Investigación en proteínas (2015)

Resumen Español
Universidad Universidad de Valencia (UV)
Grado Bioquímica y Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Estructura de macromoléculas
Año del apunte 2015
Páginas 5
Fecha de subida 20/03/2016
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T-6: INVESTIGACIÓN EN PRÓTEINAS Hay un enorme numero de macromoléculas presentes en un extracto celular por lo que hace falta separar la poteína de interés con eficiencia, rapidez, cantidad y pureza necesarias manteniendo la actividad biológica y la integridad química de esta. Hay que tener en cuenta que en cada paso de purificación se pierde una parte de la proteína de interés. Hay que encontrar el equilibrio entre el grado de purificación y el número de pasos que se hacen.
Propiedades que se pueden usar para la purificación: Tamaño Carga (densidad) Hidrofobicidad Densidad Asociación reversible Secuencia o estructura específica (epítopos) Etiquetas de afinidad (expresión en sistemas heterólogos) Preliminares Métodos de separación Forma Punto isoeléctrico Solubilidad Unión de ligandos y metales Modificaciones postraduccionales Propiedades inusuales Precipitación: ácida, salina, polímeros, disolventes orgánicos… Diálisis para separar el precipitado.
Polishing: Cromatografía (filtración, interacc. Hidrofóbica, intercambio de iones, por afinidad, fase reversa), electroforesis, centrifugación PRODUCCIÓN DE PROTEINAS RECOMBINANTES La expresión de una proteína foránea en sistemas heterólogos tiene 2 ventajas: -Permite la sobreexpresión de la proteína de interés.
-Permite el etiquetado para hacer purificación por afinidad (cromatografía por afinidad, 1 paso, +eficaz).
Se introduce un plásmido con el gen foráneo en una bacteria. Se verifica (con antibióticos) si la bacteria transformante ha incorporado el gen a su genoma. Se cultivan colonias de estas bacterias que expresarán la proteína estudiada (entre otras aunque se puede hacer que la célula exprese la proteína de interés preferentemente). Se realiza la extracción y se centrifuga para separar la proteína.
Además, se puede etiquetar la proteína de interés añadiendo una secuencia que sea fácil de purificar para realizar una purificación específica para esta.
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN Se rompe la célula y se purifica con cromatografía por afinidad: separa las proteínas etiquetadas (verdes con naranja) de las que no lo están.
GST-fusions La Glutatión-S-Transferasa es una proteína endógena de procariotas (se encuentra en las bacterias por lo que no las reconocen como extrañas).
El ribosoma sintetiza la proteína de interés junto a la GST a modo de etiqueta. Tiene 220 aa y se puede unir en el extremo N –terminal o C-terminal indistintamente. Se usa por su pequeño tamaño y gran estabilidad.
Tiene afinidad por el glutatión por lo que, para la purificación, se pasan las proteínas por resinas cromatográficas con glutatión de modo que sólo las etiquetadas con GST se quedan unidas a estas resinas. Luego se separa la GST de la proteína de interés mediante ribonucleasas específicas.
Colas de Histidina Se añaden pequeñas colas de 6aa de histidina en cualquier parte de la proteína. Varias His seguidas se pueden coordinar con cationes divalentes Se pasan las proteínas con las colas de His por resinas que tienen cationes divalentes a los que se quedan unidas. Ventajas: -No influyen en la estructura ni función de las proteínas; no hace falta eliminarlas.
-Permite purificaciones en grandes cantidades.
-Son fáciles de construir (mediante mutagénesis dirigida).
-Hay anticuerpos contra las colas de histidinase puede detectar la proteína con estos y no unos específicos para esa proteína.
SISTEMAS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES -Procariotas: E.coli… *No se pueden añadir modificaciones postraduccionales ya que la proteína no se dobla bien.
-Eucariotas: levaduras (S. cerevisiae…), células de insecto, células de mamíferos -Sistemas in vitro.
PROTEÓMICA Proteoma: conjunto de proteínas codificadas por un genoma.
Proteómica: estudia el conjunto de proteínas que intervienen en cierta acción.
-Identificación de todas las proteínas sintetizadas por una célula, tejido u organismo.
-Determinación de las interacciones de estas proteínas para formar redes.
-Resolución estructural de todas las proteínas que conforman el genoma.
PROTEOMAS COMPLEJOS A partir de las secuencias de genomas no se puede saber qué proteínas vas a tener disponible.
Hay distintos procesos de regulación, para una secuencia de DNA puedes obtener varias proteínas.
-A partir del mismo gen se pueden fabricar varias proteínas.
-Las proteínas tienen naturaleza variable y frágil.
-Cambios cualitativos y cuantitativos en el proteoma.
-Estudios funcionales y estructurales del proteoma.
Al secuenciar el genoma humano, se vio que la cantidad de genes era menor a la esperada para la cantidad de proteínas que tenemos (por splicing alternativo).
PROCESO DE IDENTIFICACIÓN 1) Electroforesis 2D: separa las proteínas de la que se quiere estudiar según tamaño o punto isoeléctrico. Luego se corta en fragmentos de 6-12 aa para realizar… 2) Espectrometría de masas: permite calcular con detalle el peso molecular de la proteínapermite saber la secuencia de aa.
3) Bases de datos: para comparar la secuencia obtenida con otras existentes.
Electroforesis bidimensional 1) Isoenfoque: separa las proteínas según punto isoeléctrico.
2) SDS-PAGE: separa por masa molecular. Las proteínas se tiñen con: - Azul de Coomassie: senzillo, económico y compatible con EM.
Sensibilidad de 36-45ng/mancha sólo tiñe las mayoritarias, el resto se tiene que teñir con: -Tinción con plata: más sensible, compatible con EM pero más caro y difícil.
-Marcadores fluorescentes: marcaje sencillo y rápido, caro y muy sensible pero no compatible con EM aunque permite identificar proteínas sin usarla.
3) Análisis de imagen: se compara la muestra con el control para encontrar diferencias.
Un programa informático evalúa la intensidad de las manchas y calcula la concentración a partir de eso. Hay que tener en cuenta en la preparación de la muestra: -Buena solubilización: para que se vean.
-Buena desnaturalización: para que sólo dependa del tamaño y no de la forma.
-Reducción de puentes disulfuro por el mismo motivo y porque luego se troceará la proteína y 2 regiones lejanas pueden quedar unidas.
Espectrometría de masas  Preparación de la muestra: Se corta el trozo de gel donde está la proteína de interés (spot removal manual o robotizado), se modifican sus residuos de Cys y se realiza la digestión in-gel: deshitratación y rehidratación del gel en presencia de proteasas específicas como la tripsina.
 Ionización de la muestra -Electrospray (ESI): se pone la muestra a pH ácido (aa con carga+) y se nebuliza. Se forman gotas muy pequeñas que explotan por repelencia de cargas+. En el tubo de vacío estará la misma proteína (volatilizada) con distintas densidades de carga, las que tengan mayor densidad llegarán antes al detector. Se crean gráficas de las que se deduce la masa de la proteína.
-MALDI: se cristalizan los componentes del gel (contiene las proteínas) en una matriz física, esta se deshidrata y se utiliza la energía de un láser pulsante para volatilizar las proteínas que quedan cargadas+ (pH ácido de matriz) y la que tenga mayor densidad de carga llegará antes al detector.
Identificación -Degradación de Edman: después de la electroforesis (sin EM). Se analiza qué aa hay en el extremo N-terminal (corta el primero) y haciendo esto repetidas veces se puede averiguar qué proteína es porque todas suelen tener los 6-12 primeros aa distintos.
Problema: hace falta mucha cantidad de proteína. No se suele usar.
-Fingerprint peptídico: En las bases de datos se busca el organismo del que hemos obtenido la proteína, un programa corta la secuencia de la proteína que creemos que es la nuestra por donde lo haría la tripsina y se obtienen los espectros. Estos se comparan con los de la proteína problema para ver si hay muchas coincidencias.
-Por por MS/MS: permite la secuenciación. Primero se hace una espectrometría de masas, Limitaciones para la identificación Electroforesis 2D: se necesita solubilizar la muestra, es poco reproducible, la sensibilidad debida a las tinciones y el poco poder de resolución.
Degradación de Edman: poca eficacia química.
Espectrometría de Masas: posible reacciones laterales entre aa, formación de agregados, extracción desigual de los péptidos de los geles para el fingerprint, en MALDI el bombardeo del laser puede producir fragmentos.
NECESIDAD DE CUANTIFICACIÓN Hay una gran cantidad de proteínas que desconocemos por ser poco abundantes pero estos pueden ser biomarcadores relevantes. Pequeños cambios en la regulación de las proteínas pueden provocar grandes cambios en el organismo. La cuantificación de la expresión diferencial de las proteínas requiere el marcaje fluorescente o isotópico de las muestras.
DETERMINACIÓN DE INTERACCIONES ENTRE PROTEÍNAS PARA FORMAR REDES Para ver como precipitan entre sí.
RESOLUCIÓN ESTRUCTURAL DE LAS PROTEÍNAS ...