Exercici 5 (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 4º curso
Asignatura Enginyeria de proteïnes
Año del apunte 2016
Páginas 2
Fecha de subida 25/09/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

19/10/2016 No preguntarà comandaments. Hem de saber quin server fer servir per trobar cadascuna de les coses.
Com saber quins són els residus més involucrats en l’estabilitat proteica? EXERCICI 5 Volem disminuir la temperatura òptima de la lipasa 1f6w, que és un mesòfil  no hi hauria despesa energètica i la roba es conservaria millor. Haurem de fer 10 mutacions i veure que la proteïna final és més inestable que la de partida.
∆E = Emutant - Enativa Ara ens interessa que l’energia de la nativa sigui major que l’energia de la mutant  interessa que el valor de la diferència d’energia sigui el més positiu possible.
No volem que la proteïna es desnaturalitzi, de forma que haurem d’anar en compte de no fer canvis en llocs que impliquin la desnaturalització de la proteïna (l’hem de fer més flexible, no inestable).
El que hem aleshores és una llista on ordenem els residus de l’energia més alta a la més baixa.
Els residus àcids i bàsics no s’han de canviar sense fer observacions abans: si un aspàrtic està a l’interior de la proteïna fent un pont salí amb un altre residu, possiblement surti dels primers en la llista ja que està molt involucrat en l’estabilitat, però si eliminem aquest aspàrtic, l’altre residu que estava formant el pont salí amb l’aspàrtic quedarà sense partner de pont salí. Si fem això, estaríem generant un factor important d’inestabilitat  si deixem sense company un residu que està formant un pont salí a l’interior de la proteïna. Els residus àcids o bàsics que ens surten en l’interior de la proteïna, s’haurien de modificar com a parelles, ja que mutar únicament un podria generar problemes  s’ha de tenir molt present que si participen en un pont salí, canviar-los pot ser contraproduent.
Si una posició la canviem per un triptòfan i la diferència d’energia entre el mutant i la proteïna nativa és molt positiva. Aquesta substitució podria generar problemes perquè pot ser que estiguem posant un residu molt gran on abans hi havia un petit, el que implicaria un gran canvi en l’estabilitat de la proteïna.
Els residus que són hidrofòbics i grans (triptòfan i fenilalanina), per canviar aquests, es recomana que es canviïn per hidrofòbics més petits (així no es generen problemes d’inestabilitat, sinó que estem empitjorant la termostabilitat de l’enzim), per a fer-ho, a l’hora de posar el script no hauríem de fer el canvi per tots els aminoàcids, que és “a”, sinó que hem de posar una “h”, per a que sol agafi els hidrofòbics. La tirosina també és un aminoàcid voluminós, la histidina també però està carregada.
Està prohibit posar glicines perquè una glicina pot anar a parar al mig d’una hèlix i desnaturalitzar la proteïna.
Canvis que disminueixin la termostabilitat però que no desnaturalitzin la proteïna.
Canviar residus aromàtics per residus hidrofòbics i més petits. S’ha de tenir en compte que els residus aromàtics no formin part d’un enllaç catió-pi. Cal no considerar com a candidats aquells que participin en una interacció catió-pi (buscar en el servidor CAPTURE i descartar-los en cas que surtin). També s’ha de tenir en compte que aquests residus no estiguin en el centre actiu, ja que no volem canviar la funció, sinó que volem que es mantingui constant. També s’ha de comprovar visualment que els residus candidats a ser mutats no estan properes al lligand  no volem canviar l’afinitat pel lligand. El que volem canviar és la temperatura òptima amunt o avall en funció del que ens interessi.
També es consideren com a vàlids alguns residus de leucina o isoleucina, que es poden canviar per residus hidrofòbics més petits.
Totes les mutacions que s’afegeixen han de ser més petits  perquè si són més grans, l’augment de la inestabilitat pot ser degut a que la proteïna s’ha desnaturalitzat.
Molts cops els càlculs més acurats ens indiquen que els residus que podien ser candidats segons el alanin-scanning han de ser descartats perquè el canvi en el valor és molt diferent.
...

Comprar Previsualizar