Seminari I: tècniques bàsiques de biologia molecular. (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Profesor D.S.
Año del apunte 2017
Páginas 5
Fecha de subida 04/11/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Seminari I: tècniques bàsiques de BIOLOGIA MOLECULAR Tècniques bàsiques: clonació de fragments de DNA  La tecnologia del DNA recombinant permet modificar, introduir, expressar i amplificar el DNA en cèl·lules vives.
 Clonar un DNA implica: 1. Obtenir quantitat suficient del DNA.
2. Disposar d’un DNA vehicle (vectors de clonació).
3. Tallar el DNA i el vector en seqüències específiques (endonucleases de restricció= enzims de restricció).
4. Unir covalentment (lligació) el DNA al vector per a construir el DNA recombinant.
5. Introduir el DNA recombinant en cèl·lules hostes (bacteris, llevats, cèl·lules eucariotes en cultiu). És a dir, transformar cèl·lules vives amb el DNA recombinant.
6. Cultivar les cèl·lules, i identificar i seleccionar les que han incorporat les molècules del DNA recombinant, és a dir, les transformades.
7. Al créixer les cèl·lules transformades, el DNA recombinant s’amplifica: s’obtenen milions de còpies idèntiques del DNA recombinant.
(Llibre STRYER):  Enzims de restricció/endonucleases de restricció: reconeixen seqüències especifiques en el DNA de doble hèlix (dos cadenes) i tallen les cadenes per llocs concrets.
 Construcció d’un nou fragment de DNA: ens interessa perquè les noves recombinacions del DNA recombinant ens permet la construcció de nous gens no relacionats. Aquestes noves recombinacions es poden clonar (amplificar moltes vegades) mitjançant la seva inserció a cèl·lules adequades on seran replicades per la maquinaria de síntesis del DNA de l’hoste. Aquests gens insertats normalment es transcriuen al i tradueixen en el seu nou entorn. Es pot dissenyar un canvi permanent en el legat genètic de l’hoste.
 Procediment: un fragment de DNA s’uneix covalentment a un DNA vector. Ens interessa que aquest vector es pugui replicar de forma autònoma en l’organisme de l’hoste. Per exemple, per a la clonació de E.coli fem servir plasmidis (apareixen de forma natura com cercles de DNA que actuen com cromosomes accessoris) i el fago (un virus).
 Preparació del vector: es pot preparar mitjançant un tall per un enzim de restricció en un sol punt molt específic. Per exemple l’enzim de restricció EcoRI pot tallar en un únic lloc al plasmidi (pSC101: molècula de DNA de doble hèlix). Aquest tall genera extrems complementaris d’una sola hebra que tenen una afinitat especifica entre si i per tant s’anomenen extrems cohesius. Qualsevol fragment de DNA que tingui els mateixos extrems cohesius podrà insertar-se a aquest plasmidi. Es pot tallar la cadena de DNA amb el mateix enzim de restricció que hem fet servir pel plasmidi.
 DNA lligasa: fragment de DNA i plasmidi s’uneixen, i es connecten per l’acció de la DNA lligasa. Formació d’un enllaç fosfodièster entre les dos cadenes. La DNA ha de tenir un grup OH lliure a l’extrem 3’ i un grup fosfat en l’extrem 5’.
 Extrems cohesius: es poden formar per adició i ruptura d’un adaptador linker.
 Crec que “Plasmidi entra a bacteri i allà es replica, produint canvis”.
Aplicacions de les tecnologies del DNA recombinant.
 S’han clonat molts gens d’interès terapèutic: insulina, intèrfons, factors de coagulació, anticossos, hormones de creixement.
 Obtenció d’enzims de interès en la indústria química i alimentària.
 Depuració d’aigua residuals amb bacteris modificats genèticament.
 Diagnòstic de malalties hereditàries i, en un futur, el seu tractament (teràpia gènica).
Enzims utilitzats en la tecnologia del DNA recombinant  DNA polimerasa: fan copies de DNA/RNA a partir d’un motlle.
 Nucleases: són els enzims que tallen. Poden ser endo (fan talls interns a la cadena) o exo (fan el tall pels extrems)  Lligases: són les que lliguen els fragments de DNA.
 Polinucleòtid quinasa: afegeixen fosfats  Fosfatasa alcalina: hidrolitza el fosfat Enzims de restricció.
Endonucleases: són enzims de restricció.
 Tipus II: tallen el DNA dins la seqüencia de reconeixement. No necessiten ATP.
 Reconeixen seqüencies completes de DNA i tallen la doble cadena.
 Hidrolitzen els enllaços fosfodièster i generen un grup hidroxil a l’extrem 3’ i un grup fosfat a l’extrem 5’ del tall.
 Estructures de 4 a 8 bases.
 Reconeixen seqüències de palíndrom  Sempre tallen en doble cadena. Sempre es fa pel mateix nucleòtid (del palíndrom).
 Els enzims de restricció reconeixen seqüències palindròmiques  En el DNA és una repetició invertida a la cadena complementària.
Nomenclatura: En funció de l’organisme hoste (Eco), la soca (R) i l’ordre d’aïllament en una mateixa espècie bacteriana en números romans (I, II, III...)    *: bases metilades: serveixen de senyal per a l’enzim de restricció.
ECO IV: extrems plans, no sobresurten els nucleòtids: pla.
TTH: talla amb nucleòtids que són N (significa que pot ser qualsevol base).
En funció del tall es podran unir o no. Poden quedar com a protuberant/cohesius o roms/pla:  Si tallen cada cadena per punts diferents generen extrems cohesius; en els extrems generats algunes bases queden desaparellades.
 La protuberància pot sobresortir per l’extrem 5’ o per l’extrem 3’.
 Si tallen pel mateix punt les dues cadenes, generen extrems roms o plans; en els extrems generats totes les bases queden aparellades.
Només quan tallen pel mateix punt parlem d’extrem rom/pla.
Els enzims de restricció treballen a 37ºC, a pH fisiològic en presència de cations divalents de magnesi com a cofactor.
DNA + enzim de restricció= DIGESTIÓ.
DNA LLIGASA  Forma pont entre 2 cadenes de DNA.
 Els extrems han de ser complementaris, lliga molt bé els extrems protuberants. Sempre lliga molt bé els extrems tallats pel mateix enzim .
 També és útil en enzims tallats per diferents enzims. Es poden lligar enzims diferents sempre que siguin compatibles.
 Enzim que genera enllaços fosfodièster entre els extrems 3’-hidroxil lliures i els extrems 5’-fosfat en una cadena de DNA, sempre que pertanyi a una doble cadena. No lliga els extrems d’una cadena senzilla.
 La reacció utilitza energia (l’ATP en eucariotes, el coenzim NAD+ en bacteris).
 “Fer una lligació” = incubar fragments de DNA amb l’enzim lligasa, per a generar enllaços fosfodièster i unir els fragments.
 (extrems cohesius, protuberants) Són lligacions més eficients que les dels extrems roms, perquè estan afavorides per la prèvia formació dels ponts d’hidrogen entre les bases complementàries dels extrems.
 (lligació d’extrems roms). Sempre són compatibles i es pot produir la unió. No són tan eficients com la dels extrems protuberants.
 Una vegada s’uneixen, es regenera la diana que servirà per als enzims de restricció. La diana es conserva ja que a lo millor ens interessa tornar a tallar. També pot passar que al reunir-se la diana no es recuperi, això significa que no es podran tornar a tallar MAI.
Conèixer si les dianes de restricció es regeneren al lligar els DNAs permet saber si es pot tornar a utilitzar un determinat enzim de restricció per a tallar altre cop aquell DNA.
DNA-polimerasa  L’enzim que necessitem per a tornar a formar la cadena de DNA (doble). És necessari un oligonucleòtid que fa d’encebador (com un motlle per a que comenci la cadena).
 També és fa a partir d’un fragment d’RNA amb un grup hidroxil-3-lliure que actua com a encebador. (in vitro)  Polimerasa: agafa el nucleòtid complementari, l’incorpora i forma un enllaç/pont fosfodièster.
Sempre s’allarga en direcció 3’-5’  L’objectiu és anar allargant la cadena. Les parts que necessitem és un model, l’encebador, una desoxi (dATP , dGTP, dCTP , dTTP) , i magnesi.
 Fragment klenow: serveix per ampliar o tallar. És un fragment gran que conserva l’activitat polimerasa i exonucleasa 3’ a 5’.
DNA polimerasa I d’E. coli  És un enzim multifuncional. També és monomèrica i té tres dominis amb diferents activitats enzimàtiques (exonucleasa, exonucleasa i polimerasa). Presenta diverses funcions:  DNA-polimerasa.
 Exonucleasa 3’ a 5’: trenca enllaços fosfodièsters a partir dels extrems 3’ hidroxils lliures quan detecta que l’últim nucleòtid incorporat no és complementari del motlle)és una activitat que corregeix els errors de la polimerasa abans de seguir polimeritzant: activitat correctora de proves o errors.
 Exonucleasa de 5’ a 3’: trenca enllaços fosfodièster a partir dels extrems 5’ fosfats lliures, per eliminar uns pocs nucleòtids. La funció principal “in vivo” és eliminar els encebadors d’RNA utilitzats en la replicació. També corregeix lesions en el DNA.
Té una gran fidelitat i gairebé no comet errors gràcies a l’activitat correctora. Pot copiar cadenes in vitro amb la finalitat de marcar-les, amplificar-les o seqüenciar-les. S’utilitza freqüentment el fragment Klenow de la DNA polimerasa I.
TRANSCRIPTASA INVERSA (TR)  Formació de DNA (bicatenari) a partir d’una cadena de RNA.
 És forma un copia. El DNA sintetitzat és una còpia complementària de l’RNA motlle, i es denomina cDNA (DNA còpia).
 És útil per a la clonació de la seqüència codificant dels gens eucariotes que està present de forma lineal en l’RNA.
ALTRES ENZIMS: Fosfatases: (CIP) treuen fosfats (els hidroliten). Extrem 5’. S’utilitzen per a evitar que els extrems del vector de clonació es lliguin entre sí i facilitar la lligació entre el vector i el fragment que es vol inserir.
Quinases: afegeixen fosfats (com a mètode de marcació/senyalització). Extrem 5’-hidroxil lliure.
...

Tags:
Comprar Previsualizar