessa expressar en l’hoste procariota: el gen està sota el control del promotor de la RNA polimerasa de T7. Aquest promotor no és reconegut per les RNA polimerases de la cèl·lula bacteriana, sinó que han de ser reconeguts per les RNA polimerases del fag T7. També es necessita una soca bacteriana que dins del genoma porta inserit el gen que codifica per la polimerasa del fag T7 i aquest gen està sota el control del promotor lac.
A més, dins del genoma bacterià hi ha codificat el repressor del promotor lac. Per tant, hi ha una expressió del repressor lac que s’uneix al seu promotor corresponent.
D’aquesta manera, la RNA polimerasa pròpia del bacteri no pot reconèixer aquest promotor i això significa que no expressa el gen de la polimerasa del T7. Si no hi ha polimerasa del T7, aquesta no podrà reconèixer el promotor i no es tindrà expressió del gen diana.
Aquest promotor de T7 s’ha modificat per afegir la regió operadora del promotor lac, per tant, hi ha una repressió doble tant de l’expressió de la polimerasa com del gen diana pel repressor lac. Són maneres d’assegurar que no hi hagi expressions basals de proteïna, i això és molt útil quan les proteïnes són tòxiques per la cèl·lula.
Quan s’hi afegir IPTG, aquest s’uneix al repressor lac, canviarà la conformació d’aquest repressor i no s’unirà a l’operador. La RNA polimerasa de la pròpia E. coli, reconeixerà aquest promotor lac i podrà transcriure el gen de la RNA polimerasa. Si ja hi ha RNA polimerasa del fag T7, aquesta RNA polimerasa reconeixerà el seu promotor i transcriurà el gen.
És un sistema més complex, però és més segur i, a més, controla molt bé l’expressió dels gens.
Hi ha soques que presenten variacions respecte aquest sistema, que reben el nom d’E. coli BL21pLys, que porten, a més, un plasmidi que expressa el lisozim del fag T7.
Aquest lisozim el que fa és inhibir l’expressió del gen de la polimerasa del T7.
PROMOTORS SINTÈTICS A part d’aquests n’hi ha d’altres i, els que tenen nivells d’expressió molt alts, porten a parlar de promotors híbrids, els quals barregen seqüències de promotor lac i del triptòfan.
15 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Els promotors sintètics o híbrids porten: - Ptac: la regió -10 del promotor lac (separat per 16 pb) i la regió -35 del triptòfan i és induïble per IPTG, igual que els altres.  (Ptrp –35 +16pb + Plac –10; IPTG) - Ptrc porta la regió -10 del promotor lac i la -35 del triptòfan, però amb una base al mig.  (Ptrp –35 +17pb + Plac –10; IPTG) - Ptic: porta la regió -10 del promotor lac, la -35 del triptòfan i una base més entremig.  (Ptrp –35 +18pb + Plac –10; IPTG) - placUV5: porta la regió -10 del promotor lac, la qual es separa de la regió mutada del promotor lac per 17 parells de bases  (Plac-35 +17pb + Plac-10mutated; IPTG)  Plac està mutat perquè sigui més similar a la seqüència consens. L’operó no estarà controlat per la lactosa.
El fet d’afegir una base al mig, canvia la capacitat d’aquests promotors de ser més forts (Ptac) o més febles (Ptic).
Hi ha promotors que són simplement mutacions dels promotors normals (lac o triptòfan).
- El promotor lac presenta uns nivells d’expressió moderats, és relativament fàcil d’induir però no està ben reprimit El promotor trp té un nivell d’expressió moderat, és difícil de reprimir El promotor tac és molt més fort (s’utilitza quan es vol obtenir molta proteïna), però no es troba absolutament reprimit. Segons els nostres interessos, en farem servir un o un altre.
- Regulació de l’expressió gènica en eucariotes: En els procariotes els promotors són accessibles a les RNA polimerases, però en eucariotes és justament al revés. L’organització en pluricel·lulars és amb cèl·lules que tenen la mateixa informació genètica i s’han de coordinar. Els gens s’agrupen i es combinen a l’hora de ser regulats i a més s’agrupen en dos dominis: o o Inici vida, poc empaquetat i elevada expressió gènica Vida adulta, s’empaqueta Hi ha quatre característiques principals de la regulació de l’expressió gènica: - - Normalment l’expressió dels gens eucariotes està reprimida  sol ser per l’empaquetament i aquest és clau per la regulació. Només un 30% del material genètic està disponible.
L’accés als promotors eucariotes està restringit per l’estructura de la cromatina: els promotors es troben amagats en l’estructura de la cromatina Majoritàriament es necessiten mecanismes de regulació que es basen en un augment del nivell d’expressió dels gens Hi ha diferents elements reguladors, en cis (seqüencies que regulen l’expressió del gen, dins del mateix genoma, referent a DNA) i en trans (repressors que reconeixen els elements en cis; proteïnes d’unió al DNA, referent a proteïnes), que interactuen entre ells La regulació de l’expressió gènica en eucariotes està restringida perquè està sintetitzant repressors contínuament, és més fàcil tenir-los amagats en l’estructura de 16 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) la cromatina (estalvi per la cèl·lula). Els genomes eucariotes són molt grans, per tant, si tots els promotors fossin accessibles, seria possible que alguns gens s’activessin quan no toca (només quan és necessari es deixen accessibles).
Hi ha una regulació de l’expressió gènica coordinada entre els diferents teixits. Entre una eruga i una papallona, el genoma és el mateix, però els gens que s’expressen en els dos casos són completament diferents.
Elements en cis: seqüències de DNA que regulen la transcripció Els elements en cis que es troben són de tres tipus: - - - Promotors: són reconeguts per la RNA pol gràcies al complex de transcripció basal. Els eucariotes són molt diferents dels procariotes; contenen caixa TATA, equivalent a la regió -10 dels promotors procariotes i també poden contenir caixes CAAR i poden contenir caixes GC. No hi ha una seqüència consens, hi ha proteïnes que no tenen GC, etc., però la majoria tenen caixes TATA. Aquest és reconegut per la RNA polimerasa II, que és la que transcriu els mRNA.
Activadors o enhancers: són reconeguts per certes proteïnes i augmenten la taxa de transcripció. Seqüències reconegudes per determinades proteïnes i incrementen la taxa de transcripció d’un determinat promotor.
Silenciadors o repressors: són reconeguts per determinades proteïnes i disminueixen la taxa de transcripció.
Tant els activadors com els silenciadors/repressors és normal trobar-los molt lluny dels promotors que estan regulant. Fins a 50kb o en cromosomes diferents. Regulació més complexa.
Tots aquests (promotors, activadors i silenciadors) són reconeguts pels elements en trans.
Elements en trans: factors de transcripció basal o o o La RNA polimerasa és incapaç de reconèixer per sí mateixa el promotor.
Una sèrie de proteines reconeixen el promotor i capten la RNA polimerasa. Factors de transcripció basal.
Són necessaris per a la transcripció basal però no poden canviar la velocitat de la transcripció.
17 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Es necessita un sistema de proteines que aguanti la doble cadena i l’obri perquè in vivo és un procés molt poc estable.
Tots ells són reconeguts pel elements en trans: - Coactivadors → Capturen la RNA polimerasa (interacció molt forta i ho fan amb el coactivador) i la fan interaccionar amb el complex de transcripció basal.
→ Com a resultat augmenta la freqüència de transcripció.
Són proteïnes que regulen l’expressió gènica sense unir-se al DNA. S’uneixen entre les proteïnes. Aquestes poden ser proteïnes captades per mediadors, d’unió a les cues d’histones o mediadors (que estabilitzen la unió entre el complex basal i la RNA polimerasa. Fan augmentar la velocitat de la transcripció).
A eucariotes la RNA polimerasa II per si sola no és capaç de reconèixer les regions promotores, sinó que necessita un conjunt de factors de transcripció, que s’anomena complex basal de la transcripció. Aquest està format per diferents factors de transcripció: TBP, TFIIB, TFIIF, TFIIE i TFIIH, els quals interaccionen entre si i permeten que la RNA polimerasa pugui ancorar-se a la regió promotora. Si no hi ha la participació d’aquests factors de transcripció basal i es forma el complex basal, la RNA polimerasa per si sola no reconeixerà els promotors. Un cop format aquest complex basal, comença la transcripció, però aquesta és relativament lenta i els gens no es poden transcriure a poc a poc. Per tant, perquè aquesta RNA polimerasa pugui incrementar la taxa de transcripció es necessiten altres elements, que són els que reconeixeran les seqüències en cis. Altres proteïnes que ajuden a què la taxa de transcripció s’incrementi un cop format el complex basal són els co-activadors, que ancoren fortament la RNA polimerasa amb el complex de transcripció basal i això fa que la RNA polimerasa incrementi significativament la velocitat i la taxa de la transcripció del gen es vegi afectada.
- Transactivadors: és una proteïna que canvia la freqüència de transcripció unintse al DNA. Entren a través del solc gran del DNA.
Proteïnes amb dos dominis diferenciats: o o Domini d’unió a DNA: (s’uneix a enhancers) conté motius estructurals i reconeixen una seqüència intensificadora i, gràcies a l’altre domini del transactivador, permet promoure una activació de la transcripció en un gen concret.
Domini d’activació de la transcripció: (activa la transcripció) 18 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Un exemple són els repressors, que són transactivadors que s’uneixen a una regió silenciadora i baixen la taxa de transcripció.
MANERES D’ACTIVAR LA TRANSCRIPCIÓ: consisteix en fer el DNA més accessible per la transcripció gràcies a enzims que modifiquen les cues de les histones. Canvia la composició del DNA.
Remodelació de la cromatina: interactuen el cis amb el trans. Hi ha coactivadors que s’uniran a les cues de les histones però només quan aquestes presentin certes modificacions.
Dues classes de proteïnes que poden fer aquesta remodelació: - Acetilases (HAT): o Introdueixen grups acetil en les Lys de N-terminal histones (reversible) o Canvi de càrrega: canvi conformacional o Desempaquetament a eucromatina (dels nucleosomes): els promotors més accessibles Afegeixen grups acetils a les lisines de N-terminal histones. Aquestes cues que marquen el pas de rosca són modificades. Si modifico químicament aquest aminoàcid d’aquestes histones canvio la càrrega i indueixo un canvi conformacional en l’estructura de la proteïna i es desempaqueta la cromatina i passem de heterocromatina a eucromatina, els promotors queden més accessibles i aquesta acetilació és reversibles. Igual que hi ha histones acetilases també hi ha histones desacetilases (s’elimina el grup acetil d’aquestes cues d’aquestes histones i la cromatina es reverteix un altre cop a la forma compacta).
- A banda d’aquestes modificacions de les histones com metilacions, acetilacions...
hi ha un altre grup de proteïnes anomenat complexes de remodelació de nucleosomes  requereixen ATP i alteren la posició dels nucleosomes (es mouen) en unir-s’hi permetent un major accés al promotor. Els nucleosomes interaccionen amb l’heterocromatina (la que no és funcional). El DNA no s’empaqueta bé. Determinats elements en cis queden exposats a elements en trans. Tot el que fan aquestes proteïnes és alterar la posició dels nucleosomes.
Quan alterem l’estructura de la cromatina que està estructurada en forma de nucleosomes no és una estructura estàtica. NO està envolcallat interaccionant exactament amb el mateix fragment de DNA. Necessitem aport d’energia. Hidròlisi d’ATP. En alguns casos fan lliscar les proteïnes i vaig canviant el fragment d’ADN que envolcalla els nucleosomes i deixo accessible la zona del promotor. Faig lliscar la part més proteica sobre la cadena de DNA. Altre possibilitat és fer saltar les histones. Alguns casos canvio la composició de les histones. El resultat, sigui el mecanisme que sigui que facin servir els complexos de remodelació dels 19 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) nucleosomes és mirar de deixar accessible les regions del nucleosoma o cromatina on estan amagades les seqüències de promotors.
Aquests processos són reversibles, per exemple hi ha histones desacetilases. La remodelació de la cromatina es fa per passar a eucromatina (forma menys condensada que deixa accessible els promotors).
Relacionar això amb elements amb cis i elements en trans. Passar de heterocromatina a eucromatina (Activa). A la imatge a tenim la cromatina no activa i un domini d’activació que atrau complexos reguladors de nucleosomes o acetilases: Tenim una estructura de cromatina que vol ser empaquetada, eucromatina. La part vermella és un promotor amagat a l’estructura de la cromatina. Més endavant tenim una regió transactivadora amb un domini de RNA i un domini d’activació. El domini d’unió al DNA reconeixeria la seqüència d’un intensificador mitjançant una atracció d’una histona acetilasa, s’ancora l’enzim a la zona acetilasa i es canvia la conformació de la cromatina i es desempaqueta. L’acetilació d’histones provoca un canvi de càrrega.
A la imatge b tenim heterocromatina i l’activador canvia la posició dels nucleosomes i es podrà transcriure el gen que controli aquella funció.
A banda de poder activar la transcripció mitjançant histones acetilases o complexos modeladors de nucleosomes és captant coactivadors  ajuden a fixar la RNA polimerasa al complex basal i incrementar la transcripció. Elements en trans, són proteïnes necessàries perquè la RNA polimerasa reconegui amb més afinitat el promotor (augmentarà la velocitat del procés). També poden interaccionar amb el complex basal. Pot interaccionar amb trans-activadors transmetent la informació de la regió intensificadora que està molt allunyada del promotor (domini d’activació). El DNA s’ha de doblegar perquè s’han d’acostar regions del genoma molt allunyades, s’acosten regions allunyades a la zona dels promotors.
20 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) La regió codificant és la zona que interessa desempaquetar.
Poden fer de col·lectors de senyals, intensificadors o silenciadors allunyades respecte del punt on tinc la regió promotora. Al mateix temps, aquest coactivador pot estar allunyada de la sequencia promotora. Rep senyals de transactivador, Transactivador reconeix les sequencies intensificadores i el domini de unió al DNA interacciona amb això. Interacciona amb el coactivador, transmet canvis conformacionals i la taxa de transcripció incrementa perquè esta interaccionant amb un transactivador. Funciona també per silenciadors.
De la mateixa manera que el coactivador fa de col·lector de senyals positives pot rebre senyals de silenciadors. En aquest cas el domini d’unió del DNA s’uneix al transactivador i el domini d’activació de transcripció s’uneix al coactivador.
Intensificador reconegut pel transactivador i aniria a parar al coactivador.
De vegades hi ha silenciadors i la seqüència de DNA se solapa amb la seqüència de l’intensificador o activador. El silenciador és reconegut per un repressor, per una proteïna i impedeix que el que m’està bloquejant l’intensificador impedeix la unió del meu transactivador. És una altre manera d’actuar. El silenciador transcriu per la proteïna P que inhibeix l’entrada de la proteïna que reconeix la zona activadora.
PROTEINES HMG: permeten acostar elements en cis que es troben molt llunyans.
Apropen les regions allunyades a les regions codificants. Permet adoptar l’estructura corba del DNA (promou el replegament). Fan una relocalització nuclear.
21 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Regió promotora i molt allunyada a la seqüència tenim intensificadors i silenciadors. Hi ha proteïnes que interaccionen amb els senyals i aquests amb coactivadors... si està molt allunyat a la seqüència malgrat que estiguin lluny de la posició del promotor es poden acostar perquè aquest DNA es pot corbat. Necessito la participació d’un grup de proteïnes anomenades HMG (alta mobilitat). Què fan?  Interaccionen amb l’estructura del DNA i permet que pugui adquirir aquestes corbatures.
Com està corbat permet que el transactivador pugui tocar al coactivador i arribi al complex basal i transmetre la informació de les seqüències. Perquè intensificadors i silenciadors puguin arribar a influir al promotor d’un gen necessiten la interacció d’aquestes proteïnes.
Apropa seqüències activadores i silenciadores al promotor, fent que altres gens s’allunyin i s’acosten a les seqüències. Les proteines HMG determinen l’estructura del DNA per tal que l’apropament es dugui a terme.
RELACIÓ ENTRE EXPRESSIÓ GÈNICA I TRANSDUCCIÓ DEL SENYAL: els missatgers secundaris provoquen un canvi al·lostèric en els transactivadors permetent que realitzin la seva funció  ho poden fer les hormones. Aquestes s’uneixen a un domini provocant canvis conformacionals i fent que siguin més actius.
Per últim, hi ha una regulació coordinada a teixits diferents  CASCADA DE TRANSDUCCIÓ DEL SENYAL. Utilitzen molècules que intercanvien informació i marquen una senyalització sobre l’expressió gènica. Això és el mateix que dir que hi ha una regulació o relació entre l’expressió gènica i cascades de transducció del senyal. Aquestes cascades, en una cèl·lula tenim una proteïna que fa de receptor, aquest li arriba per la via que sigui una altre proteïna o lligand que normalment s’anomena missatger primari i la unió d’aquest missatger amb el receptor provoca canvis conformacionals al receptor es tradueixen en canvis interns de la proteïna i molts cops en la síntesi de missatger secundari. Aquest, mitjançant una cascada de transducció de senyal, activa factors de transcripció o de vegades transactivadors.
Aquest és el cas d’un missatger primari que no pot travessar la membrana. Fa canviar la expressió gènica.
Una hormona esteroide viatja per la sang, és un lípid i aquest missatger primari pot entrar dins la cèl·lula mitjançant un transactivador que té un domini d’activació i un 22 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) domini d’unió a DNA, però aquest transactivador no és actiu perquè adopta una estructura com a resultat de la seva interacció amb una proteïna inhibidora de la unió al DNA.  Interacció de la hormona amb òrgans diana, creuen la membrana plasmàtica.  Aquest transactivador presenta un lloc d’unió al transcrit primari i quan s’uneix la hormona al transactivador i la proteïna inhibidora no pot interaccionar més amb el transactivador perquè hi ha un canvi conformacional. El domini d’unió a DNA ara està disponible per unir-se al DNA. Regulem l’expressió gènica mitjançant la síntesi d’una hormona que està sent sintetitzat a una altre regió.
23 ...

Tags:
Comprar Previsualizar