DGM- Tema 7. Quantificació per PCR (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 6
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 9
Subido por

Vista previa del texto

DGM- Tema 7 mfiguls TEMA 7: Quantificació dels àcids nucleics per PCR Per PCR podem distingir: - Mutacions - Variacions en l’estat de metilació - Quantificar La QUANTIFICACIÓ per PCR pot ser per: - PCR convencional - PCR a temps real - PCR digital 1. Quantificació per PCR convencional: En la fase exponencial de la PCR, podem quantificar el nombre de molècules en un moment determinat (cicle n) a través de la següent equació: n Q= m(1+E) Però això només és aplicable a la fase exponencial.
• Segons la quantitat de molècules de les que partim, observarem diferencies en el creixement exponencial o Si a l’inici en tenim més, tardarem menys a assolir el punt mig del creixement exponencial.
Si la eficiència fos 100%, les corbes seran el doble, la meitat... Però això nomes passa a la fase exponencial.
o No obstant, partint de la mateixa quantitat de DNA podem obtenir una quantitat final de productes diferent (segons com s’ha donat la PCR, la Taq...), tot i que la fase exponencial haurà sigut igual.
o Si partim de diferents quantitats de DNA, també obtenim diferents quantitats finals (podem haver començat amb n molècules i tenir-ne més que si hem començat amb 2n).
No és viable analitzar el producte final per quantificar! Ara bé si analitzem la fase exponencial, és una mica més precís. Les PCR semiquantitatives paren la PCR en la fase exponencial i analitzen el producte que hi ha en diferents PCR’s, però això no és fiable.
Per tant la PCR convencional no serveix per quantificar. (no l’explicarem) 1 DGM- Tema 7 mfiguls 2. Quantificació per PCR a temps real: És molt més precisa que la PCR convencional.
Una de les coses que s’ha afegit als termocicladors per la PCR són sistemes de lectura òptica, de manera que permeten seguir el procés d’una PCR en temps real.
El seguiment es pot fer a través de colorant fluorescents amb afinitat pel DNA en doble cadena, per tant, com més DNA de doble cadena hi hagi, més fluorescència. Per tant, el sistema òptic haurà de permetre llegir la quantitat de fluorescència al llarg del temps de cadascun dels dials on es produeix la PCR.
Necessitem: - Font d’il·luminació: que excitarà els fluorocroms. Pot emetre una o diferents longituds d’ona - Sistema de lectura de la fluorescència: amb lents diferents per llegir diferents longituds d’ona Detecció del DNA per SYBR Green I: El primer colorant utilitzat va ser Bromur d’Etidi, però actualment s’utilitza el SYBR green I, que s’uneix al DNA en el solc menor de la doble hèlix.
Aquest emet molta més fluorescència quan està unit al DNA que no pas quan està sol (no és un agent intercalant), per tant, a la fluorescència que llegim de la PCR li haurem de restar la fluorescència que emet de manera lliure. (s’ha de fer com un blanc) El SYBR Green és molt estable (únicament per un 6% d’activitat al llarg de 30 cicles d’amplificació) Lectura fluorescència La lectura de la fluorescència no és contínua, perquè sinó aniríem veient pujades i baixades de fluorescència. Simplement al programa li indiquem el moment on ha de fer la lectura, normalment cap al final de la fase d’extensió de cadascun dels cicles.
Si la quantitat de DNA es va duplicant, la lectura de fluorescència també ho farà.
Hem de tenir en compte que la fluorescència als primers cicles casi no es detectarà perquè el nivell de fluorescència està per sota el nivell de resolució del lector. A partir d’un moment determinat sí que començarem a veure fluorescència.
2 DGM- Tema 7 mfiguls Quantificació En cada dial podem tenir diferents quantitats inicials de DNA, però no existeix una relació lineal entre quantitat inicial de DNA i la quantitat final. Ara bé, si mirem la fluorescència a l’inici, les primeres corbes que comencen a créixer son les que tenen més DNA inicial.
- Hem d’escollir un DINTELL (treshold), a partir del qual començarem a quantificar - El cicle en què posem el dintell de fluorescència, està per sobre el nivell de resolució i està relacionat directament amb la quantitat inicial de DNA. És a dir, el cicle on posem el dintell sí que ens pot indicar la quantitat inicial de DNA, de manera que aquest s’utilitza per quantificar.
La fluorescència es pot representar a escala logarítmica, llavors, ens apareixerà una recta, que serà més fàcil d’analitzar.
El dintell de fluorescència que considerarem en la PCR el triem nosaltres (és arbitrari), però no ha d’estar per sota el nivell de resolució del sistema. Si definim un altre dintell, les diferències entre cicles es mantindran.
Per poder estimar la quantitat de còpies inicials (m) hem de saber la quantitat de copies en un cicle determinat. La quantitat de fluorescència ens determina la quantitat de DNA en un cicle. Per tant, com que en la representació gràfica tenim Q i n, podem calcular m (quantitat inicial de molècules). L’eficàcia de la PCR s’obté del pendent de la recta (a escala logarítmica). Com més alt sigui el pendent, més eficaç és la tècnica.
! 𝟏 𝑬 = 𝟏𝟎 𝒑𝒆𝒏𝒅𝒆𝒏𝒕 − 𝟏 pendent ideal, 3,3.
Es considera una eficàcia bona si es mou entre 0.9 - 1.0 - 3 DGM- Tema 7 mfiguls Ara bé, necessitem un punt de referència per determinar el patró de fluorescència base. Les cases comercials ofereixen patrons de calibració del DNA , que son un estàndar de concentracions molt ben calibrades. Sobre aquests s’ha de fer una PCR per determinar la quantitat de fluorescència que correspon a X quantitat de DNA. Sobre la recta que obtenim en aquest patró de calibració, determinem el dintell i ja podem fer les altres PCR.
- Sempre que els valors de les PCR analitzades es trobin dins els valors de la recta del patró, les PCR seran correctes i les quantificacions bones, si els valors son més grans o més petits, les mesures no són bones.
La quantificació pot ser: - ABSOLUTA: necessitem els patrons de DNA.
o Contaminacions víriques o bacterianes o Presència de transgens - RELATIVA: no necessitem patrons de DNA sinó gens de referència (gen constitucional) com a control per normalitzar es ades. Ens permet veure o Expressió diferencial entre teixits o Expressió diferencial en resposta a un fàrmac L’expressió del control endogen no varia entre mostres comparades: • • • GAPDH β-Actina Subunitat ribosomal de 18S Ex/ Variació de l’expressió en resposta a un fàrmac (quantificació relativa) - Imaginem que utilitzem un gen constitucional, que talla al cicle 16, i el gen que s’analitza amb fàrmac, talla al 17 (hi ha un cicle de diferència entre els dos). Per tant, si l’eficiència és 1, el gen s’expressa 2 vegades més. (21) - Però si sense fàrmac talla al 21, s’expressa 16 vegades més. (24) Per tant, en aquest cas, el fàrmac redueix 8 vegades l’expressió del gen.
Formació de dímers d’encebadors: En molts casos trobem que quan fem la PCR, observem la corba corresponent a X nombre de copies i el control també creix (tot i que té 0 còpies de DNA), quan esperaríem que hi hagués una recta.
Això ens indica que s’està amplificant el dímer d’encebadors (inespecificitat).
4 DGM- Tema 7 mfiguls Anàlisi de les corbes de fusió Quan se’ns van dímer d’encebadors se’ns alteren els resultats. Per eliminar aquesta inespecificitat fem servir corbes de fusió.
A la PCR li afegim un pas més; 1. Incrementem la temperatura(95ºC) per desnaturalitzar tot el que hi ha 2. Baixem la temperatura per sota la temperatura de fusió esperada, de manera que permetem la renaturalització 3. Finalment incrementem gradualment la temperatura (augment d’uns 0,2 ºC/sec) en el que es fa un seguiment de la emissió fluorescent.
A partir del moment en què incrementem la temperatura (pas 3) li diem al lector que faci una lectura contínua de fluorescència.
La corba que ens apareixerà anirà decreixent, i hi haurà un punt en que baixarà de cop. Però si enlloc de representar la quantitat de fluorescència, representem la variació de fluorescència per unitat de temps, la corba es transforma en una altra amb un pic, que correspon a la Tm.
Però si en aquesta corba surten dos pics, és perquè s’han amplificat dos productes, cadascun d’ells amb una Tm diferent. Si mirem les corbes que corresponen al control veurem que hi ha un pic que coincideix en ambdós casos i es el dels dímers d’encebadors (té un pic inferior al del producte amplificat).
Imaginem que la Tm dels encebadors és a 78ºC i la dels productes a 89ºC.
Per evitar llegir els dímers d’encebadors, es tracta de redissenyar la PCR: introduïm una quarta etapa.
4. A la fase d’extensió pujarem a 84 ºC i llegirem la fluorescència, de manera que el que hem fet és desnaturalitzar el dímer d’encebadors, i la lectura correspon totalment al producte (no hi ha dímers). Així aquesta lectura és la fiable.
Avantatges PCR a temps real: - Sensibilitat Resultats quantitatius Temps de reacció : són rapides No hi ha passos posteriors Es un sistema tancat, pel que generalment no hi ha contaminació 5 DGM- Tema 7 mfiguls 3. Quantificació per PCR digital (dPCR): - H ha en el mercat diferents sistemes o Microfluids § Microcanals, micropouets, microgotes...
Permet la quantificació absoluta, sense corbes de calibració Més sensible i precisa que la PCR a temps real, però també més cara o Podem detectar menys d’un 1% de còpies d’una seqüencia determinada en una mescla de molècules de DNA Droplet digital PCR: La mostra de DNA i els components de la reacció de PCR es separen en microcompartiments (microgotes) obtingudes per la mescla de dos líquids immiscibles.
Detectarem bàsicament si hi ha amplificació o no (la quantitat d’amplificació no ens importa).
Per detectar-lo farem servir el fluorescent SYBR green.
Normalment fem servir aquesta PCR per analitzar algun àcid nucleic en poca quantitat. Si hi ha molt poca quantitat de DNA, en general la majoria de gotes, no s’hauran amplificat (no tindran DNA) alguns tindran una copia i molt rarament en tindran dues.
El nombre de còpies segueix una distribució de Poisson.
Un cop fetes les PCR, les microgotes es passen per un tub que llegeix la fluorescència.
Tindrem: - Microgotes negatives (amb una mica de fluorescència perquè el fluorocrom emet una mica) - Microgotes positives Com que segueixen una distribució de Possion, la M, mitjana de còpies per gota, serà: 𝑴 = − 𝒍𝒏 𝟏 − 𝒑𝒐𝒔𝒊𝒕𝒊𝒖𝒔 𝒏𝒆𝒈𝒂𝒕𝒊𝒖𝒔 (mirar l’altra equació, no l’hem de saber) 6 ...