T.11- Stem cell diferentiation (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Ciencias Biomédicas - 4º curso
Asignatura Estratègies Terapèutiques
Año del apunte 2016
Páginas 9
Fecha de subida 02/10/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Estratègies terapèutiques TEMA 11. STEM CELL DIFERENTIATION Cèl·lules mare pluripotents aplicacions: - Estudis de desenvolupament - Desenvolupament de drogues - Estudis toxicològics - Teràpia cel·lular Es diferencien in vitro.
Factors to consider: intrinsic and extrinsic factors Si injectem els factors extrínsecs la cèl·lula es regularà per ella mateixa.
Extrinsic factors: reproducing the niche El nínxol és un microambient que envolta la cèl·lula. Les interaccions amb aquest microambient influencia el destí de la cèl·lula.
100 Estratègies terapèutiques Com obtenir el tipus de cèl·lula que volem? - Entendre els processos de desenvolupament in vivo.
- Extreure informació d’estudis de desenvolupament - Quines vies de senyalització són importants en cada estadi? - Identificar els factors de transcripció claus (induïts per l’activació de la via de senyalització - Quins gens s’expressen i quan? Factors que no es consideren en el cultiu cel·lular - En els cultius els nivells d'oxigen són entre 3-5%, no són el 21% que és en el ambient normal. En situacions d'hipòxia es produeixen alguns factors extrínsecs.
- Algunes longituds d'ona poden afectar a la diferenciació. P.e. la llum roja de 647nm augmenta la diferenciació osteogènica de les cèl·lules mare mesenquimals.
- 2D-3D: En un cultiu podem tenir una capa de cèl·lules que només interaccionen amb la matriu o diferents capes de cèl·lules que interaccionen entre elles. Podem tenir gels on les cèl·lules poden interaccionar entre elles i així tenim una visió tridimensional.
Factors difusibles - Factors de creixement- senyalització paracrina i autocrina - Hormones – senyalització endocrina. Una hormona del cervell pot passar a la sang i circular lluny del cervell.
- Productes metabòlics Tissue tension/stiffness Stifness of the surrouding tissue is transferred to a cell via the cytoeskeleton and converted into a biochemical signal.
Si es contreu el citoesquelet es solapen llocs d'unió i si s'estira el citoesquelet hi ha més llocs d'unió exposats.
HI ha cèl·lules mares pluripotents que només creixen en un ambient tou, altres en rígids o en vidre.
Matriu extracel·lular - Glicoproteïnes complexes secretades per les cèl·lules del voltant - Dona un suport estructural i bioquímic. Algunes proteïnes de la matriu tenen coreceptor per factors de creixement. Si la cèl·lula secreta un factor de creixement, aquest s’uneix a la matriu i fa que hi hagi una concentració més elevada d'aquest factor.
- Les cèl·lules s'estan constantment remodelant en la matriu extracel·lular. Si tenim unes proteïnes que no necessitem més, uns enzims les degraden i es reemplacen per les noves proteïnes que necessitem.
Densitat de les cèl·lules Quan tenim un cultiu, necessitem saber si les cèl·lules poden sobreviure en poc espai i estant apretades (contacte cèl·lula -cèl·lula) o si necessiten molt espai per créixer.
Tipus de cèl·lules diferents Alguns cops volem un cultiu on tinguem totes les cèl·lules del mateix tipus. Algun cop necessitem més d'un tipus cel·lular per fer créixer les cèl·lules que volem.
Per exemple, si volem fer un co-cultiu d'astròcits i neurones necessitarem diferents tipus de cèl·lules juntes en 101 Estratègies terapèutiques un mateix cultiu.
From stem cells to especific cell type HI ha diferents tipus de senyals. Un co-cultiu és una combinació d'aquests de senyals paracrins i físics.
Extracelullar signals to intracellular response Hi ha mols fàrmacs que poden inihibir o activar vies de senyalitzaicó.
Cascades de senyalització El factor de transcripció A activa el factor B i aquest activa el C. El factor B inhibeix el factor A i el factor C inhibeix el factor B.
Malaltia de Huntington La malaltia de Huntington està produïda per una mutació específica en el gen de la huntingtina. Es produïda per una expansió dels triplets CAG en el gen de la huntingtina. En les persones sanes hi ha menys de 35 copies, si en tens més tindràs la malaltia de Huntington i com més repeticions més greu. És una malaltia neurodegenerativa però no afecta només a persones grans, també pot afectar a adolescents segons les repeticions que es tinguin.
Els símptomes apareixen entre els 35 i els 45 anys. Com més copies té la persona, abans debutarà amb la malaltia. Les repeticions entre 36-39 tenen una penetrança variable, hi ha persones que poden estar afectades amb aquest nombre de repeticions i altres persones no.
L’expansió de més de 60 CAG porta a tenir la malaltia abans dels 20 anys (huntington juvenil). Entre el 1-2% dels casos, més repeticions que 60 porten a debutar en la malaltia abans dels 10 anys d’edat.
Símptomes: disminució de la funció cognitiva, dismotilitat orofaringia (dificultat a l’engolir), disminució de les funcions motores fines i precises, parkinsonisme, convulsions En la patofisiologia trobem atrofia de l’estriat i degeneració de les neurones medials espinals.
102 Estratègies terapèutiques La majoria de cèl·lules que es moren són les neurones GABAèrgiques de l'estriat i també es produeix un augment del volum del ventricle.
Les neurones que es moren són les medium spiny neurones que expressen el factor de transcripció CTIP2 i la proteïna DARPP-32.
Connexions MSN (mèdium spiny neurons) Les neurones medials van a l'estriat i a partir d'allí envien els seus axons a molts llocs més i per tant si estan afectades, estarà afectat molta part del cervell.
103 Estratègies terapèutiques Cell replacement strategy for Huntington’s disease Differentiation Generar neurones estriatals tarda entre 80-100 dies. Si als ratolins malalts se'ls injecta les neurones al començament sembla que es recupera però després empitjoren.
Algunes de les neurones injectades és diferencien a neurones medials però altres neurones comencen a créixer molt i formen un tumor en el ratolí.
En un cultiu hem de reproduir el procés de desenvolupament per produir la diferenciació de les `cèl·lules mare.
104 Estratègies terapèutiques From stem cells to specfiic cell type Senyalització La inhibició dels receptors de Smad dóna una diferenciació més eficient i ajuda a millorar els primers estadis de la diferenciació.
Podem aprendre dels estudis de desenvolupament. Si mirem al cap tenim una concentració baixa de Wnts que va augmentant a mesura que avancem cap als peus.
Si agafem una secció coronal del cervell veiem que en la part dorsal tenim Wnts i a la part ventral tenim Shh.
Així poem decidir si volem injectar algun factor que potenciï els Wnt o el Shh en el desenvolupament.
Factors de transcripció Diferents factors de transcripció són importants en diferents temps durant el desenvolupament.
105 Estratègies terapèutiques Desenvolupament de les neurones estriatals Quan s'està formant l'estriat tenim dos tipus de cèl·lules. Tenim un 95% de neurones de projecció i un 5% d'interneurones.
Les interneurones provenen de la eminència ganglionar mitjana i van al MZ.
106 Estratègies terapèutiques Recapitulation of development for stem cell diferentiation: transcription factors Diferents factors de transcripció i diferents combinacions especifiquen diferents vies de desenvolupament. En el LGE necessitem Gsh2 però no volem Nkx2.1.
Ikaros s’expressa selectivament en l’eminència gangliónica lateral Això són imatges de histoquímica.
Ikaros-1 és necessari pel desenvolupament de les projeccions de les neurones estriatals Van fer un ratolí mutant que no expressava Ikaros i vam veure que està involucrat en el desenvolupament de les neurones de projecció estriatals ja que hi havia una gran disminució en el ratolí mutat. I també hi havia una disminució en les neurones medials espinals.
Helios s’expressa en la zona subventricular i MZ en el LGE Estan en la zona Mz que en la subventricular.
L’helios indueix la diferenciació de les neurones espinals medials de l’estriat en cultius primaris.
Overexpression Imaginem que el Ikaros és el factor A i que sempre està expressat, s'expressa el factor B però aquest factor B no pot fer feedback negatiu al factor A i el factor B anirà produint el factor C.
107 Estratègies terapèutiques SI sobre expressem el Gsx2 en les cèl·lules mare, les cèl·lules mare es col·lapsen perquè no paren de produir Gsx2 i per tant sempre es queden en el mateix estadi de diferenciació. Les cèl·lules no es diferencien ni es proliferen, es mantenen vives i ja està perquè rebien senyals d'un estadi de diferenciació concret.
Lentiviral inducible Ikaros expression system El promotor CAG està sempre activat expressant el gen lentivirus 1 i per tant fent la proteïna rtTA.
Encara que tinguem els dos lentivirus, si no tenim la doxiciclina no tindrem expressió.
La doxiciclina s'uneix amb la proteïna i llavors es poden unir al promotor i així s'expressen les proteïnes Ikaros, T2A i mCherry.
TET-OFF: està sempre activat el sistema i quan posem la doxiciclina es para.
TET-ON: està desactivat el sistema si no hi posa doxiciclina.
Functional cells Perquè expressin els marcadors les cèl·lules han de ser funcionals.
Aplicacions de les cèl·lules mare embriòniques Teràpia cel·lular: - Reemplaçament, reparació de cèl·lules danyades o delivery de gens o agents - Diferenciació de les cèl·lules - Selecció de les cèl·lules diferenciades (es treuen les cèl·lules embrióniques mare no diferenciades) - Trasplantament, supervivència, integració i restauració de la funcionalitat Dendritic branching of transplanted cells suggests terminal differentiation into mèdium spiny neurons Infectem les cèl·lules amb lentivirus i després les trasplantem a l'estriat d'un ratolí durant 3 mesos i després sacrifiquem el ratolí i veiem que hi ha neurones per tant els precursors que vam injectar es van diferenciar.
Les IPSCs diferenciades projecten al globus pàl·lid.
108 ...

Comprar Previsualizar