DGM- Tema 3. Tècniques de blotting (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 23
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 10
Subido por

Vista previa del texto

DGM- Tema 3 mfiguls TEMA 3: TÈCNIQUES DE BLOTTING El BLOTTING consisteix en la transferència del material d’un suport no adient a un suport adient, el qual ens permet l’anàlisi.
L’origen d’aquestes tècniques és sobre l’any 75 gràcies a Sir Edwin Southern.
El Southern és una tècnica que serveix per l’anàlisi de genomes complexos (DNA). Fins aquell moment s’havia aconseguit analitzar genomes senzills mitjançant enzims de restricció, però amb genomes més complexes era inviable. Si intentem analitzar amb una electroforesis d’agarosa un genoma complex, com el del ésser humà, no es possible perquè si digerim el material queda molt difús i, si no ho fem, les bandes es solapen.
Edwin Southern va pensar que es podia analitzar una seqüència especifica amb sondes, apreciant únicament aquells fragments de seqüència que estiguessin marcats. Però, es va adonar que era impossible hibridar sondes sobre agarosa perquè aquesta és molt fràgil. A partir d’aquest moment va pensar en transferir el DNA sobre una membrana rígida que no fos fràgil, no difongués i li permetés fer una la hibridació.
Les tècniques de blotting consisteixen en transferir el DNA, que prèviament ha sigut separat en un gel, sobre una membrana que ens permet la hibridació. Abans de fer la hibridació cal fixar el DNA.
A partir d’aquesta tècnica desenvolupada per Southern per analitzar DNA es van desenvolupar diferents alternatives com northern (RNA), western (proteïnes),etc.
Principis de la tècnica de Southern blot Es basa en la localització en un conjunt de molècules o fragments de DNA aquells que contenen una seqüència concreta mitjançant l’ús de sondes específiques i la hibridació.
1. Aillar: En primer lloc, cal desestructurar la mostra, és a dir, aïllar el DNA que volem analitzar. Al perdre l’estructura, perdem la capacitat d’ anàlisi in situ, ara passem a analitzar molècules.
a. Es imprescindible que el DNA estigui intacte. A l’hora d’aïllar-lo no pot estar degradat perquè sinó el resultat no serà fiable.
b. En algunes situacions com a genètica forense sol passar que la mostra te molt poc DNA i en males condicions. En aquests casos no es pot realitzar un southern.
Tan sols quan disposem de prou material que es pugui aïllar en bones condicions.
c. Aquest procés és llarg, pel que és un dels pricipals inconvenients.
2. Digerir: A continuació, cal fer la digestió per generar fragments petits. Com els enzims són específics de diana, sempre obtindrem el mateix patró de fragments.
1 DGM- Tema 3 mfiguls 3. Separar: Un cop hem dirigit el DNA, cal separar, mitjançant una electroforesi, els fragments per grandària: dels més grans als més petits.
a. L’inconvenient es que el material sobre el que fem la electroforesis es fràgil i no ens permet la hibridació.
4. Desnaturalitzar: Abans o durant la transferència s’ha de desnaturalitzar el DNA (sobre el filtre ha de quedar en forma de monocadena perquè posteriorment s’haurà d’hibridar).
**** La desnaturalització de la mostra es fa amb pH mentre que la desnaturalització de la sonda amb temperatura. Això és perquè l’agarosa es desfaria si pugéssim la temperatura 5. Transferir. Un cop el DNA s’ha separat cal que es transfereixi ocupant la mateixa posició.
6. Fixar: Mes tard, fixem el DNA de cadena senzilla sobre el suport sòlid 7. Hibridar: hibridem amb una sonda específica 8. Rentar: després, fem una sèrie de rentats per eliminar les restes de sonda no hibridada específicament.
9. Detectar: Per últim, realitzaríem la detecció. El que es detecta és la marca, no el DNA (se suposa que la marca va associada al DNA).
Com veiem, és un procés llarg que sol tardar sobre una setmana.
Els inconvenients principals són bàsicament la lentitud i que es necessita un DNA en bones condicions. A més, bona part del procés el fem a cegues. Fins el final no sabem si el resultat sortirà correcte i, si no surt, haurem de repetir-ho.
En el Southern, la hibridació és sobre suport sòlid. Per tant, cal fixar el DNA desnaturalitzat, afegir la sonda, i, després, realitzar una sèrie de rentats per eliminar la sonda que no ha hibridat.
Així obtindrem una sèrie de bandes que correspondran al DNA que s’ha unit a les sondes. Cal remarcar que el que estem detectant no és el DNA, sinó la marca que porta la sonda. Si volem quantificar o treure informació de senyals, cal saber exactament quin tipus de sonda s’ha utilitzat i quina es la seqüència que ha hibridat amb la sonda.
2 DGM- Tema 3 mfiguls Per desnaturalitzar la mostra i la sonda augmentarem les condicions de severitat.
Per desnaturalitzar la mostra incrementem el pH i per desnaturalitzar la sonda la temperatura. La mostra no es desnaturalitza amb temperatura perquè si augmentem la temperatura, l’agarosa es fon i ens carreguem la tècnica. Desnaturalitzant amb pH no afectem per a res el suport, però tenim el petit problema de que cal buscar unes condicions adequades per cada mostra.
A més, sempre utilitzarem agents desnaturalitzants perquè ens permeten treballar amb condicions menys extremes.
Llibres: Molecular Biology and Genomics (capítol 2) Isolation of Genomic DNA from Mammalian Cells 1. ELECTROFORESI D’ÀCIDS NUCLEICS Per separar DNA de doble cadena, aquest es fragmenta i, després, al posar-lo en un camp elèctric aquest es dirigeix cap al pol positiu a través dels porus, ja que té càrrega negativa. La velocitat amb què avança dependrà de la seva grandària i la de concentració d’agarosa: Si els porus són molt grans no tindrà massa dificultat en avançar però són petits potser si. I com més gran és la molècula de DNA, més dificultat té per avançar en l’agarosa.
El material que s’utilitza per fer l’electroforesi es l’agarosa ja que amb aquest material podem controlar fàcilment la grandària del porus i fer que aquests siguin uniformes. A major concentració d’agarosa, més petits són els porus.
Per tant, la concentració d’agarosa/acrilamida modifica les bandes. Si el gel està molt concentrat les bandes petites correran molt fàcilment però les grans tindran més dificultat. Si ens interessa analitzar kb les bandes es solaparan i no podrem distingir-les. D’aquesta manera, en funció del tipus de fragment que vulguem analitzar caldrà augmentar o disminuir la concentració d’agarosa.
L’agarosa separa molècules grans (0,1 – 30 kB) L’acrilamida també serveix per fer electroforesi d’àcids nucleics, te més resolució (fins 1 únic nucleòtid) i, per això, s’utilitza per seqüenciació. Però per fer southerns no necessitem tanta resolució. Quasi sempre es treballa amb agarosa.
L’acrilamida separa molècules petites (6-1.500pb) Les cases comercials ja tenen gels preparats amb diferents concentracions d’agarosa. Cada concentració te un rang de molècules a separar.
3 mfiguls DGM- Tema 3 2. MARCADORS DE GRANDÀRIA DELS FRAGMENTS DE DNA No és suficient separar, sinó que cal tenir referències de grandària dels fragments que anem a separar. Per aquesta raó es van crear els patrons o marcadors de grandària (ladders), els quals actuen com punts de referència.
• Al principi aquests patrons estaven formats a partir de genomes vírics digerits, dels quals se’n coneixia la grandària.
• Però ara, les cases comercials produeixen larrder artificials posant “x” quantitat de tal component i jugant amb alguns paràmetres ja que el recorregut de les bandes depèn de molts de factors: temps que s’ha corregut, intensitat d’agarosa...
o Poden diferir en 1 Kb o 100 pb Si fem un Southern, quan més punts de control introduïm al llarg del procés, més probabilitats de que ens surti bé (es com una assegurança).
• Comprovar que el DNA no está degradat abans de digerir-lo • Després de la digestió, comprovar que s’ha digerit bé: Si al gel ens apareix molta mostra a dalt significa que no s’ha digerit bé i, per tant, no té cap sentit continuar aplicant els següents passos de la tècnica perquè ja sabem que no ens sortirà.
o Un cop s’ha digerit cal fer una fotografia sobre una regla.
Així obtenim punts de referència del marcador de bandes i podrem saber quant ha corregut cada banda.
o o Fem una representacio gràfica del que ha recorregut cada banda respecte al pouet on hem carregat la mostra. Així podrem fer una estima de la grandària de cada banda (pes).
Els patrons de grandària són importants i han de ser els adequats (la banda a analitzar ha d’estar dins del patró de bandes que hem emprat com a referència).
Els patrons de grandària ens permeten deduir el pes de les bandes. A les cases comercials hi ha diferents patrons i cal escollir aquell que sigui del rang de les bandes que creiem que ens sortiran.
4 DGM- Tema 3 mfiguls 3. TRANSFERÈNCIA (BLOTTING) L’agarosa no és un bon medi per la hibridació: - és fràgil - el DNA tendeix a difondre Cal transferir els fragments de DNA a un altre suport mantenint la seva posició relativa. Una membrana rígida que faciliti la fixació del DNA sobre la superfície i la seva posterior hibridació.
Hi ha diferents tipus de membranes: - nitrocel·lulosa o no sol utilitzar-se o l’únic avantatge de la nitrocel·lulosa sobre el niló és que genera menys soroll de fons. Però aquesta característica no compensa la resta d’inconvenients.
o No podem fer rehibridació perquè ens carreguem el gel.
o - niló: o és el més utilitzat o la fixació del DNA al niló és molt més estable - niló carregat positivament (hybond) - PVDF (Poliflorur de vinildè) 4. MÈTODES DE TRANSFERÈNCIA: 1. Per CAPIL·LARITAT à mètode clàssic dissenyat per Southern. Funciona molt bé però es engorrós.
Consisteix en posar una sèrie de material absorbent que a mesura que absorbeix el buffer arrossega el DNA cap al filtre de niló, on queda unit. El transport es fa a través d’aquesta força motora que desplaça.
2. Per ELECTROFORESI en sentit transversal. És un mètode molt emprat, sobretot en Western.
5 DGM- Tema 3 mfiguls 3. Per BUIT. Es fa el buit a la part inferior i s’afegeix buffer a la part superior.
La transferència per buit o capil·laritat son dos mètodes molt utilitzats. La transferència per electroforesi sol fer-se al western per proteïnes. Però qualsevol es útil. La transferència per electroforesi i per buit són més ràpides i fiables que per capil·laritat.
DESPURINITZACIÓ A vegades podem trobar que hi ha alguna banda molt tènue quan esperaríem molta més intensitat. Si això afecta a les bandes de major grandària, es degut a un problema de transferència: els fragments que van més ràpids en el camp electromagnètic son els petits i els grans van més lents. Quan fem la transferència a través del gel d’agarosa cap a la membrana, els petits migren més ràpidament que els grans.
Això succeeix en fragments >3kb, que els costa passar.
Per dal de solucionar això, abans de la transferència es fa una despurinització: - El gel d’agarosa es posa en una solució HCl 0,5 M durant 10 minuts de manera que es generen llocs apurinics aleatòriament, que són làbils en una solució alcalina - A continuació es posa en una solución de desnaturalització 0,5M NaOH. Als punts on han saltat les bases nitrogenades, es produeixen trencaments de cadena senzilla.
5. FIXACIÓ Cal fixar el DNA per mantenir-lo a sobre de la membrana. Sinó al fer rentats el perdrem.
La fixació serà diferent segons la membrana emprada, però normalment s’utilitza niló perquè és molt més fàcil i ràpid.
- Niló: La fixació en niló consisteix en exposar-lo a un transiluminador(UV) durant uns 3 minuts. La llum UV activa les bases T/U fent-les altament reactives amb els grups amino de la superfície de la membrana i formant enllaços covalents. Augmentem així l’estabilitat i permanència dels àcids nucleics a la membrana.
- Nitrocelulosa: o 80ºC al buit durant 2 hores o 120ºC 30 min o enllaços hidrofòbics a la membrana 6. DESNATURALITZACIÓ SONDA I HIBRIDACIÓ El següent pas es desnaturalitzar la sonda amb temperatura per poder hibridar. Per a que hibridi cal hibridar el filtre amb la sonda.
Per facilitar-ho disminuirem la severitat de les condicions. Normalment per baixar la severitat baixem la temperatura, augmentem la salinitat o fem un pH més àcid.
En funció de que estiguem analitzant les condicions òptimes variaran.
6 DGM- Tema 3 mfiguls Amb el niló es fa un pretractament abans de la hibridació per evitar soroll de fons. També es pot fer amb llet desnatada amb pols Un cop s’ha hibridat passarem als rentats.
7. RENTATS Els rentats serveixen per eliminar tota aquella sonda que no està unida específicament a les seqüències complementaries en cert grau. Per fer-ho farem una sèrie de rentats cada vegada amb condicions més severes. el grau de severitat és molt important per al rentat i per a un bon resultat.
Les condicions de severitat en què es fan la hibridació i els rentats són bàsiques per a determinar els resultats: - Hibridació: Si es fa a baixa severitat podem tenir molt soroll de fons (bandes poc definides). A més severitat, les bandes estaran més definides.
- Rentats: podem fer rentats més severs per eliminar tot allò que presenti una certa inespecificitat.
És més senzill jugar amb la severitat dels rentats que amb els de la hibridació. Ja que la hibridació una vegada està feta no hi ha pas enrere. En canvi, amb rentats podem anar afegintne.
7 DGM- Tema 3 mfiguls 8. DETECCIÓ - Directa (Radioactivitat/fluorescencia): Si el marcatge es radioactiu Indirecta (Quimioluminiscència, cromogènia): Si el marcatge no és radioactiu o fluorescent, llavors cal fer una detecció indirecta incubant una sèrie de components i combinant rentats per eliminar la resta de molècules no unides.
Tots aquests passos de rentats posteriors a hibridacions o posteriors a incubació són bàsics perquè donen lloc a uns resultats més o menys clars.
Des del moment que posem a hibridar, fins el resultat final no sabem com està anant el procés perquè no tenim cap control.
En el cas del niló, augmentant la severitat podem eliminar tota la sonda hibridada (rentat fort) i rehibridar amb noves condicions de severitat.
La detecció per quimioluminiscència permet reutilitzar el filtre, mentre que la detecció per precipitació de color no ho permet (encara que el mètode sigui més barat), perquè el producte s’acumula al filtre.
Si necessitem molta sensibilitat realitzarem la detecció amb radioactivitat.
El marcatge no radioactiu en bones condicions arriba fins els 60fg. La radioactivitat fins 10fg.
Tipus de blotting Hi ha diferents tipus de blotting. Poden fer-se variacions per analitzar DNA, proteïnes, RNA.
Totes segueixen un procés més o menys semblant.
• Southern blot: treballa amb DNA.
Ens permet determinar la distància entre dues dianes de restricció del gen d’interès.
Digerim el DNA. Per tant, a més d’identificar la presència de d’una diana, podem detectar variacions en les dianes de restricció o al fragment de restricció (el fragment comprès entre dues dianes) al gen d’interès • Northern blot: treballa amb RNA En aquest cas, el RNA no es digereix, sinó que s’analitza la molècula completa. Estem analitzant variacions en la grandària dels RNAs i quantitat relativa respecte de la resta.
8 DGM- Tema 3 mfiguls • Western blot: treballa amb proteïnes Ens permet examinar la grandària i quantitat d’una proteína determinada.
Aquestes tècniques de blotting ens permeten analitzar fins i tot canvis epigenètics com les metilacions de citosines.
Gràcies a elles disposem d’una sèrie de eines aplicables al diagnòstic de qualsevol molècula.
• • • Generalment s’utilitza més RT-PCR que northern.
El Southern se segueix utilitzant, però no molt.
El western s’utilitza molt.
5/3/15 9 DGM- Tema 3 mfiguls WESTERN BLOTà Anàlisi de proteïnes Imaginem que tenim un conjunt de proteïnes i volem saber si n’hi ha una o volem quantificar.
Llavors fem un western, que té passos similars al Southern: - Aïllar - NO DIGERIM - Separació en electroforesià SDS-PAGE: gel de poliacrilamida en un buffer per dodecilsulfat.
o Es desnaturalitzen les proteïnes i separen en funció de la seva grandària.
- Transfèrenciaà electroforètica. El filtre sol ser de nitrocel·lulosa p PVDF (polifluorur de vinildilè) - Deteccióà sol ser mitjançant anticossos (detecció indirecta) NORTHERN BLOTà Anàlisi de RNA És similar al Southern però partim de RNA.- NO DIGERIM - L’RNA és més sensible que el DNA a la degradació (COMPTE!).
- Les RNAses son resistent als agents quelants (ex/EDTA) i poden resistir l’ebullició i l’autoclavat.
o Es poden inactivar per l’agent alquilant de la histidina (DEPC) i o amb inhibidors especifics com isocianat de guanidina (GITC) Electroforesi del RNA: En el Northern no digerim els RNA enzimàticament però si que els separem per la seva grandària electroforèticament. Com que son de cadena senzilla, en condicions fisiològiques estan en doble cadena per complementarietat interna i , per tant, la mobilitat dels RNA en el gel d’agarosa depèn de: - mida - conformació Per això, l’hem de desnaturalitzar abans de fer el gel, perquè sinó tenim una confusió, per tant, el gel ha de ser d’agarosa i desnaturalitzant (formaldehid/formamida).
Controls de contaminació per DNA i degradació del RNA (electroforesi Northern) En el gel que es mostra, ens apareixen dues bandes mol marcades, que corresponen al RNA més abundant, el ribosòmic (28S i 18S). Aquestes bandes 10 mfiguls DGM- Tema 3 ens serveixen com a CONTROL DE QUALITAT. Si apareixen aquestes bandes ens serveixen com a referència per indicar-nos que l’RNA no està degradat. Llavors sabrem que podem fer el Northern.
En el cas dels RNA doncs, sempre mirarem si les bandes dels rRNA apareixen.
- Si algunes de les bandes no es veuen o sota es veu una banda difusa, això correspon a RNA degradat.
- Si sobre apareix una banda, significa que a la mostra hi ha contaminació per gDNA Per tant, les bandes son indicadores de la qualitat del RNA. Si hi ha contaminació, el tractarem amb DNAasa i si hi ha RNA degradat no podrem fer el Northern.
Llibre: RNA Methodologies (Capitols 2, 6, 9 i 11) Nucleic Acid Blotting (Biblioteca UAB) Article: Methodological consideration for improving Western blot analysis Les sondes ens permeten: identificar, localitzar i quantificar.
Les tècniques de blotting ens permeten: identificar i quantificar. NO LOCALITZAR: No podem localitzar una seqüencia a la molècula analitzada perquè l‘hem trencat.
(BLOTTING) PRESÈNCIA I QUANTIFICACIÓ D’UNA PROTEINA, RNA O SEQÜENCIA CONCRETA DE DNA.
Northern blot: ens permet determinar: o Canvis en grandària: si hi ha canvis en la posició de la banda (mes amunt o més avall).
o Canvis quantitatius: analitzant la intensitat de la banda en diversos temps.
§ Exemple: Inhibició de Gal1 mitjançant glucosa.
Mitjançant la intensitat de la banda (que correspon a gal1) podem veure que la seva expressió baixa a mesura que s’addiciona glucosa, perquè la intensitat de la banda disminueix. Això ens indica un efecte repressor per part de la glucosa Ex/ Electroforesi del Síndrome X fràgil en diferents teixits.
11 DGM- Tema 3 mfiguls En un treball, comparant la banda obtinguda de la mostra del cor respecte les altres, l’investigador fa diferents afirmacions sobre l’expressió del mRNA del gen FMR: - En els altres teixits, respecte al cor, hi ha múltiples transcrits més petits (quant n’esperàvem un de 4,4 kb) en la resta de teixits, però, això es pot assegurar? o Sí, perquè la sonda ens detecta específicament el transcrit del gen.
- El transcrit s’expressa més al cervell i testicles, perquè les bandes son més intenses. Es pot assegurar? o No, necessitem un control. Ja que l’eficàcia d’extracció de RNA en un teixit o altre pot variar. En aquest cas, el control podria ser una sonda per un transcrit d’un gen constitucional, que s’expressa igual en tots els teixits.
Ex/ Efecte de les citocines sobre l’expressió d’un gen en cervell de ratolí.
En l’estudi que es mostra, s’acompanya el Northern amb la fotografia dels gels utilitzats per separar (amb el qual s’ha fet la transferència). Les diferències en la intensitat de les bandes del Northern indiquen diferències en el nivell d’expressió.
CONTROLS: northern blot S’utilitzen sondes de gens constitutius - Gliceraldehid 3’ fosfat deshidrogenasa (GADPH) - β-actina - β2-microglobulina - RPLP0 En l’electroforesi que es mostra a continuació, la banda del gen estudiat surt 10x més forta en la mostra i el gen control 2x. Per tant, corregim l’increment, per determinar l’abundància relativa de l’expressió d’aquest gen: Increment corregit= 10/2 = 5 Sempre calen controls, sinó, no podem afirmar res 12 DGM- Tema 3 mfiguls També podem determinar la presència d’un transgènic en un ratolí. Per PCR no es tant precís, és millor Southern.
(veure estudis diapositives 27-30) Southern blot: ens permet determinar: Podem identificar la seqüencia o la seva abundància i, a més, detectar canvis en la seqüencia.
- Canvis en la seqüencia que afectin a la grandària dels fragments de restricció (mutacions), RFLPs.
- Cavis epigenètics (metilacions) RFLPs en un Southern Blot Com hem dit, el Southern ens permet detectar canvis al DNA (tant mutacions com canvis epigenètics).
Els RFPLs són polimorfismes en els fragments de restricció i poden tenir diferents orígens, que explicarem a continuació.
Per estudiar si hi ha RFLPs en una mostra de DNA el que fem és agafar el DNA i digerir-lo amb enzims que tallen per unes dianes específiques.
Sempre ens hauria de donar el mateix patró de restricció, si no canvia la seqüència.
Si s’altera el patró de restricció, el Southern ho pot posar de manifest. L’alteració del patró de restricció pot ser per diferents causes.: • Substitucions i pèrdues o addicions de les bases nitrogenades que afecten a dianes de restricció. Si ens afecten a la diana, canviaran el patró de restricció. Aquestes són: o SNPs: mutacions d’un sol nucleòtid que son polimòrfiques) o RSP: polimorfismes de llocs de restricció 13 DGM- Tema 3 mfiguls • Modificacions químiques de les bases nitrogenades que condueixen a la pèrdua de la diana de restricció (metilacions).
• Guanys i pèrdues de DNA (duplicacions, transposicions, expansions, delecions). També poden alterar els patrons de restricció.
Per tant, l’abast és gran. Ara bé, el canvi ha d’afectar a la diana de restricció per poder ser detectable.
Si detectem un d’aquests canvis, diem que hem trobat un RFLP : variació en la llargada del fragment de restricció. Si la mutació afecta a la diana, les bandes correran més o menys.
RFLPs: Detecció de metilacions (canvis epigenètics): Per a la detecció de metilacions utilitzarem enzims les dianes dels quals estiguin metilades preferentment en Citosines o el dinucleòtid CG.
Utilització d’enzims de restricció que discriminen si les C estan o no metilades à HpaII i MspI Per exemple, els enzims que es presenten a continuació reconeixen la diana CCGG, però tenen diferent sensibilitat a la metilació: § HpaII: sensible a la metilació. No talla si la C de la diana està metilada.
§ MspI no es veu afectat per metilació - Els enzims HpaII i MspI són isoesquioisòmers.
Del que es tracta és de fer dues alíquotes i digerir-les, una amb HpaII i l’altre MspI i comparar les bandes obtingudes.
- Si la diana no està metilada, HpaII i MSpI tallaran igual i les bandes de les dues alíquotes (digerida amb HpaII i MspI) seran iguals.
- Si hi ha una diana metilada, HpaII no tallarà però MspI sí.
A la banda corresponent a la mostra digerida amb HpaII hi haurà una banda menys, que, si es suma amb les altres, donarà el mateix pes que si sumem les obtingudes per MspI. Això ens indica la presencia d’una metilació.
14 DGM- Tema 3 mfiguls A vegades pot succeir que no tot el 100% de copies de DNA estiguin metilades, llavors poden aparèixer bandes iguals que en l’alíquota de MspI (aquestes bandes correspondran al % de dianes de DNA no metilades) però menys intenses que les altres. Per saber la proporció de dianes metilades calculem la proporció d’intensitat que s’ha perdut en el carril digerit amb HpaII vs el digerit amb MspI.
10/3/15 En aquests Southerns en que s’estudien els RFLPs, la detecció de les sondes serà per quimioluminiscència o fluorescència, així podrem veure les diferències entre les intensitats de les bandes.
Utilització d’enzims de restricció que discriminen entre metilació i hidroximetilació à HpaII i MspI La hidroximetilació de les citosines està implicada en el canvi d’expressió d’alguns gens, llavors, si tenim la diana metilada, com podem diferenciar-la de la metilació simple? El que podem fer es glicosilar la hidoximetilcitosina (5hmC), de manera que l’enzim MspI serà sensible a la hidroimetilcitosina 15 mfiguls DGM- Tema 3 glicosilada (no pot tallar-la) i podrem diferenciar les regions metilades de les hidroximetilades.
L’enzim MspI si hi ha la forma glicosilada (5-ghmC) no talla, i si la forma no està glicosilada (5hmC) no la reconeix com a metilada i talla igualment. Per tant si prèviament hem glicosilat el DNA, en els casos que hi hagi hidroximetilcitosina i metilacions ens donaran dos patrons de restricció, per tant podríem detectar diferències en la metilació.
HspII nomes talla si no hi ha cap alteració de citosines, si hi ha hidroximetilacions o metilacions no tallarà. A més, si es glicosida, es té la capacitat de tractar les hidroximetilcitosines. I, en el cas que hi hagi 5hmC, al glucosidar la diana desapareix per l’enzim i queda un patró semblant al que donaria HpaII si no hi hagués metilació.
Per tant, hem de diferenciar entre la metilació simple (5mC) i la hidroximetilcitosina (5hmC).
Estratègies d’utilització dels enzims de restricció disponibles: En el mercat hi ha diferents tipus de enzims, hi ha dues estratègies per utilitzar-los: o utilitzar dos isoesquioisòmers, sensible/insensible a la metilació (com HpaII i MspI).
Aquesta estratègia ens permet un control robust de que el canvi de patró de restricció no és degut a una mutació, sinó a una metilació.
o utilitzar una endonucleasa específica de metilació, només talla sempre que hi hagi metilació.
Per exemple MrBC talla sempre que hi hagi dues citosines metilades (5mC) o hidroximetilades (5hmC) sense diferenciar, que prèviament tenen una purina (G/A). Mai actua sobre DNA no metilat.
Les citosines metilades/hidroximetilades poden estar en la mateixa o diferents cadenes i la distància entre elles no ha de ser superior a 3kb. Aquest enzim no reconeix llocs HpaII/MspI (CCGG), en els quals la citosina interna està metilada.
16 DGM- Tema 3 mfiguls Article: The MspJI family of modification-dependent restriction endonucleases for epigenètic studies Amb tot això hem vist que el Southern es pot utilitzar per analitzar canvis epigenètics a les regions promotores a través del patró de restricció.
RFLPs: Detecció de mutacions: La metilació no és la única causa de canvis en el patró de restricció. Les mutacions, és a dir, els canvis de seqüencia, també afecten a les dianes, per tant, el Southern també serveix per analitzar mutacions puntuals i guanys o pèrdues de material genètic.
Anèmia falciformeà MstII i DdeI En l’anèmia falciforme hi ha una mutació de canvi de sentit que afecta a la diana de restricció de Ddel i MstII.
La mutació produeix la pèrdua de la diana de restricció, que es troba al codó 6. Previ a aquesta hi ha una altra diana i després, una altra. Per tant, podríem digerir el DNA ,el que ens dóna una fragment de 1150 pb en condicions normals i utilitzar-lo com a sonda per analitzar si hi ha diana o no: - Al·lel salvatge: si hi és es digerirà donant un fragment de 1150 pb Al·lel mutat (mutació): si hi ha la mutació a la diana, el fragment tindrà 1350 pb 17 DGM- Tema 3 mfiguls Imaginem una parella que està esperant un fill, i tenen antecedents d’anèmia falciforme. Fem el patró de restricció en els pares i els fills i el resultat és l’electroforesi que es mostra a continuació.
Del resultat del gel se’n poden extreure diverses conclusions: - En els pares i en el fill que ja tenen, ens apareixen dues bandes (1150 pb i 1350 pb) el que ens indica que són heterozigots. Però el fill que esperen ha heretat els dos al·lels mutats, pel que podríem dir que estarà afectat.
A més, les bandes de 1350 i 1150 pb en els heterozigots (pares) son menys intenses que les dels homozigots (fills). Això es perquè en tots es posa la mateixa quantitat de gDNA, però en els heterozigots es reparteix entre dues bandes.
En aquest gel, si comparem el primer i segon carril veiem que hi ha més quantitat de DNA en el segon. Això simplement es perquè hem carregat diferent quantitat de DNA.
Però a més, en els heterozigots les bandes de 1350 es veuen més marcades (en ambdós carrils), això es perquè les bandes més grans retenen més bromur d’etidi, de manera que la quantitat de radioactivitat no dependrà de la quantitat de DNA sinó de la mida del fragment. La quantitat de sonda que hibrida a les bandes de 1350 i 1150 és la mateixa, però no la quantitat de bromur d’etidi que retenen les bandes.
També ens podem trobar en el cas en que en un carril ens doni una banda més gran que la suma de les dues bandes del carril on han aparegut dues 18 DGM- Tema 3 mfiguls bandes. Això indica que ha desaparegut una diana però a més ha aparegut DNA.
Pèrdua d’una diana de restricció (resultats amb diferents sondes) Imaginem un DNA en el qual hi ha una diana (que es pot perdre per una mutació) i que detectem els fragments de restricció amb diferents sondes: - Sonda 1: Imaginem que creem una sonda que no inclou la diana de restricció. Si hi ha la diana tindrem una banda. En canvi, si no hi és, tindrem una banda més gran. Si l’indvidu és heterozigot hi haurà dues bandes.
- Sonda 2: Aquesta inclou la diana. Per tant, en el cas que si que hi hagi la diana, tindrem dos bandes (perquè la sonda detecta els dos fragments tallats), mentre que si no hi és, tindrem una banda mes gran, suma de les dues del homozigot per la diana. L’heterozigot tindrà 3 bandes.
- Sonda 3 i 4: com més gran sigui la sonda, més bandes anirem tenint.
Per tant, com major sigui la sonda utilitzada, més fàcil és que tinguem fragments que puguin interferir. I a més, ens podem trobar en casos en que la banda no ve d’un únic fragment sinó que de fragments de mides similars.
Però el que ens hem de fixar es en el que es complexi en tots els casos. En tots els casos, independentment de la sonda, l’heterozigot té dues bandes, l’homozigot per la diana (té la diana) una sola banda gran i l’homozigot sense diana (no té la diana), una banda més petita. La resta de fragments tan sols generen confusió, per tant, només ens hem de fixar en aquestes primeres bandes i obviar les altres.
(veure diapositiva 18) Es difícil obtenir un Southern clar, si el patró de bandes no ens Canviant l’astringència del Southern podem millorar el resultat i aconseguir un diagnòstic objectiu (No subjectiu!!!).
permet un diagnòstic clar, l’haurem de repetir.
19 DGM- Tema 3 mfiguls La següent pàgina web presenta alguns dels problemes amb Southern: http://www.protocolonline.org/biology-forums/Southern-blotting.html Deficiència en 21-hidroxilasaà TaqI La 21.hidroxilasa és un gen que està duplicat, la copia funcional és la primera i la segona és un pseudogen. El fragment que conté el gen i el pseudogen conté dianes per la endonucleasa TaqI.
Per tant, com que els fragments resultants inclouen el gen i el pseudogen i a més, tenen diferent mida, amb la digestió amb aquest enzim podríem saber si un individu conté el gen, el pseudogen, o ambdós.
En la electroforesi es presenta un Southern d’una família on el DNA s’ha digerit amb TaqI i s’ha utilitzat una sonda que reconeix el gen (també el pseudogen).
- En els pares apareixen dues bandes (heterozigots): o 3,7 pb à gen o 3,2 pbà pseudogen - En el fill, només apareix una banda a 3,2, el que indica que li falta el gen.
Afegir un control ens pot reforçar els resultats. Si fem un control amb el mateix gen, es veu que la intensitat de les bandes del control és igual però en els pares, la intensitat és menor en les bandes de 3,7 ja que són heterozigots i tenen menys DNA.
Aquest gel ens dona dues informacions: - Pèrdua de la bandaà significa que hi ha una deleció - Perdua d’intensitat relativa als portadors Al analitzar l’altra gen (el de color blau) veiem que hi ha la desaparició de la banda de 3,2 en el fill, el que ens indica que ha perdut el gen. I a més, hi ha menys intensitat als pares.
20 DGM- Tema 3 mfiguls Deleció Una deleció no vol dir que el fragment que s’analitzi sigui més gran o petit, simplement que pot ser que el fragment canvií de grandària.
- Si es produeix una deleció interna en el fragment que detecta la sonda, tindrem un fragment més petit (banda més petita) en els individus on hi ha deleció - Si la deleció afecta a la diana de restricció, el fragment que ens queda ara entre les dues dianes és més gran i la deleció dona un fragment més gran.
Sempre que fem Southern pot ser que coneguem la mutació que hi ha, en aquests casos, ja coneixerem quins seran els patrons de restricció tant en els individus normals, com els portadors de l’al·lel mutat o bé els homozigots pel mutat. Però si no coneixem la mutació, un patró de restricció determinat es pot donar per múltiples causes (mutació, metilació, guany/pèrdua de DNA). Per tant el Southern és útil quan ja es coneix la mutació però per caracteritzar la mutació, ens caldrà fer més estudis.
El Southern no és útil per caracteritzar una mutació, ho és més, per exemple, la seqüenciació.
Distròfia miotònica Aquest és un cas particular. Tenim un matrimoni on el pare (I1) és heterozigot i la mare homozigota (I2) per l'al·lel normal. La filla (II1), també heterozigota, té un fill afectat (III2) que ha heretat una banda del pare (un al·lel) però no es segur que hagi heretat la banda de la mare (II1). La banda que hauria de ser de la mare aparentment no hi és, això es deu a mutacions dinàmiques en les que un triplet s’expandeix per un lloc de microsatèl·lits. Per tant, l’al·lel de la mare ha incrementat la seva grandària i per això veiem una banda més gran.
El microsatèl·lit pot canviar de còpies, per tant si augmenta, el fragment resultant serà molt més gran.
En aquest cas, a part de l’expansió (inestabilitat a la línia germinal), s’ha donat una anticipació, en la qual el fill presenta símptomes més greus i a una edat més primerenca.
21 DGM- Tema 3 mfiguls Anàlisi de pèrdua d’heterozigosi (LOH) El Southern es pot posar de manifest marcadors polimòrfics que ens indiquin la pèrdua d’heterozigosi d’una regió concreta.
Es diu que hi ha LOH quan en la mostra analitzada d’un individu (ex/ mostra tumoral) observem un marcador es troba en homozigosi (o hemizigosi) quan en el teixit normal de l’individu, el marcador s’hi troba en heterozigosi.
La LOH és un marcador de pronòstic.
En el retinoblastoma, una persona normal pot ser que perdi un al·lel i s’iniciï un procés tumoral Mecanismes que poden produir LOH: - No disjunció à aneuploidia Disomia uniparental (dos cromosomes del mateix origen) Recombinació mitòtica Conversió gènica Deleció Mutació puntual Per tant la LOH no indica que s’hagi hagut de perdre físicament l'al·lel salvatge, per exemple, si es dona una mutació puntal, l’al·lel salvatge no es perd, però si la seva funció. Igual si hi ha LOH no significa que hagi d’afectar a al·lel normal.
La LOH és un indicador de risc/pronòstic, però en cap cas ens diu exactament què ha passat i quin gens s’ha perdut. Si hi ha LOH, el risc que s’hagi perdut la funció és major.
Marcadors polimòrfics de la regió 17p (p53): Carcinoma de colon-recte En alguns casos, hi ha situacions en que uns marcadors d’una regió han perdut la heterozigosi però altres de la mateixa regió no. Això pot ser per recombinació mitòtica, és a dir, es donarà un intercanvi entre cromosomes homòlegs que només afectarà a unes regions.
22 DGM- Tema 3 mfiguls Inclús ens podem trobar en situacions com la que es mostra a les següents electroforesis.
En aquestes, B, es el teixit normal, i T el teixit tumoral. El que podem veure és que en alguns casos hi ha pèrdua d’heterozigosi ja que es veuen canvis d’intensitat entre les bandes. En tots els casos, si comparem B amb T, hi ha una pèrdua d’intensitat en una de les bandes de T.
Però, perquè segueix apareixent una banda, encara que sigui menys intensa? Això es perquè en el teixit tumoral també hi ha cèl·lules normals, pel que seran les culpables que aquesta banda encara aparegui en el carril T. Aquestes bandes menys intenses poden confondre els casos de LOH.
23 ...