8. Protocols d'analisi citogenetics (2012)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura citogenetica
Año del apunte 2012
Páginas 2
Fecha de subida 07/11/2014
Descargas 2
Subido por

Vista previa del texto

TEMA  8:  GENERALITATS  DELS  PROTOCOLS  D’ANÀLISI  CITOGENÈTICS   CITOGENÈTICA   1.  CULTIU  CEL·∙LULAR   -­‐  Medi  de  cultiu:  té  allò  que  la  cèl·∙lula  necessita  per  reproduir-­‐se.   -­‐  Cultiu  primari:  a  partir  d’una  biòpsia  o  suspensió  cel·∙lular.   -­‐  Cultiu  secundari:  procés  de  subcultiu.   2.  MITÒGEN   Substància  que  estimula  el  creixement:  fitohemaglutinina,  concavalina  A  o  pokeweed.   3.  INHIBIDORS  ANAFÀSICS   Amb  l’objectiu  de  tenir  cèl·∙lules  en  metafase,  s’usen  substàncies  que  aturen  l’anafase.   Generalment  actuen  contra  la  polimerització  dels  microtúbuls:  colxicina,  colcemida...   Quan   s’utilitzen   aquests   compostos   els   cromosomes   s’observen   més   curts   i   amb   les   cromàtides  més  separades,  un  estat  anomenat  c-­‐mitosi.   4.  SINCRONITZACIÓ  CEL·∙LULAR   Si  volem  cèl·∙lules  en  una  fase  concreta  cal  saber  molt  bé  el  timing  de  divisió  cel·∙lular:   s’usen   drogues   que   interfereixen   en   la   síntesi   de   desoxiribonucleòtids   trifosfat,   que   aporten  el  material  necessari  per  la  síntesi  de  DNA.     L’excés  de  timidina,  l’ús  del  metotrexat  o  la  fluorodesoxiuridina  bloquegen  la  fase  S  i,   un  cop  en  retirem  les  substàncies,  totes  les  cèl·∙lules  inicien  la  fase  S,  per  això  és  vital   conèixer  el  timing  del  cicle  cel·∙lular,  per  poder  aturar  el  cicle  quan  ens  interessi.   5.  SOLUCIÓ  HIPOTÒNICA   Les  solucions  hipotòniques  (NaCl  al  0,9%  o  KCl  0,075  M)  incrementen  el  volum  cel·∙lular   (turgència)  facilitant  el  trencament  cel·∙lular  i  la  dispersió   dels   cromosomes.  En  canvi,   les  solucions  hipertòniques  trenquen  la  cèl·∙lula  per  plasmòlisi  (no  dispersió).   6.  FIXACIÓ  CEL·∙LULAR   Tractament   destinat   a   mantenir   la   mostra   inalterada.   El   fixador   més   habitual   és   el   Carnoy   (3   parts   de   metanol   +   1   d’àcid   acètic):   l’àcid   acètic   produeix   un   canvi   a   pH   baix   que   produeix   la   desnaturalització   de   proteïnes,   mentre   que   el   metanol   produeix   la   deshidratació  substituint  l’aigua  de  les  cèl·∙lules  per  metanol.   Un  cop  ha  actuat  el  fixador,  cal  fer  l’extensió  dels  cromosomes  sobre  portaobjectes  de   vidre.  Els  grups  OH  del  vidre  són  hidrofílics  i  de  càrrega  negativa,  que  interacciona  amb   la   negativa   del   DNA,   fent   que   la   repulsió   de   càrregues   faciliti   l’extensió   dels   cromosomes.   Com   més   negativa   es   la   superfície   del   porta,   més   dispersió   dels   cromosomes,  per  això  hi  ha  diversos  mètodes  per  incrementar-­‐la  (fred,  fregament...).       TEMA  8:  GENERALITATS  DELS  PROTOCOLS  D’ANÀLISI  CITOGENÈTICS   CITOGENÈTICA   7.  MÈTODES  DE  PREPARACIÓ  D’EXTENSIONS  CROMOSÒMIQUES   La   tria   de   la   tècnica   depèn   de   la   possibilitat   de   repetir   l’anàlisi,   de   la   quantitat   de   cèl·∙lules  de  què  disposem  (hi  ha  pèrdua  de  material)  i  de  la  informació  que  volem.   a)  Assecament  a  l’aire   Partim   d’una   suspensió   de   cèl·∙lules   fixades   amb   la   membrana   cel·∙lular   malmesa.   S’agafa   una   gota   de   la   suspensió   i   es   deixa   caure   sobre   el   vidre,   aquest   impacte   fa   que   la  membrana  es  trenqui,  i  els  cromosomes  quedin  disposats  a  sobre  de  la  superfície.   S’obtenen   preparacions   de   llarga   durada   en   les   que   es   poden   aplicar   tècniques   d’identificació  cromosòmica.   b)  Aixafament  o  squash   S’usa   en   teixits   amb   una   alta   taxa   de   divisió   (???).   S’aixafa   la   mostra   sobre   un   portaobjectes.   Prèviament   es   poden   usar   solucions   hipotòniques   per   provocar   turgència.  Posteriorment  es  tenyeix  la  mostra  per  observar  els  cromosomes.   ...