Genética molecular 22 (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Complutense de Madrid (UCM)
Grado Medicina - 2º curso
Asignatura Genética Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 11
Fecha de subida 13/05/2017
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Tema 20. Ciclinas y ciclo celular El Ciclo celular está constituido por una secuencia de etapas que se suceden consecutivamente denominadas M (Mitosis) G1 (Gap 1) S (Síntesis de DNA) y G2 (Gap 2). A estas etapas habría que añadir la etapa denominada G0 (Gap 0) en que la célula paraliza su actividad proliferativa bien temporalmente, bien definitivamente.
La célula puede encontrarse en un estado proliferativo en el que el periodo G1 es breve. En ese caso, determinados estímulos extracelulares denominados agentes mitogénicos o mitógenos están en el origen de la proliferación de una célula normal. No para en el estado de quiescencia, pues sigue proliferando continuamente.
Los factores de crecimiento, como hemos visto en elecciones anteriores, son mitógenos que se unen a receptores específicos para activar determinadas “rutas proliferativas” que harán que la célula “progrese” a lo largo del ciclo celular.
Otras moléculas de origen natural o artificial son capaces de estimular la proliferación y lo hacen normalmente mediante la activación de alguna etapa de las “Rutas Proliferativas” o la inhibición de controles de la proliferación; son agentes mitogénicos.
Por el contrario los agentes inhibidores de la proliferación celular actúan normalmente mediante la inhibición de alguna etapa de las “Rutas Proliferativas”; son agentes antimitogénicos. Desde el punto de vista farmacológico pueden tener utilidad como antitumorales, siempre que desde el punto de vista clínico reúnan admeás una serie de características.
109 En cualquier caso, recordemos que la principal ruta proliferativa que utilizan los factores de crecimiento es la ruta MAPK1/2.
La proteína Kinasa ERK1/2 activa entra en el núcleo y allí fosforila diversas proteínas, algunas de las cuales son Factores de Transcripción (hemos visto el ejemplo de Elk 1/2).
Entre estos factores de transcripción se encuentra la oncoproteína c-myc; un factor de transcripción que puede regular la expresión de un gran número de genes. Se calcula que sobre un 15% de los genes humanos son regulados por Myc.
La Ruta de la MAPK permite la expresión secuencial de un importante número de genes que participan en el programa mitogénico.
Son más de 100 los genes llamados “early response genes” que permiten a la célula llegar al punto de restricción G1/S, y que son expresados tras un estímulo por un GF como por ejemplo EGF.
Entre estos genes se encuentran oncogenes humanos que son factores de transcripción como c-Fos, c-Jun y c- Myc.
P90RsK es una quinasa de la subunidad ribosomal pequeña, concretamente de la 6S. Las RSK son una familia que es fosforilada por ERK y acaban fosforilando por ejemplo a SRF, pero también a otras moléculas.
Estos van aumentar genes de factores de transcripción (SRE). Así es como se produce la activación secuencial y transitoria en el tiempo de ciertos genes en el programa mitogénico.
El control del progreso a lo largo del ciclo celular es realizado fundamentalmente por las ciclinas.
Los complejos formados por Cilicna-Cd-proteína inhibitoria regulan el trásnito de la célula por las diferentes etapas del ciclo celular. Veamos dos ejemplos: 110 Las ciclinas son proteínas sin capacidad catalítica (actividad enzimática). Su función es activar las kinasas dependientes de ciclina (Cdk).
Las kinasas dependientes de ciclina (Cdk) son protein-kinasas que tienen actividad únicamente cuando están unidas a su correspondiente ciclina.
Las proteínas inhibidoras tienen como función impedir el progreso de la célula a través del ciclo celular hasta que no se produzcan las condiciones adecuadas.
FALTAN FOTOS Las ciclinas se degradan y sintetizan de nuevo cada vez que la célula atraviesa el ciclo celular.
Carecen de capacidad catalítica (actividad enzimatica). Su función es activar las Kinasas dependientes de Ciclina (Cdk).
Las ciclinas se expresan en diferentes fases del ciclo: Por lo tanto las ciclinas no están consecutivamente, sino que aparecen y desaparecen (están solo transitoriamente).
o La ciclina D (early response gene), se expresa poco después del estímulo mitogénico (a los pocos minutos).
o La ciclina E se activa un poco más tarde y permite pasar el Chek point G1/S y desparece o La ciclina A se activa más tarde y perdura hasta el comienzo de la mitosis o La ciclina B comienza un como antes de la mitosis y durante la misma La regulación de la expresión viene dada por proteína inhibidora, fosforilación y defosforilación así como la presencia o ausencia de la ciclina correspondiente.
111 Las Kinasas dependientes de Ciclina (Cdk) están en la célula durante todas las etapas del ciclo celular. Son protein-kinasas que tienen actividad únicamente cuando están unidas a su correspondiente Ciclina. Por ello solo serán activas durante el periodo en el que se sinteticen las Ciclinas capaces de unirse a ellas.
Estas son las formas comunes de dímeros: Existen más formas de asociación, pero estas son las más comunes.
Fase del Ciclo celular en que se expresa cada CICLINA y Cdks a las que se une o CICLINA B = G2 / M ( Checkpoint ) se une a Cdk1 o CICLINA A = S + G2 se une a cdk2 o CICLINA E = G1 / S ( Checkpoint ) se une a Cdk2 o CICLINA D = G1 se une a Cdk4 y Cdk6 Estas son las formas en las que se pueden asociar, pero por ejemplo CDK4 y CDK6 solo se pueden asociar con las ciclinas tipo D. También vemos la producción a lo largo del tiempo así como su expresión, la cual es clave en la regulación en la actividad de las CDKs (quinasas dependientes de ciclinas) que fosforilan un montón de proteínas efectora cada una de ellas; de forma que las activa o inactiva, para permitir que la célula progrese a lo largo de cada etapa celular.
Al final, por tanto, se regula el proceso de fosforilación de las CDK sobre sus proteínas efectoras.
112 Las checkpoints son puntos de control o puntos de restricción que jalonan el ciclo celular. Se reconocen una serie de checkpoints: Las proteínas inhibidoras tienen como función impedir el avance de la célula a través del ciclo celular hasta que no se produzcan las condiciones adecuadas.
Actúan por interacción directa con el dímero Ciclina – Cdk y se las designa por su peso molecular: p15, p16, p18, p19, p21, p27, p57. Las RAS antes se denominaban p21, por lo tanto estas p21 son otras. Por lo tanto todo esto es un proceso dinámico que avanza con la ciencia.
Se las incluye en el grupo de proteínas supresoras de tumores por oponerse al progreso de la célula a lo largo del ciclo celular.
Las Kinasas dependientes de Ciclina (Cdk) son susceptibles de regulación, la regulación es llevada a cabo por kinasas específicas denominadas CDK-activating kinases (CAKs) y por fosfatasas.
Poseen varios sitios susceptibles de fosforilación de tal forma que existe un patrón de sitios fosforilados y sitios defosforilados que determina el estado activo o inactivo de cada Cdk. Es decir, no es un patrón general; sino que es característico de cada CDK sabiendo entonces si está activa o inactiva. es característico de cada CDK Así, las Cdks requieren ser defosforiladas por las fosfatasas cdc25 para ser activas. Como acabamos de ver, durante el periodo G1 se expresa la CICLINA D1 y esto ocurre precisamente como consecuencia del estímulo proliferativo. La Ciclina D1 es uno de los Early Response Genes que se van a expresar tras el estímulo mitogénico.
Más tardíamente se expresará la CICLINA E. O sea primero D (early response gene) y luego la E.
113 El gen de la Ciclina D1 es uno de los early response genes expresado tras el estímulo proliferativo.
Se une a Cdk4 y a la proteína inhibidora p16. Tiene un promotor que es elemento de respuesta al suero (SER) en la región reguladora. Como consecuencia del estímulo proliferativo, se llega Elk o ERK y aparece la ciclina cdk1.
El factor de transcripción Myc va a actuar sobre el progreso de la célula en el ciclo celular mediante diversos mecanismos. Resaltaremos uno: La ciclina CDK1 se inicia como consecuencia del estímulo proliferativo y se une a la CDK4, que en ausencia de la proteína inhibidora, activa proteína de retinoblastoma y se activa el E2F que es un factor de transcripción que tiene puede aumentar los niveles transcripcionales de la ciclina E.
Por otro ladom, el gen Myk es un factor de transcripción que actúa sobre en el gen cdc25A que es una fosfatasa específica de CDKs, concretamente de 1 y 2. Entonces activa defosforilando a CDK2 y como consecuencia se produce el dímero CDK2 y ciclina 1.
114 Es decir se necesitan estos dos procesos de forma simultánea para activar a la CDK2. Esto sigue un desarrollo cronológico en el tiempo. Por eso decimos que el programa mitogénico tiene una serie de procesos que se suceden secuencialmente y que además son transitorios.
Regulación de la expresión de ciclina E por ciclina D1- CDK4 Una vez que se libera P16 por los motivos que sean, se produce la activación por desaparición del complejo y se activa la CDK4 y ciclina D1 y activa la proteína del retinoblastoma que son inhibidoras de otras proteínas, en este caso al factor de transcripción E2F.
Al fosforilarse Rb se produce la disociación y entonces deja de inhibir el factor de trascripción de E2F y entonces aumenta la transcripción de diversos genes; entre ellos el gen de la ciclina E.
Tanto p16 como la proteína del retinoblastoma Rb se consideran como proteínas “supresoras” de tumores y sus genes como genes “supresores” de tumores. Esto es debido a que actúan controlando la proliferación celular de una forma “inhibitoria”. Es decir, inhiben el progreso del ciclo en la célula. Entonces las mutaciones en cualquiera de estas proteínas que provocan una disfunción; provocan su progreso proliferativo. Es decir, si pierden sus características funcionales por mutación, se favorece la aparición de un tumor. Es al contrario que las oncoproteínas (ganancia de función).
En el caso de p16 también se han encontrado tumores donde el gen de p16 se encuentra hipermetilado en CpG en su región reguladora.
La proteinas E6 y E7 del virus Human Papiloma Viruses (HPVs) son oncogénicas porque actúan sobre proteínas reguladoras… Por ejemplo E6 es capaz de unirse a la proteína p53 y conducirla a la ruta de la ubiquitinación y degradación. La proteína E7 se une a la proteína del retinoblastoma Rb impidiendo su acción inhibidora sobre el Factor de Transcripción E2F, por lo tanto se produce la ciclina E entre otras, implicadas en la proliferación.
115 P14, isoforma de P16, que es más pequeña, y también actúa sobre p53. P14 se une a la proteína MCM2 inhibiendo la degradación de p53.
P14 entonces activa la p53 mediante la unción a MCM2 para inhibir la degradación de p53; de forma que incrementa su concentración (de p53). Esto es porque MDM2 marca la p53 ubiquitinizandóla y marcándola para degradación.
Recordemos que la PKB fosforila la p27/kibp1 y entonces permite la disociación de forma que la ciclina puede fosforilar a Rb y permitir que actúe la E2F.
Por tanto, la ciclina E tiene un mecanismo de retroactivación, no de retroinhibición. Es decir, se produce la ciclina E, y como consecuencia ***.
El p27 también se puede fosforilar por otras proteínas como la Erb ½ . Es decir, desde las dos rutas generales a través de las cuales actúan los factores de crecimiento; se puede fosforilar p27 y se activa por tanto el dímero DSKK2-ciclina.
116 PKB / Akt fosforila p27/kip1 y lo retiene en el citosol, impidiendo su papel en el nucleo que inhibe la actividad kinasa de CDK2 Cascada regulatoria de la expreisón de genes de ciclina Ya hemos visto cómo funciona. La p16 acabamos de ver que es inhibidora del proceso inicial.
Se produce la fosforilación de pRB y por lo tanto actúa el E2F que da a la cliclina E, la cual actúa activando su propia trascripción (proceso de retroactivación). Pero además, también actúa sobre la expresión de la ciclina A, siendo la proteína inhibidora de p27 al igual que en la retroactivación de ciclina E. Por lo tanto obtenemos una cascada en tres niveles.
117 “Regulatory Cascade of Cyclin Gene Expression When cells traverse the G0 to G1 phase to the S-phase transition, a series of cyclin-dependent kinases is activated. The addition of serum growth factors to quiescent cells promotes transcription of the cyclin D1 gene. Cyclin D1 then associates with pre-existing cdk4 to form an active complex. The kinase activity associated with this complex can phosphorylate specific sites on the retinoblastoma protein (pRb), leading to inactivation of pRb and the activation cyclin E transcription by E2F. Activation of the cyclin E gene can be blocked by the cdk inhibitor p16.
Cyclin E associates with existing cdk2 and this active complex regulates the function of several sets of target proteins. First, cyclin E/cdk2 complexes associate with E2F/p107 complexes to actívate expression of the cyclin A gene. Also, cyclin E/cdk2 complexes cooperate with cyclin D1 to amplify the phosphorylation of pRb. Cyclin A associates with cdk2 to form a kinase complex that phosphorylates downstream targets involved in the initiation of DNA replication.” Quiescencia y senescencia Hemos visto el ciclo celular pero hemos eludido una cuestión clave; la mayoría de las células del organismo se encuentran en el periodo G0, lo que normalmente denominamos con dos términos diferentes que expresan dos conceptos diferentes como son la quiescencia y la senescencia.
Este periodo realmente es un periodo heterogéneo de estados celulares que únicamente tienen en común la detención (arrest) de la célula en la actividad proliferativa. La célula que entra en ese periodo G0 ha abandonado el ciclo celular.
Sin embargo, ni todas las células que han abandonado el ciclo proliferativo para entraren el periodo G0 lo han hecho condicionados por las mismas situaciones ni se encuentran en el mismo estado ni tienen la misma capacidad para revertir su salida del ciclo.
La senescencia: Existen células que entrarán en el periodo G0 como consecuencia de una acumulación de mutaciones que les impiden atravesar el checkpoint (punto de restricción) G1/S. Entonces las células que entran en el perdiodo G0 se las llama senescentes. El modelo clásico que permite identificar las células en esa situación es el de inducción de mutaciones mediante radiación Ultravioleta (UV). Por ejemplo, p53 manda a periodo senescencia a células que tengan acumulación por radiación.
La característica del periodo de senescencia desde el punto de vista biológico se debe a que su maquinaria de replicación no funciona porque se acumula p21, luego p16 y p19 que son las proteínas inhibidoras que caracterizan el periodo de senescencia.
Si nosotros retiramos de las células estas proteínas inhibidoras, la célula podrá replicarse pero se podría inducir un tumor porque es una célula mutada.
Son quiescentes las células que paralizan su progresión en G1 pero que pueden volver al ciclo tras un estímulo.
En este grupo de células encontramos células que han cesado la proliferación por una inhibición por contacto. Sería el caso de células hepáticas que tras una hepatectomía reanudan el proceso proliferativo, o también el caso de células en cultivo que alcanzan la quiescencia por confluencia (saturación de la superficie) que impide físicamente la proliferación.
118 Otro caso diferente es el de las células madre, que se encuentran apartadas del ciclo proliferativo durante largos periodos de tiempo pero que pueden volver al mismo proliferando y generando linajes celulares diferenciados.
También deben considerarse como quiescentes las neuronas, por conservar una capacidad proliferativa que es inhibida por las proteínas inhibidoras de CDKs. Son células quiescentes, aunque no hayan sido irradiadas, porque una vez producen su ultimo ciclo replicativa se acumula p21 y luego p16 y p19.
En un experimento de fibroblastos en las que se retiraba las proteínas inhibidoras p16 y p19 (ya que p21 es la primera) y morfológicamente se diferenciaban a neuronas. Neuronas morfológicamente hablando, pero no podían ejercer su función como tal.
Es decir, las proteínas inhibidoras son muy importantes en el bloqueo del ciclo celular y por tanto en la diferenciación celular.
Si se debe a una mutación, es un bloqueo permanente.
La quiescencia se puede inducir “in vitro” simplemente haciendo ayunar a las células en cultivo de tal forma que la ausencia de suero en el medio overnight es suficientes para sincronizar las células en G0. De esta forma, como no tienen componente nutritivo, todas quedan en el mismo periodo (las que empezaron S lo acaban y las que no, se quedan retenidas). Un posterior estímulo con factores de crecimiento o suero hace que salgan de la quiescencia e inicien su progreso en el periodo G1 hasta el checkpoint G1/S.
Experimentalmente, existen técnicas que permiten diferenciar si unas células que se encuentra en el periodo G0 es quiescente o senescente. Estas técnicas de citometría de flujo. Como podemos ver en: http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/cellcycleanalysis/senescence/ Las células pueden hacerse quiescentes y entrar en G0 simplemente mediante starvation (ayuno) pero este paso es reversible. Las células pueden hacerse senescentes entrar en G0 simplemente mediante irradiación gamma o mediante la expresión de la proteína inhibidora p21 (cyclindependent kinase inhibitor CDKNA1A and 2A). Estas células senescentes no pueden revertir a G1.
La distinción experimental entre ambos estados se realiza en base al hecho de que las células senescentes transcriben muy activamente a diferencia de las quiescentes que tienen bajos niveles de mRNA.
El colorante Pyronina se une específicamente al RNA y permite diferenciar ambos estados. Es decir, se mide la siescencia en función del RNA.
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