Seqüenciació (2014)

Resumen Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura genètica molecular
Año del apunte 2014
Páginas 4
Fecha de subida 05/10/2014
Descargas 2
Subido por

Descripción

SEQÜENCIACIÓ PEL MÈTODE SANGER, SEQÜENCIACIÓ AUTOMÀTICA I SEQÜENCIACIÓ MASSIVA

Vista previa del texto

SEMINARI 3: SEQÜENCIACIÓ PEL AUTOMÀTICA I SEQÜENCIACIÓ MASSIVA MÈTODE SANGER, SEQÜENCIACIÓ L’any 1977 es van publicar independentment dos mètodes per a la seqüenciació de l’ADN: - Mètode químic, pels investigadors Maxam i Gilbert.
Mètode enzimàtic, per Fred Sanger (1918-2013).
Els dos van rebre per això el premi Nobel de Química l’any 1980. Els dos mètodes es basen en reaccions que es preparen “manualment”, i els resultats es “llegeixen” en gels d’electroforesis. A partir dels finals dels anys 80 es va posar a punt la seqüenciació automàtica del DNA, que es basa en una modificació del mètode de Sanger.
Fred Sanger Per tal de fer la síntesi d’ADN, necessitem que l’extrem C3’-OH de la cadena estigui lliure, d’aquesta manera podrem fer l’enllaç fosfodièster amb el C5’ d’un nucleòtid que s’afegeixi.
Si en comptes d’un nucleòtid normal, fem servir un desoxinucleòtid també desoxinucleat en el carboni 3’, l’anomenem ddNTP (didesoxi) i té un –H en comptes d’un –OH en el carboni 3’, aleshores NO podrem seguir afegint nucleòtids perquè no es podrà realitzar l’enllaç.
És a dir, podrem afegir-lo a la cadena que creix però aquesta no seguirà allargant-se desprès d’incorporar-se, és un terminador.
L’experiment de Sanger es basava en fer 4 reaccions en paral·lel, cadascuna d’elles tenia: una cadena motlle, un primer, ADN polimerasa i els quatre tipus de nucleòtids, un dels quals era en forma d’isòtrop ddNTP i estava marcat amb radiació (actualment els marquem amb fluorescència).
Les quatre reaccions en paral·lel tenien cadascun un dels nucleòtids marcats (A,T,G o C).
Si s’observa amb atenció el cas amb l’adenina marcada: Primer, s’eleva la temperatura (gairebé bullint, uns 94ºC) per tal de separar les dues cadenes motlle. Aleshores, al disminuir la temperatura (entre 55ºC i 37ºC) el primer s’afegeix a la cadena motlle i la polimerasa allarga la cadena. Però l’ADN polimerasa no distingeix entre nucleòtids i didesoxi. Per tant, cada vegada que n’incorporava un desoxi aquella cadena s’acabava, en aquest cas amb un ddATP.
Com que en l’experiment tenim milers de molècules fent de motllo i primer, la reacció d’elongació es dona paral·lelament molts cops i pot acabar -se en qualsevol posició on hi pertoqui una adenina. El resultat són cadenes d’ADN de diferents longituds on l’últim nucleòtid és una adenina marcada amb radiació. Passa el mateix amb els altres tres experiments, però s’hi marquen diferents nucleòtids (T,C i G).
Fem una electroforesis en cadascun dels tubs per tal d’observar-ne la posició amb gels desnaturalitzants.
L’ADN té càrrega negativa per tant migrarà cap al pol positiu, els fragments més curts migraran més que no pas els més llargs, es veuen amb llum radioactiva.
S’observen fragments de diferents mides d’un mateix nucleòtid.
La seqüència del gel es “llegeix” de baix a d’alt, ja que són les seqüències més petites.
Actualment: Seqüenciació Automàtica (1986) Es basa en el mateix principi, però en comptes de fer quatre reaccions paral·leles, posem els quatre tipus de nucleòtids en un mateix tub, tot i que n’hi ha uns quants de cada tipus que es troba marcat amb fluorescències diferents (actualment es fa amb fluorescència i no amb radiació).
Tornem a augmentar la temperatura per tal de separar les cadenes de l’ADN i al disminuir-ne la temperatura s’afegeixen el primer i l’ADN polimerasa. Actualment no cal disminuir tant la temperatura ja que hem descobert una polimerasa termostable del fons marí (60ºC).
Aleshores tornem a allargar diferents cadenes, aquesta ADN polimerasa també afegeix ddNTP, però igual que abans, les cadenes s’aturen en aquell punt.
Tenim desoxi i nucleòtids en una proporció equilibrada perquè els fragments no siguin sempre molt curts (que és el que passaria si afegíssim molts ddNTP) ni molt llargs (que és el que passaria si afegíssim pocs ddNTP).
Al tenir tantes molècules, les cadenes acaben a qualsevol posició i el resultat són moltes cadenes de diferents longituds, en aquest cas acaben amb diferents nucleòtids.
La reacció es transfereix des del tub a un gel desnaturalitzant i es fa una electroforesis, però en aquest cas d’un sol carril. El resultat s’analitza en una màquina que detecta la fluorescència. Cada tipus de didesoxi emet llum de diferent color, ja que té una longitud d’ona característica. El programa d’ordinador interpreta els resultats en un gràfic amb “pics” que interpreta cada lletra en la seqüència, s’anomena cloromatodrama, aquest interpreta el color groc en negre per tal de que es vegi millor. Els pics més a la dreta són els fragments més llargs.
S’ordenen els petits fragments del més curts al més llarg i així descobrim la seqüència.
Els primers sistemes automatitzats: tardaven 13 hores en fer l’electroforesi i solament llegien 8 seqüències d’uns 500 nucleòtids. Si volies que la seqüència fos més llarga havies de col·locar un primer just on acabava aquesta de 500.
Han realitzat certes reformes, i actualment l’electroforesi dura entre 20 min i 3 hores, però pot llegir 96 seqüències d’entre 400 i 900 nucleòtids i tenen un rendiment d’entre 691 i 2900 kilobases per dia.
La seqüència d’un humà té uns 3,2·10 9 parells de bases. Això va ser seqüenciat amb el sistema automatitzat més antic l’any 2001 (tres anys abans del que s’esperava).
Seqüenciació massiva: tecnologia “illumina”. Next generation sequencing (NGS).
Post-Automatitzat.
Utilitzant noves tecnologies aconseguim fer una seqüenciació massiva en paral·lel.
S’utilitzen nanotecnologies per tal de poder tenir en poca superfície milions de molècules clons (uns 150M). Cada fila pot ser també una família de molècules idèntiques diferents a la dels costats.
Existeixen uns “prats” d’oligonucleòtids curts enganxats sobre una superfície.
Primer s’ha de fragmentar l’ADN que volem seqüenciar, se’ls hi ha de “polir” la punta reparant-la i afegint-li una adenina.
Se’ls hi enganxa un oligo-adaptador a cada punta, aquest adaptador fa que aquests fragments seleccionats es pugin unir sobre els oligonucleòtids.
Aleshores el oligonucleòtid s’hibrida; inicialment era un “ganxo” per unir-se al fragment d’ADN i passa a ser un primer que permet que es sintetitzi la cadena complementària a la que està unida. En aquest punt tenim una doble cadena d’ADN, els extrems de les quals té uns adaptadors.
La cadena original marxa i solament queda la replicada, ja que totes han de ser d’una orientació i per això la mitat de fragments els perdrem . El fragment que esta sobre l’oligonucleòtid té també un adaptador a l’extrem oposat, per tant pot doblegar-se i col·locar-se al costat d’un altre oligonucleòtid per tornar-se a replicar. Així tots dos nucleòtids tindran un fragment, i repetint el procés repetides vegades, acabarem amb un “prat” de fragments.
Seqüenciació Iniciem la seqüenciació d’aquests fragments amb un primer universal. Lliures hi ha nucleòtids desoxi amb fluorescència (NO DIDESOXI).
Els nucleòtids desoxi són nucleòtids marcats una mica modificats, però no són terminadors.
Per tant, el procés comença amb la unió del primer nucleòtid que s’enganxa al primer, aquest és un desoxi marcat. La tècnica es basa en fer fotografies amb una màquina cada cop que s’uneix un (semblant a un cel d’estrelles de colors). Però la seqüenciació és molt ràpida, a més, si tots els nucleòtids seguissin marcats veuríem els colors anteriors, per això tenim aquests nucleòtids desoxi “especials”: són bloquejats de manera inversa.
...