Apunts dels temes 1, 2 i 3 (1r parcial) de Biologia Molecular i Genòmica (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular i Genomica
Año del apunte 2014
Páginas 56
Fecha de subida 03/02/2015
Descargas 76
Subido por

Descripción

Apunts dels 3 primers temes de Biologia Molecular i Genòmica.

Vista previa del texto

Pla Docent 1. Anatomia del genoma 1.1. El DNA com a material genètic 1.2. Flux de la informació genètica 1.3. Nucleòtids i polinucleòtids 1.4. La doble hèlix 1.5. Genoma procariota 1.6. Anatomia del genoma eucariota 1.7. DNA nuclear i organular 1.8. DNA repetitiu 1.9. Genotip. Fenotip. Dominància 2. Replicació del genoma 2.1. Topologia del DNA. DNA-topoisomerases 2.2. El procés de replicació: iniciació, elongació i terminació 2.3. Telòmers 2.4. Replicació del genoma i divisió cel·lular 2.5. Mutacions i reparació del DNA 2.6. Recombinació 3. Inici de la transcripció 3.1. Transcripció. Encaix del complex d’iniciació en procariotes i en eucariotes 3.2. RNA-polimerases 3.3. Control de l’inici de la transcripció en procariotes 3.4. Operons. Control positiu i control negatiu 3.5. Control de l’inici de la transcripció en eucariotes 3.6. Activadors. Interacció entre els factors de transcripció i el complex de preinici. Repressors de la transcripció eucariota 3.7. Control de l’activitat dels factors de transcripció 3.8. Accessibilitat del genoma: la cromatina i l’expressió gènica 4. Síntesi i processament de l’RNA 4.1. Tipus d’RNA 4.2. Síntesi d’RNA en bacteris. Elongació. Terminació. Antiterminació. Atenuació 4.3. Síntesi d’mRNA en eucariotes. Càping. Elongació. Terminació i poliadenilació Biologia Molecular i Genòmica 4.4. Eliminació d’introns o empalmament (splicing) 4.5. Síntesi i processament d’RNA no codificant 4.6. Edició d’RNA (RNA editing) 4.7. Transport i degradació d’RNA 5. Síntesi i processament del proteoma 5.1. Paper del tRNA en la síntesi de proteïnes 5.2. Interacció codó-anticodó 5.3. El codi genètic 5.4. Estructura dels ribosomes 5.5. Inici, elongació i terminació en procariotes i en eucariotes 6. Processament posttraduccional 6.1. Plegament. Xaperones 6.2. Processament proteolític 6.3. Modificacions químiques. Inteïnes 6.4. Recanvi 6.5. Direcció de les proteïnes a la seva destinació 7. Regulació de l’activitat del genoma 7.1. Canvis transitoris en la resposta a senyals 7.2. Transmissió de senyals a través de receptors de membrana 7.3. Senyals que travessen la membrana 7.4. Canvis permanents en l’activitat del genoma 7.5. Diferenciació. Proliferació. Desenvolupament 8. Programa de seminaris 8.1. Tècniques bàsiques de manipulació del DNA: enzims de restricció, vectors de clonatge, hibridació, sondes 8.2. Seqüenciació 8.3. Ús de bancs de dades 8.4. PCR. RT-PCR 8.5. Anàlisi massiva de l’expressió gènica. Arrays 8.6. Estudi del control de l’expressió gènica 8.7. Transgènics i clònics 8.8. Teràpia gènica. RNA d’interferència i antisentit Biologia molecular i genòmica TEMA 1. Estructura del DNA ANATOMIA DEL GENOMA EL FLUX DE LA INFORMACIÓ GENÈTICA Les molècules de DNA d’un organisme s’organitzen en forma de cromosomes, i en conjunt constitueixen el seu genoma. Totes les cèl·lules no expressen el mateix número de gens, sinó que depèn de la funció de cada cèl·lula. Entre diferents espècies també trobem un número diferent de gens. Els gens són les unitats funcionals: són porcions específiques del genoma que contenen la informació necessària per produir una molècula d’RNA o una cadena polipeptídica funcional. Entre altres funcions, l’RNA participa en el flux de la informació genètica com a molècula codificadora intermediària entre el DNA i la proteïna.
A la replicació, obtenim ADN a partir d’ADN.
A la transcripció, obtenim RNA a partir d’ADN.
Les cèl·lules com les del cabell, les mucoses, la medul·la o les ungles s’estan replicant constantment, però les altres estan aturades, ja que es troben en estat G0 del cicle cel·lular. És a dir, la majoria de les cèl·lules de l’organisme NO estan constantment replicant-se.
Igual que el conjunt de cromosomes forma el genoma, el transcriptoma és el conjunt de tots els RNAs transcrits en un teixit, i el proteosoma és el conjunt de totes les proteïnes d’un teixit.
ESTRUCTURA BÀSICA DELS NUCLEÒTIDS Els àcids nucleics són polímers lineals de nucleòtids. Els nucleòtids estan formats per: base nitrogenada + fosfat + sucre.
Biologia Molecular i Genòmica  Hi ha dos tipus de sucre, la ribosa, utilitzada en el RNA i que té un OH i la desoxiribosa, que forma part del DNA i té un H.
S’uniran, pel carboni 5, al fosfat; pel carboni 3 a un altre nucleòtid i per l’OH del carboni 1, que té un enllaç N-glucosídic, a la base nitrogenada.
 Les bases nitrogenades són molècules heterocícliques amb àtoms de nitrogen, derivades de la purina i la pirimidina.
DNA -purines: A, G -pirimidines: C, T RNA -purines A, G -pirimidines: C, U Les bases no s’uneixen entre si, sinó que s’uneixen a través dels sucres, mitjançant l’enllaç N-βglicosídic, i NO mitjançant un enllaç covalent. Les purines tenen conformació syn o anti de l’enllaç Nβ-glicosídic. Les pirimidines només tenen conformació anti.
Biologia Molecular i Genòmica Podem trobar bases modificades que es troben: Al DNA -Formes metilades: -Formes desaminades per mutació espontània: Al RNA: Són típiques del tRNA uracil hipoxantina tiouracil Propietats fisicoquímiques de les bases:      Són bases febles Són molècules planes Absorbeixen llum al UV (260 nm) Són hidrofòbiques i relativament insolubles en aigua a pH fisiològic, encara que els O i N poden formar ponts d’hidrogen.
Presenten tautomeria: Amino (-NH2) – imino (=NH) Ceto (=O) – enol (-OH) Lactama - lactima Biologia Molecular i Genòmica  Grup fosfat. En el DNA o RNA, el nucleòtid és monoP, però suelto el podem trobar fins i tot amb 3P.
Com que el fosfat és negatiu, li dóna càrrega al DNA i polaritat. Per tant podem dir que el DNA té càrrega negativa.
Els nucleòsids trifosfats, NTPs i dNTPs, són molècules precursores en la síntesi dels àcids nucleics.
Els nucleòsids monofosfats, NMPs i dNMPs, són els monòmers constituents dels àcids nucleics.
L’ATP és un ribonucleòsid.
Amb aquests tres elements hem format un nucleòtid. Les seves propietats fisicoquímiques i funcions són: PROPIETATS Són hidrofílics (polars a causa del sucre i el fosfat) Absorbeixen UV Són àcids a pH fisiològic, a causa de la càrrega negativa que li ofereix el fosfat FUNCIONS Transport d’energia Unitats de reconeixement Són les molècules reguladores i senyalitzadores del metabolisme cel·lular.
NUCLEÒSIDS Un nucleòsid és la unió de la base nitrogenada amb el sucre. Quan li afegim el grup fosfat, el convertim en un nucleòtid.
ESTRUCTURA PRIMÀRIA DELS ÀCIDS NUCLEICS: POLINUCLEÒTIDS I ENLLAÇ FOSFODIÈSTER Els àcids nucleics són cadenes llargues formades per nucleòtids units covalentment (enllaços 3’-5’ fosfodièster entre OH del 3’ del 1r nucleòtid amb el fosfat en 5’ del següent nucleòtid, de forma lineal).
L’estructura primària de l’ADN és la seqüència dels nucleòtids.
L’esquelet lineal, constant (les pentoses i els fosfats que es van alternant en la cadena) té una funció estructural.
La seqüència de bases púriques i pirimidíniques, variable (unides a intervals regulars a l’esquelet lineal mitjançant sucres) codifica la informació genètica.
La seqüència dels nucleòtids a l’ADN va de 5’ a 3’.
La seqüència dels nucleòtids a l’ARN va de 3’ a 5’.
Biologia Molecular i Genòmica MOTIUS ESTRUCTURALS   Permeten la unió proteïna – DNA: o Dits de zinc: Zinc unit a 4 aa de la proteïna de dues maneres diferents: 2 cys i 2 his 4 cys El zinc no toca el DNA o Hèlix – volta – hèlix Volta de 20 aa o Homeodomini Més o menys igual que l’anterior però més gran, de 60 aa Permeten la unió proteïna – proteïna: o Cremallera de leucines o Hèlix – llaç - hèlix Biologia Molecular i Genòmica ESTRUCTURA SECUNDÀRIA DEL DNA És el primer nivell d’estructura tridimensional que adopten les cadenes del DNA. El DNA és polimòrfic, flexible, dinàmic i deformable.
Hi ha quatre models estructurals secundaris:  MODEL B-DNA: Està format per dues cadenes antiparal·leles de polinucleòtids. Són cadenes complementàries que interaccionen per ponts d’hidrogen entre parells de bases.
Les interaccions són entre purines i pirimidines.
La base nitrogenada es situa a la cara de dintre i el fosfat a la cara de fora.
Regles d’aparellament de bases: Chargaff La composició de bases del DNA és característica de cada espècie.
El DNA aïllat de teixits diferents procedents de la mateixa espècie té la mateixa composició de bases. El DNA és igual a totes les cèl·lules.
La composició de bases del DNA d’una espècie no varia amb l’edat de l’organisme, estat nutricional o els canvis mediámbientals.
En la majoria de DNAs, el contingut de purines és aproximadament igual al de pirimidines. El quocient (A+G)/(T+C) és aproximadament 1.
Característiques del model B-DNA: -És el model de la doble hèlix de Watson i Crick. Les dues cadenes formen una doble hèlix destrògira.
-Les bases, orientades cap a l’interior de l’hèlix, es disposen quasi perpendicularment a l’eix longitudinal de l’estructura i s’apilen paral·lelament entre si. Els esquelets lineals es situen en l’exterior de la doble hèlix.
-Té 10,4 parells de bases per volta.
-S’estabilitza per ponts d’hidrogen entre els parells de bases i per forces d’apilament dels anells (hidrofòbiques i de Van der Waals).
-És una doble hèlix asimètrica: té un solc major i un solc menor.
Biologia Molecular i Genòmica La formació d’un enllaç hidrogen requereix que els àtoms implicats es situin sobre una línea quasi recta (formant gairebé un pla). Els enllaços N-βglicosídics no es disposen totalment perpendiculars a l’eix longitudinal de l’hèlix (formen un angle de 60o). Es generen dos angles diferents entre els enllaços N-β-glicosídics complementaris (120o per un costat i 240o per l’altre).
Al formar-se la doble hèlix, l’angle de 120o genera un solc menor i el de 240o genera un solc major.
F F El SOLC MAJOR és un conjunt de 12 aa que interacciona amb proteïnes d’unió al DNA. El codi dels grups exposats en el solc major (AADH, HDAA, ADAM, MADA) permet el reconeixement específic per part de proteïnes interaccionants amb el DNA sense que sigui necessari obrir la doble hèlix.
El SOLC MENOR és un conjunt de 6 aa on s’uneixen les histones.
La doble hèlix del DNA permet múltiples conformacions. Les bases nitrogenades de cada parell de bases enfrontades poden fer un cert gir helicoïdal. Com a conseqüència, els solcs major i menor poden variar localment.
 MODEL A-DNA: -Forma afavorida in vitro per deshidratació (DNA “assecat” al laboratori) -Doble hèlix més compacta, curta i gruixuda amb 11 pb per volta.
-Dextrògira -En híbrids DNA – RNA; en plegaments secundaris RNA – RNA.
 MODEL Z-DNA: -Forma afavorida in vitro a altes concentracions de Na+.
-Doble hèlix més prima i llarga, amb 12 pb per volta.
-Plegament zig-zag de l’esquelet covalent -Levògira -En seqüències curtes on s’alternen pirimidines (en conformació anti) i purines (en conformació syn).
-Només 1 solc Biologia Molecular i Genòmica  MODEL H-DNA (triple hèlix de Hoogsten) Aquest model es forma partint de tres hèlix. Tres cadenes de DNA formen una triple hèlix. Es forma en regions on les cadenes contenen únicament purines (G,A) o pirimidines (C, T). La formació de l’estructura està afavorida “in vitro” per un medi àcid que promou la protonació de les citosines. “In vivo” la cadena senzilla pot interaccionar amb proteïnes. L’estructura s’estabilitza per enllaços de Hoogsten.
Biologia Molecular i Genòmica Hèlix A Hèlix B Hèlix Z Sentit Dextro Dextro (antihorari) Levo Bases per volta 11 10,4 12 Distància entre parells bases 2,6 A 3,4 A 3,7 a Repetició 28 A 36 A 45 A Diametre 26 A 20 A 18 A Alterna sin (G) i anti (C,T) Enllaç glucosídic Anti Solcs Un Gran (12 A): ric en G i C Petit (6 A): ric en A i T un In vitro [Na+] Condicions Deshidratació in vitro Híbrids DNA-RNA i RNA-RNA DNA/DNA poli(CG) metilació citosines DNA/DNA o RNA/RNA VARIACIONS ESTRUCTURALS EN ALGUNES SEQÜÈNCIES DE DNA    Repetició especular: repetició invertida a la mateixa cadena Repetició directa: repetició a la mateixa cadena.
Palíndrom: repetició invertida a la cadena complementària. Poden formar estructures en forqueta (hairpin) i cruciformes. Generen estructures autocomplementàries dins la mateixa cadena, i poden actuar com a senyals de reconeixement de moltes proteïnes reguladores de l’expressió gènica.
Poden fer-ho tant al RNA com al DNA.
Biologia Molecular i Genòmica ESTRUCTURES SECUNDÀRIES DEL RNA L’RNA és una cadena polinucleotídica senzilla. Adopta conformacions irregulars secundàries de tipus helicoïdal (A-DNA). Té més capacitat d’autocomplementarietat que el DNA: presenta aparellaments de bases addicionals.
Les estructures tridimensionals són complexes i particulars.
PROPIETATS FÍSICO-QUÍMIQUES DELS ÀCIDS NUCLEICS       Les cadenes dels àcids nucleics són hidrofíliques Són àcids amb moltes càrregues negatives a pH fisiològic Les solucions de DNA són molt viscoses; són molècules rígides i molt llargues respecte al seu diàmetre.
Absorbeixen llum al UV (260 nm) Són químicament molt estables, principalment el DNA.
Hidròlisi química: o Els enllaços fosfodièster i glicosídics del DNA i el RNA s’hidrolitzen per tractament amb àcids forts.
o Els àcids febles hidrolitzen únicament els enllaços glicosídics o La hidròlisi alcalina trenca els enllaços fosfodièster del RNA però no del DNA Biologia Molecular i Genòmica HIDRÒLISI DELS ENLLAÇOS FOSFODIÈSTER DE L’RNA MEDIADA PER OH- La desnaturalització o fusió del DNA és la separació de les cadenes.
La renaturalització o hibridació del DNA és l’associació de les cadenes.
ABSORCIÓ DE LLUM UV Efectes hipocròmic i hipercròmic del DNA: el DNA de cadena senzilla absorbeix llum UV més eficaçment que el DNA de cadena doble.
  Hipocromisme: disminució d’absorbància produïda en la formació del dúplex de DNA Hipercromisme: augment d’absorbància produïda en la desnaturalització del DNA DESNATURALITZACIÓ TÈRMICA DEL DNA La temperatura de fusió (tm) del DNA és la temperatura a la que el 50% de la molècula està desnaturalitzada.
Depèn de:      Espècie Longitud del DNA (a menor longitud, menor tm) pH (a pH extrems, menor tm) Força iònica (contingut de sals) Contingut de bases GC (s’incrementa proporcionalment al seu contingut en aparellaments GC) Els agents desnaturalitzants, in vitro, eliminen estructures secundàries i separen les dues cadenes del DNA:  Temperatura elevada: 95 – 100oC pel DNA Biologia Molecular i Genòmica   60 – 65 oC pel RNA Solucions alcalines (solucions diluïdes de NaOH pH=11) pel DNA Tractaments amb agents químics desnaturalitzants: -urea -formamida -formaldehid (és irreversible) ESTRUCTURES TRIDIMENSIONALS SUPERIORS DEL DNA SUPERENROTLLAMENT DEL DNA El superenrotllament del DNA és la doble hèlix enrotllada helicoïdalment sobre si mateixa formant una superhèlix.
Un exemple de DNA superenrotllat són els plàsmids, unes molècules petites de DNA circular tancat de doble cadena que estan en el citoplasma de molts bacteris. L’únic ADN circular que trobem en la nostra espècie és el mitocondrial.
Per conveni, el superenrotllament pot ser:   Positiu: indica més grau d’enrotllament. Es genera si la doble hèlix té mes voltes que el model relaxat.
Negatiu: indica menys grau d’enrotllament. Es genera si la doble hèlix te menys voltes que el model relaxat.
En els éssers vius les voltes superhelicoidals són negatives perquè la doble hèlix de DNA està parcialment desenrotllada: Té menys voltes que el model relaxat, B-DNA, de Watson i Crick Té més de 10,4 pb/volta Biologia Molecular i Genòmica Es genera superenrotllament en un DNA circular tancat si pateix tensió estructural:  Si es redueix el número de voltes de la doble hèlix del B-DNA (per desenrotllament en algun punt de la molècula) la tensió estructural provocada s’estabilitza provocant un superenrotllament negatiu.
El superenrotllament negatiu es dóna en tots els DNA cel·lulars i està estrictament regulat. A més, compacta el DNA però facilita la separació de les cadenes durant la replicació i la transcripció, ja que la doble hèlix està una mica desenrotllada.
 Si augmenta el número de voltes de la doble hèlix del B-DNA (per enrotllament) la tensió estructural provocada s’estabilitza provocant superenrotllament positiu.
PROPIETATS TOPOLÒGIQUES DEL DNA L’enllaç topològic és l’enllaç que manté unides dues cadenes de DNA circular tancat que no es poden separar sense trencament.
 El número d’enllaç Lk (linking number) és el número de vegades que les dues cadenes de DNA es creuen. És la suma de dos components geomètrics: Lk = T + W T (twist): nombre de girs de les cadenes W (writhe): nombre de torsions de l’eix de la doble hèlix   El Lk0 es el número d’enllaç del DNA relaxat La diferència d’enllaç, ∆Lk, permet determinar el grau de superenrotllament del DNA: ∆Lk = Lk - Lk0 Biologia Molecular i Genòmica TOPOISÒMERS DEL DNA Els topoisòmers són isòmers estructurals que tenen diferent número d’enllaç topològic (Lk). Són resultat dels diferents graus de superenrotllament del DNA. Els topoisòmers es poden transformar entre si mitjançant el tall d’una o les dues cadenes de DNA i posterior unió. També es poden separar entre si mitjançant una electroforesi.
TOPOISOMERASES Són enzims encarregats in vivo d’interconvertir els topoisòmers del DNA. Catalitzen el canvi en el nombre d’enllaç (Lk) del DNA.
S’encarreguen d’augmentar o disminuir el grau d’enrotllament del DNA: el relaxen o el superenrotllen.
També encadenen i desencadenen molècules de DNA circular. Són imprescindibles en la transcripció, replicació i compactació del DNA. Hi ha dos tipus principals:  Tipus I Trenquen únicament una de les cadenes del DNA i catalitzen la relaxació del DNA superenrotllat, en un procés termodinàmicament favorable.
Eliminen superenrotllament negatiu tant en procariotes com en eucariotes. Cada cicle catalític incrementa el Lk en una unitat (Lk + 1). Inhibidors de la topoisomerasa tipus I humana s’utilitzen com agents antitumorals.
 Tipus II En procariotes MECANISME DE LA DNA GIRASA (topoisomerasa tipus II de procariotes): Trenca les dues cadenes del DNA, generant superenrotllament negatiu, utilitzant l’energia d’hidròlisi de l’ATP. Ajuda a compactar el DNA després de la replicació.
Cada cicle catalític disminueix el Lk en dos unitats (Lk-2).
La topoisomerasa II bacteriana és la diana de molts antibiòtics.
En eucariotes Les topoisomerases II d’eucariotes no superenrotllament negatiu, però poden superenrotllament positius i negatius.
generen relaxar Eucariotes tenen topoisomerases tipus I i II que eliminen superenrotllament negatiu.
A diferència dels eucariotes, E. coli i tots els procariotes tenen una topoisomerasa tipus II (DNA girasa) que introdueix superenrotllament negatiu. La topoisomerasa I en procariotes també elimina superenrotllament negatiu.
Biologia Molecular i Genòmica Les topoisomerases de tipus I i II tallen cadenes de DNA mitjançant la formació d’un intermediari covalent entre un residu de tirosina i una cadena de DNA.
Tenen també altres importants funcions en el manteniment de l’estructura del DNA:    Encadenen i desencadenen molècules de DNA circular Desenreden els cromosomes lineals després de la replicació Desfan nusos del DNA generats en algunes reaccions de combinació TOPOISOMERASA I DNA GIRASA Qui la té? eucariotes i procariotes procariotes exclusivament Talla...
Talla 1 hebra Talla 2 hebres Lk (Lk + 1) (Lk – 2) Estructura monòmer monòmer Acció seqüencial seqüencial Unió al DNA entre tirosina i fosfat entre tirosina i fosfat Necessita ATP NO SI elimina introdueix camptotecina ciprofenxano Superenrotllament negatiu Inhibidors farmacològics Biologia Molecular i Genòmica EL GENOMA PROCARIOTA: COMPACTACIÓ DEL DNA D’ E. Coli El genoma és una molècula única de DNA de gran mida (4,6 · 10 6 pb), molt compactada i condensada en una zona central del citoplasma cel·lular. L’estructura del genoma es coneix com a nucleoide: és una doble hèlix circular unida a RNA i proteïnes formant 500 llaços o dominis d’unes 10 Kb cadascun, amb superenrotllament negatiu. Les proteïnes són de tipus histona, petites i generalment bàsiques (HU, 19 kDa).
Aquesta estructura en dominis:   Protegeix la informació gènica Augmenta el grau de compactació de la molècula GENOMA EUCARIOTA El grau de condensació del DNA varia en funció de les fases del cicle cel·lular. El màxim nivell d’empaquetament del DNA és el cromosoma, visible en el nucli en metafase. Quan les cèl·lules estan en interfase, el DNA està menys condensat, en forma de cromatina. En la fase S adopta el màxim nivell de descondensació.
Els cromosomes i la cromatina estan formats per DNA, proteïnes i una petita porció d’RNA.
HISTONES Les histones són les principals proteïnes, molt conservades evolutivament, constituents de la cromatina en els eucariotes. Estabilitzen l’estructura del DNA ajudant a compactar-lo. Són petites i bàsiques, carregades positivament a pH fisiològic, que interaccionen electrostàticament amb els fosfats del DNA. Tenen alt contingut en Lys i Arg.
Segons la fase del cicle cel·lular pateixen modificacions químiques que alteren la carrega elèctrica i regulen el grau de condensació del DNA i la transcripció: metilacions, acetilacions, fosforilacions, ADP-ribosilacions, glicosilacions, ubiquitinació...
Hi ha 5 tipus principals d’histones: H1, H2A, H2B, H3, H4.
MODIFICACIÓ DE LES HISTONES PER ACETILACIÓ 1. Acetilació: Afegir grups acetil (CH3COO-) amb l’enzim Histona acetil transferasa.
Típicament aa amb NH2 (bàsiques)  Lys, Rg i His, de normal tenen q(+) i en acetilar es perd i el DNA es desenganxa i obre.
2. Fosforilació: tb és covalent i es produeix en Ser i Thr s’obre el DNA 3. Metilació: en Lys, Arg i Hys. Tb és covalent i la q(+) i el DNA s’obrirà 4. ADP-ribosilació: aporta q(-) i fa que el DNA s’obri Biologia Molecular i Genòmica DE MENYS CONDENSAT A MÉS CONDENSAT NIVELL 1 DE CONDENSACIÓ: NUCLEOSOMES I FIBRA DE 10 nm NUCLEOSOMES Els nucleosomes són complexos formats per l’associació de proteïnes histones amb el DNA. Estan formats per un nucli proteic de 8 molècules d’histones (octàmer d’histones) sobre el qual s’enrotlla el DNA, i per la histona H1 (histona lligadora) que interacciona amb el DNA adjacent als nucleosomes però no forma part de l’octàmer (actua com a una grapa subjectant l’estructura).
L’octàmer d’histones està format per 2 molècules de cada tipus d’histona: H2A, H2B, H3 i H4. En els humans trobem un nucleosoma per cada 200 pb.
FIBRA DE 10 nm Són les fibres que formen els nucleosomes, connectats entre si per fragments de DNA. Podem distingir:   El DNA nucli (core). DNA (de 146 – 147 pb) superenrotllat negativament (dóna quasi 1.7 voltes a l’octàmer d’histones); és un DNA de mida força constant en totes les espècies.
El DNA nexe (linker). DNA que connecta els nucleosomes, de longitud variable (20 – 60 pb).
Aquestes fibres de 10 nm proporcionen un empaquetament del DNA de 6 vegades superior al de la doble hèlix.
Biologia Molecular i Genòmica NIVELL 2 DE CONDENSACIÓ: FIBRA DE 30 nm (fibra de cromatina) La fibra de 10 nm s’enrotlla sobre ella mateixa amb la intervenció de la histona H1. El grau d’empaquetament és d’unes 40 – 100 vegades respecte la doble hèlix. S’han proposat diversos models per explicar com s’associen els nucleosomes en la fibra de 30 nm: el model solenoïdal i el model zig-zag.
Les cues N-terminals de les histones de l’octàmer es disposen cap a l’exterior i són necessàries per a la formació de la fibra de 30 nm: estabilitzen l’estructura al formar interaccions entre nucleosomes. Les modificacions químiques que pateixen les cues N-terminals de l’octàmer desestabilitzen la fibra de 30 nm, i descondensen el DNA per a permetre la transcripció.
NIVELL 3 DE CONDENSACIÓ: CROMOSOMA INTERFÀSIC (forma descondensada del cromosoma) En interfase les fibres de 30 nm estan formant llaços o bucles i superenrotllaments lligats a una matriu proteica no histona (esquelet nuclear o cromosòmic). Aquesta estructura compacta més el DNA permet distribuir els gens en unitats transcripcionals.
Enrotllaments superiors d’aquesta estructura generen diferents graus de condensació en interfase:   Eucromatina: regions de cromatina amb un grau d’empaquetament relativament baix, de 1000 – 2000 vegades, no visibles al microscopi òptic. El DNA es pot replicar i transcriure, és accessible.
Majoritària en interfase.
Heterocromatina: regions de cromatina molt més empaquetada (50.000) visible al m.o però que no permet la replicació ni la transcripció. Minoritària en interfase. Pot ser de dos tipus: o Constitutiva: DNA estructural, no codificant, sempre amb el màxim nivell d’empaquetament i és transcripcionalment inactiva, no s’expressa (centròmers, telòmers).
Biologia Molecular i Genòmica o Facultativa: cromatina que no sempre està tant compactada. S’expressa en un moment donat o en un determinat teixit.
En els humans, per a equiparar el nivell d'expressió dels gens lligats al cromosoma X en els dos sexes, un dels dos cromosomes X femenins és inactiu. Les dones tenen únicament un cromosoma X actiu, igual que els homes, i en ambdós sexes aquest cromosoma s’expressa al mateix nivell. El cromosoma X inactiu de la dona està totalment condensat en forma de heterocromatina facultativa.
NIVELL 4 DE CONDENSACIÓ: CROMOSOMA METAFÀSIC (forma condensada del cromosoma) Durant la metafase, el DNA que ja s’ha replicat es condensa en heterocromatina, adquirint l’aspecte típic dels cromosomes visibles al microscopi òptic. En metafase, cada cromosoma presenta dos estructures en forma de bastó, les cromàtides. Cada cromàtide és una fibra d’heterocromatina superenrotllada.
El cromosoma:     Compacta el DNA Estabilitza les molècules de DNA i les protegeix de l’entorn cel·lular Permet la transferència segura a les cèl·lules filles de tota la informació codificada Organitza la informació continguda en el DNA, facilitant l’expressió gènica.
El DNA en les regions del cromosoma que s’estan replicant o transcrivint es presenta poc (fibra de 10 nm) o nul·lament (doble hèlix) compactat.
Biologia Molecular i Genòmica El cromosoma està format per diferents parts:   Centròmer: lloc d’unió del cromosoma a les fibres del fus mitòtic. Lloc d’unió de les cromàtides germanes Telòmers: seqüències dels extrems dels cromosomes associades a proteïnes que participen en l’estabilitat i manteniment de la integritat estructural. Asseguren la replicació completa dels extrems dels cromosomes lineals.
GENOMES EXTRANUCLEARS Els mitocondris i els cloroplasts són orgànuls que contenen el seu propi genoma.
Genoma nuclear humà haploide Genoma nuclear humà diploide Genoma mitocondrial humà Cèl·lules sexuals Cèl·lules somàtiques 3,2 · 109 pb distribuïdes en 23 cromosomes lineals 46 cromosomes lineals 22 parells de cromosomes homòlegs més els cromosomes sexuals X i Y Mitocondris 16,5 · 103 pb en una molècula circular 37 gens per molècula (13 proteïnes, 22 tRNA i 2 rRNA) Moltes còpies per cèl·lules CONCEPTES BÀSICS DE GENÈTICA            Cromosomes homòlegs (vs. cromosomes heteròlegs): cromosomes morfològicament idèntics i que contenen els mateixos gens.
Cromosomes autosòmics (vs. cromosomes sexuals): cromosomes no implicats en la determinació del sexe.
Un locus genètic és la posició definida que ocupa un gen (o una seqüència no codificant) en un cromosoma.
Un al·lel és una de les variants gèniques que pot presentar la seqüència d’un gen, en la població.
Polimorfisme gènic = existència en un locus de dos o més al·lels alternatius per a un determinat gen.
Genotip: constitució genètica d’un organisme. Conjunt d’al·lels presents en tots els cromosomes d’un individu o espècie.
Genotip per a un determinat locus d’un gen: parell d’al·lels presents en aquell locus en els cromosomes homòlegs.
Fenotip: manifestació externa del genotip. Conjunt de caràcters observables (morfològics, bioquímics, moleculars) resultat de l’expressió del genotip i de la interacció de l’organisme amb el medi extern.
Fenotip per a un determinat caràcter: caràcter observable resultat de l’expressió d’un parell d’al·lels i de la interacció de l’organisme amb els factors ambientals.
Un homozigot per a un determinat caràcter o gen, té al·lels idèntics en un determinat locus del parell de cromosomes homòlegs.
Un heterozigot per a un determinat caràcter o gen, té al·lels diferents en un determinat locus del parell de cromosomes homòlegs.
Biologia Molecular i Genòmica      Al·lel dominant: la seva presència es manifesta sempre en el fenotip.
Al·lel recessiu: es manifesta únicament en homozigosis.
Dominància: fenotip que es manifesta sempre en l’heterozigot. El fenotip no permet distingir entre l’homozigot i l’heterozigot.
Dominància incompleta (semi dominància): el fenotip de l’heterozigot és intermedi al dels respectius homozigots.
Codominància: el fenotip de l’heterozigot expressa simultàniament els dos fenotips dels respectius homozigots.
POLIMORFISME GÈNIC      La variabilitat genètica és comú en la població, és estable i heretable.
Un locus és polimòrfic quan la variabilitat afecta a més de l’1% de la població.
Les ¾ parts del genoma és monomòrfic: gens únics sense variabilitat entre individus, que defineixen l’espècie i les seves característiques morfològiques. La resta, ¼ part, és polimòrfic.
El polimorfisme pot tenir o no efectes fenotípics.
El polimorfisme amb efecte fenotípic pot ser: polimorfisme fisiològic: alçada, color dels ulls, grup sanguini.
polimorfisme de susceptibilitat a malalties: càncer, Alzheimer, malalties metabòliques,....
polimorfisme de predisposició a patir addiccions o dependències: a fàrmacs, drogues, alcohol, tabac,...
COMPLEXITAT DEL GENOMA EUCARIÒTIC MIDA DEL GENOMA HAPLOIDE (pb) Quan comparem virus, procariotes i eucariotes, a un nivell superior en l’escala evolutiva li correspon un contingut més gran de DNA. Dins els eucariotes, el contingut de DNA és variable i no té relació lineal amb la complexitat biològica.
Biologia Molecular i Genòmica Aparentment, la complexitat d’un organisme té més relació amb el número de gens que amb la quantitat de DNA. Això passa perquè una gran quantitat del DNA eucariota no codifica per cap producte gènic (DNA no codificant). Hi ha una correlació inversa entre la complexitat de l’organisme i la densitat gènica: com més simple és l’organisme més densitat gènica presenta (nº de gens/mida del genoma).
COMPARACIÓ DEL GENOMA EUCARIOTA AMB EL DE E. Coli (procariota) E.coli Pràcticament la totalitat del DNA és codificant i de còpia única (un únic gen per a cada producte gènic).
EUCARIOTES El DNA té moltes seqüències repetides, que generalment no codifiquen cap producte gènic (exons i introns).
Els gens estan disposats de manera contigua. Hi ha molt poc DNA no codificant entre gens.
La majoria dels gens són de còpia única (genoma haploide).
La seqüència completa dels gens és codificant. No està fragmentada per DNA no codificant.
Els gens estan separats uns dels altres per llargues seqüències intergèniques, de DNA no codificant.
Molts gens s’agrupen en operons.
La seqüència codificant dels gens (exons) està interrompuda per llargs fragments de DNA no codificant (introns).
Els gens són de mida més gran.
TIPUS DE DNA EN ELS CROMOSOMES EUCARIOTES   DNA de còpia única o Gens o DNA intergènic: DNA no codificant que es troba entre els gens (exons i introns) DNA repetitiu o multicòpia o Famílies gèniques clàssiques i multigèniques o DNA repetitiu, disposat en tàndem: -Agrupat (en regions heterocromàtiques): DNA satèl·lit -Dispers: minisatèl·lits i microsatèl·lits o DNA repetitiu, no disposat en tàndem i dispers pel genoma: -Pseudogens processats -Retrotransposons (seqüències mòbils) Seqüències LINEs Seqüències SINEs CARACTERÍSTIQUES DELS GENS Gen: seqüència de DNA que codifica per un producte gènic (tots els tipus de RNAs i de proteïnes de l’organisme). Tenen un locus determinat en els cromosomes.
Els gens eucariotes són gens fragmentats formats per:  Exons: són les seqüències codificants del gen (50-200 pb) que es troben en el RNAm madur.
DNA codificant.
Biologia Molecular i Genòmica  Introns: seqüències no codificants del gen de mida variable (0,5-5 Kb) que no es troben en el RNAm madur. DNA no codificant.
En els gens (eucariotes i procariotes) distingim:  Una seqüència estructural, que es transcriu i codifica per a RNAs o proteïnes.
 Seqüències reguladores, que controlen la transcripció de les seqüències estructurals.
GENOMA EUCARIOTA NOVA DEFINICIÓ DE GEN (Projecte Encode; setembre 2012) “Conjunt de les seqüències genòmiques, potencialment solapants, que codifiquen un conjunt coherent de productes funcionals (proteïnes i RNAs).
Aquesta definició probablement augmentarà el nombre total de gens del genoma.
“An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome”. The Encode Project Consortium.
Nature, vol 489, 57-74, 2012.
Biologia Molecular i Genòmica GENOMA PROCARIOTA Els operons són característics dels procariotes. És un grup de gens que es regulen i s'expressen conjuntament. Expressen un mRNA comú que donarà lloc a varies proteïnes (policistrònic). Generalment, els gens d’un operó tenen relació funcional. Ex.: l’operó de la lactosa està format per 3 gens estructurals (z, y, a) i un gen regulador de l’expressió dels gens estructurals (i).
GENS MULTICÒPIA: FAMÍLIA GÈNICA CLÀSSICA Els gens d’alguns RNAs (rRNA, tRNA) i d’algunes proteïnes (histones) estan agrupats en unitats de repetició (~5,8 Kb), disposades en tàndem. Tots els gens són funcionals. S’expressen tots alhora amb RNAm independents. S'expressen totes les repeticions, ja que codifiquen per a molècules que es necessiten en molta quantitat i s’han de sintetitzar ràpidament en un determinat moment del cicle cel·lular.
FAMÍLIA MULTIGÈNICA DE LES GLOBINES Conjunt de gens relacionats evolutiva i funcionalment. Codifiquen per a proteïnes amb funcions relacionades i es disposen agrupats freqüentment en la mateixa regió del cromosoma (cluster). Exemple: hemoglobina humana. Són gens funcionals però no s’expressen tots alhora sinó alternativament en diferents estadis del desenvolupament. Tenen petites diferències en la seqüència i codifiquen proteïnes amb diferents afinitats pel substrat.
Biologia Molecular i Genòmica DNA REPETITIU, EN TÀNDEM   DNA repetitiu, en tàndem i agrupat en regions concretes del cromosoma.
o DNA satèl·lit: són seqüències (de 5-200 pb) altament repetitives (formen grans blocs de repeticions, 1000-106 repeticions). S’agrupen en regions del genoma, com telòmers i centròmers (heterocromatina constitutiva).
DNA repetitiu, en tàndem i dispers per tot el genoma seguint una distribució aparentment a l’atzar.
o DNA minisatèl·lit (de fins a 25 pb) i microsatèl·lit (de fins a 13 pb), moderadament repetitives (formen blocs de 100 -1000 repeticions, i de 50 repeticions, respectivament).
El minisatèl·lit i el microsatèl·lit, són hipervariables; tenen gran polimorfisme entre individus d’una espècie i fins-i-tot entre els dos cromosomes homòlegs d’un individu. Presenten canvis en la seqüència i en el nombre de repeticions. S’utilitzen com a “empremtes” de DNA per proves forenses, de identitat i de paternitat.
TRANSCRIPTASA INVERSA (O REVERSA, RT): UNA POLIMERASA DE DNA AMB MOTLLE D’RNA És una polimerasa de DNA que utilitza RNA com a motlle. La transcriptasa inversa està present en els retrovirus i en la telomerasa. El processament de l’RNA que utilitzen els retrovirus per infectar les cèl·lules hostes (hepatitis B, sida, càncers) és el mateix que origina pseudogens i retrotransposons en les cèl·lules eucariotes.
Biologia Molecular i Genòmica DNA REPETITIU DISPERS PSEUDOGENS PROCESSATS Són seqüències de DNA integrades en el genoma, que s’han sintetitzat per transcripció inversa a partir d’RNAs madurs. Són gens silenciosos que no es poden expressar perquè no tenen les seqüències reguladores. Són seqüències moderadament repetides i disperses ( no es disposen en tàndem) en el genoma que aparentment no tenen funcions clares per l’organisme.
RETROTRANSPOSONS Els retransposons són seqüències de DNA que s’originen com els pseudogens, però es diferencien en que són mòbils (transponibles); es poden desplaçar dins el genoma. Entre ells estan les seqüències LINEs i SINEs.
 Seqüències LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements) Elements nuclears dispersos llargs. (Són elements mòbils de forma autònoma) Seqüències llargues (milers de pb) que es repeteixen (50.000-100.000 vegades) de forma dispersa en el genoma. Cada espècie de mamífer té una família de LINEs característica.
Ex.:La principal família LINE en humans són les seqüències Kpn (LINE-1).
 Seqüències SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) Elements nuclears dispersos curts. (Necessiten als LINEs per a la transposició).
Seqüències curtes (100-500 pb) que es repeteixen amb una freqüència variable de forma dispersa en el genoma.
Ex.: La SINE més comú en humans és l’element Alu, de 300 pb que es repeteixmde 500.000 a un milió de vegades (5% del genoma).
Cada espècie de mamífer té una o dues famílies SINEs característiques.
Ambdues seqüències són útils per a identificar l’espècie a la que pertany un DNA Són de funció desconeguda. Representen el 32% del genoma humà.
Biologia Molecular i Genòmica TEMA 2. Replicació del genoma La replicació del DNA és la duplicació completa del genoma. És semiconservativa:   Cada cadena del DNA parental serveix de motlle per a la síntesi d’una nova cadena complementària.
En la divisió cel·lular, cada cèl·lula filla rep molècules de DNA formades per la cadena nova acabada de sintetitzar i la cadena motlle parental.
És un procés en el que intervenen una gran quantitat de proteïnes de manera coordinada.
CARACTERÍSTIQUES DE LES DNA POLIMERASES Les DNA polimerases necessiten:    Els quatre desoxirribonucleòtids trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) i Mg2+ com a cofactor.
Un petit fragment d’RNA (in vivo) amb un grup hidroxil -3’ lliure que actua d’encebador. No poden iniciar la síntesi incorporant el primer nucleòtid.
Una cadena senzilla de DNA que actua com a motlle.
Llegeixen la seqüència de la cadena motlle en la direcció de 3’ a 5’. Catalitzen l’elongació de la nova cadena en la direcció 5’ a 3’.
PARÀMETRES CARACTERÍSTICS DE LES POLIMERASES    Processivitat: número de nucleòtids que addicionen en cada cicle d’unió al motlle.
Velocitat: número de nucleòtids incorporats per segon Fidelitat: capacitat d’elongar la cadena sense cometre errors de complementarietat.
La geometria en l’aparellament de les bases contribueix a la fidelitat de la replicació del DNA ja que únicament els aparellaments correctes tenen cabuda al centre actiu de la DNA polimerasa.
REPLICACIÓ EN PROCARIOTES PRINCIPALS TIPUS DE DNA-POLIMERASES DE PROCARIOTES    DNA – polimerasa I: incorpora els nucleòtids que falten i corregeix errors en la replicació. Elimina els primers de RNA.
DNA – polimerasa II: participa en la reparació del DNA DNA – polimerasa III: és la principal responsable de la síntesi del DNA durant la replicació.
Biologia Molecular i Genòmica DNA POLIMERASA I (E.coli) La DNA polimerasa I és monomèrica i té tres dominis amb diferents activitats enzimàtiques_   Exonucleasa 3’ a 5’: trenca enllaços fosfodièster a partir dels extrems 3’ hidroxil lliures quan detecta que l’últim nucleòtid incorporat no és complementari del motlle. És una activitat que corregeix immediatament els errors de l’activitat polimerasa (correctora d’errors o proves).
In vitro, la DNA polimerasa I d’E.coli comet 1 error cada 104 – 105 nts incorporats. L’activitat exonucleasa de 3’ a 5’ (correctora d’errors) redueix els errors a 1 cada 107 nts incorporats. La tasa de mutació observada és 1 cada 1010 nts incorporats, gràcies als sistemes de reparació del DNA postreplicació.
Exonucleasa 5’ a 3’: trenca enllaços fosfodièster a partir dels extrems 5’ fosfats lliures. Pot eliminar un únic nucleòtid o fragments de 5 o 6 nts. La funció principal és eliminar els primers de RNA utilitzats en la replicació. També corregeix lesions en el DNA.
FRAGMENT KLENOW MECANISME DE CATÀLISI DE LA DNA POLIMERASA I Les DNA polimerases catalitzen l’atac nucleofílic d’un hidroxil 3’ lliure sobre el fosfat més intern del dNTP (fosfat α) que s’addicionarà, formant un enllaç fosfodièster, sempre que el nucleòtid a incorporar sigui complementari al del motlle.
Biologia Molecular i Genòmica DNA – POLIMERASA III És el principal enzim responsable de la síntesi del DNA en la replicació. És molt ràpid i poc abundant (250-1000 nts/seg). És un complex multienzimàtic de gran mida (900 kDa) amb moltes subunitats formant una estructura dimèrica asimètrica (holoenzim DNA Pol III). Aquesta estructura dimèrica acobla uns anells al voltant de la doble hèlix (subunitats o abraçadores β) i facilita que l’enzim repliqui les dos cadenes del DNA al mateix temps i en la mateixa direcció. Cada monòmer sintetitza una de les cadenes. L’associació de les abraçadores β amb la DNA polimerasa és la responsable de la gran processivitat d’aquest enzim en la replicació.
Té tres tipus d’activitat catalítica en diferents subunitats:  L’ activitat polimerasa de 5’ a 3’, responsable de l’elongació de les noves cadenes (subunitats α).
 L’ activitat exonucleasa de 3’ a 5’, correctora d’errors en el moment de la replicació (subunitats ε).
 L’activitat responsable de carregar els anells β al voltant de les cadenes (complex g).
MECANISME DE LA DNA POL III PER A INCORPORAR L’ANELL β AL VOLTANT DEL DNA El carregador de l’anell d’unió al DNA de la DNA Pol III és un complex proteic (complex γ) de cinc subunitats amb activitat controlada per ATP. L’abraçadora (β) augmenta la processivitat de les DNA polimerases associades i proporciona velocitat.
Biologia Molecular i Genòmica RNA – POLIMERASA (DNA – primasa) Polimerasa que catalitza la síntesi dels encebadors (primers) de RNA necessaris en la replicació. Inicia la replicació del DNA. Els seus substrats són els ribonucleòsids trifosfat: ATP, GTP, CTP, UTP. Necessita Mg2+.
Seguint la seqüència motlle, polimeritza de 5’ a 3’ un fragment de RNA (de 10 a 60 nts) deixant l’extrem 3’hidroxil lliure. No té activitat correctora d’errors (exonucleasa 3’). L’aparellament del primer de RNA a la cadena motlle li proporciona a la DNA – polimerasa III una pauta conformacional de doble cadena que facilita la rapida síntesi de la nova cadena.
ORIGEN DE REPLICACIÓ EN E.coli E. coli té un únic origen de replicació (ori C) en el seu cromosoma a partir del qual les dues cadenes del DNA es copien simultàniament. El genoma d’E. Coli és un replicó (DNA que es replica a partir d’un únic origen de replicació).
L’Ori C consta de 245 pb amb:    3 seqüències (de 13 pb) pràcticament idèntiques, ordenades en tàndem, molt riques en A i T: punt d’inici de separació de les cadenes (DUE).
5 seqüències repetides (de 9 pb) orientades en diferent sentit, que són el punt d’unió de la proteïna DnaA, iniciadora de la replicació.
Regió rica en seqüències GATC (dianes de metilació).
PROTEINES QUE INICIEN LA REPLICACIÓ EN L’oriC d’E. coli Biologia Molecular i Genòmica Inici de la replicació:    Metilació i fusió de la doble hèlix en oriC.
Formació de dues forquetes de replicació.
Síntesi dels primers.
MODEL D’INICIACIÓ EN E. Coli   Metilació d’oriC: - La replicació comença amb la metilació de les adenines de les seqüències GATC de l’oriC per l’enzim la Dam metilasa.
Separació de les hebres de la doble hèlix en l’oriC: - La metilació d’oriC provoca la unió de la proteïna DnaA (8 molècules lligades a ATP) a les 5 repeticions de 9 pb i a tres llocs I addicionals, formant un complex inicial helicoïdal dextrògir. DnaA és la proteïna iniciadora de la replicació.
- Es forma un complex obert d’iniciació per desnaturalització seqüencial de les repeticions de 13 pb. La reacció requereix ATP, la proteïna bacteriana tipus histona (HU), IHF i FIS.
- Participen també hexàmers de la proteïna DnaB, helicasa que s’uneix a cadascuna de les cadenes i les separa (trenca ponts d’hidrogen) utilitzant ATP i una proteïna adaptadora, DnaC.
- La proteïna de fixació al DNA de cadena senzilla, SSB (“single-stranded DNA-binding protein”) ajuda a mantenir les cadenes separades durant la replicació.
Biologia Molecular i Genòmica SÍNTESI DELS PRIMERS I ELONGACIÓ DE LES CADENES EN E. Coli   La DNA-primasa inicia la síntesi de les cadenes al sintetitzar els primers, petits fragments de RNA (10-60 nucleòtids).
La DNA-polimerasa III (dímer asimètric) sintetitza les dues cadenes elongant els primers.
- Cada monòmer de l’enzim s’uneix a una de les cadenes motlle (parentals) i sintetitza la nova cadena complementària.
- Llegeix els motlles en la direcció de 3’ a 5’, a mesura que avança amb la forqueta de replicació.
- Replica les dues cadenes del DNA simultàniament i en la mateixa direcció de 5’ a 3’: o Una de les cadenes la sintetitza de forma contínua a partir d’un únic primer; és la cadena guia o conductora (leading strand).
o L’altra cadena la sintetitza de forma discontínua, en fragments curts (1000-2000 nts), fragments d’Okazaki, a partir de tants primers com fragments; és la cadena retardada (lagging strand).
Les dues cadenes del DNA d’una forqueta de replicació són sintetitzades per un únic dímer asimètric de DNA polimerasa III. La DNA polimerasa III forma un llaç (model del trombó) en la cadena retardada que li permet llegir el motlle en la direcció correcta (de 3’ a 5’) i sintetitzar fragments curts en la direcció de 5’ a 3’.
Biologia Molecular i Genòmica ELONGACIÓ: FORQUETA DE REPLICACIÓ EN E. Coli Cada forqueta de replicació avança amb moltes proteïnes:  Una helicasa (DnaB): separa les cadenes.
 La proteïna d’unió a DNA de cadena senzilla (SSB): evita la renaturalització de les cadenes.
 La DNA-primasa: sintetitza els primers dels fragments d’Okazaki.
 La DNA-polimerasa III: elonga les cadenes.
 La DNA-polimerasa I: elimina els primers (amb l’activitat exonucleasa de 5’ a 3’) i omple els forats.
 La topoisomerasa II (DNAgirasa): elimina el superenrotllament positiu generat al davant de la forca per la separació de les cadenes. La DNAlligasa: uneix tots els fragments de la cadena retardada.
En E. Coli la replicació requereix més de 20 proteïnes diferents. El conjunt de totes les proteïnes implicades en la replicació és el replisoma (= proteosoma).
Les helicases de DNA desfan la doble hèlix, permetent l’avanç de la forqueta de replicació. L’helicasa (DnaB en E. Coli) es mou sobre la cadena retardada en direcció 5’ a 3’, en un procés que depèn d’ATP. Les helicases s’uneixen al DNA monocatenari i migren segons la seva especificitat a 5’ a 3’ o de 3’ a 5’.
FUNCIÓ DE LA TOPOISOMERASA II Quan l’helicasa separa les cadenes, el DNA corrent amunt de la forqueta de replicació es superenrotlla positivament. Si no s’eliminés aquest superenrotllament, la forqueta s’aturaria. La topoisomerasa II (DNA girasa) redueix el número d’enllaç topològic, treu superenrotllament positiu i genera superenrotllament negatiu.
Biologia Molecular i Genòmica SÍNTESI DE FRAGMENTS D’OKAZAKI I FINALITZACIÓ DE LA CADENA RETARDADA La DNA polimerasa III elonga les dues cadenes. Sintetitza els fragments d’Okazaki de la cadena retardada.
La DNA polimerasa I ( activitat exonucleasa 5’) degrada els primers d’RNA i incorpora els nucleòtids que falten entre els fragments d’Okazaki de la cadena retardada.
La DNA lligasa lliga finalment els fragments de DNA: lliga extrems 3’-hidroxil lliures amb extrems 5’ fosfat formant enllaços fosfodièster en cadenes de dúplex de DNA. La reacció utilitza:  El coenzim NAD+, en E. Coli  L’energia de hidròlisi de l’ATP, en eucariotes i alguns virus.
TERMINACIÓ DE LA REPLICACIÓ EN E. Coli La replicació acaba on es troben les dues forquetes de replicació, en l’extrem oposat a l’oriC, denominat Ter (terminal). Ter conté múltiples còpies d’una seqüència de 20 pb que es troben disposades en el cromosoma en dos grups amb orientació oposada. Són punts d’unió de la proteïna Tus. Aquestes seqüències Ter actuen com a trampes que atrapen (i aturen) les forquetes de replicació quan es forma el complex Tus-Ter. Només actua un complex Tus-Ter per replicació, què atura una forqueta de replicació. L’altra forqueta s’atura quan es topa amb la forqueta oposada (ja aturada). Controlen l’arribada coordinada de les dues forquetes i eviten la sobrerreplicació.
La replicació genera cromosomes encadenats que han de ser separats per una topoisomerasa de tipus II (topoisomerasa IV), que trenca les dues cadenes d’un dels cromosomes i les separa.
REGULACIÓ DE L’INICI DE LA REPLICACIÓ DEL DNA EN E. Coli En procariotes, no hi ha cap interval de temps entre el final de la replicació i el començament de la divisió; la divisió es produeix quan ja s’ha iniciat un nou cicle de replicació. El temps de replicació del cromosoma Biologia Molecular i Genòmica d’E.coli, és constant (40 minuts), però en un medi òptim de creixement el bacteri comença a dividir-se en 20 -30 minuts. L’objectiu de la replicació és que en la divisió cel·lular cada cèl·lula filla rebi una única còpia completa del genoma. L’inici de la replicació ha d’estar controlat; en el procés té un important paper la metilació del DNA, per l’enzim metilasa Dam, i els nivells disponibles de la proteïna iniciadora DnaA lligada a ATP i de la proteïna SeqA.
La metilació de l’oriC controla la replicació en E. coli. Ambdues cadenes de l’oriC han d’estar metilades per a que s’inici la replicació. SeqA bloqueja les seqüències hemimetilades després d’un cicle de replicació. No es pot iniciar un nou cicle. LA separació de SeqA permet la metilació per la Dam metilasa i l’inici d’una nova replicació (Entrada de DnaA si els nivells d’ATP són prou elevats).
REPLICACIÓ EN EUCARIOTES La replicació en el genoma nuclear dels eucariotes, encara que és més complex, segueix els mateixos principis que en procariotes:  És semiconservativa i bidireccional a partir dels orígens de replicació.
 Les DNA polimerases sintetitzen simultàniament les dues cadenes del DNA de 5’ a 3’.
 Es necessiten encebadors d’RNA (primers)  La síntesi d’una cadena és contínua i la de l’altra és discontínua, en fragments d’Okazaki (100-400 pb) que després són lligats (replicació semidiscontínua).
 Quan s’inicia la síntesi d’un replicó (fragment de DNA que se sintetitza a partir d’un mateix origen de replicació), la replicació continua fins al final; no s’atura (replicació seqüencial).
Biologia Molecular i Genòmica DIFERÈNCIES AMB E. coli La replicació la duen a terme dues DNA polimerases que treballen sincrònicament en la forqueta de replicació. No són enzims dimèrics i es necessita una polimerasa per a cada cadena.
El genoma nuclear eucariota té múltiples cromosomes a replicar, de gran longitud i lineals.
Els cromosomes nuclears d’eucariotes tenen múltiples orígens de replicació (distanciats entre 30 i 300 Kb).
En eucariotes hi ha un interval de temps (fase G2 del cicle cel·lular) entre la replicació (fase S) i la mitosi. La cèl·lula no es pot dividir sense que s’hagi completat la replicació.
ANALOGIES AMB E. coli Biologia Molecular i Genòmica Si les cadenes no estan separades no es poden copiar.
1. Motlle: El motlle és una cadena de DNA (senzilla) necessària per poder fer la còpia, però les 2 poden actuar de motlle.
2. Encebador = primer: Tros de RNA que actua d’iniciador i que després s’ha de treure.
3. Processivitat 4. Correcció d’errors 5. Cofactor 6. Inici de la copia Fabricat per les RNA polimerases (primases) Nº de nucleòtids introduïts en cada cicle de replicació.
nts fiquin  processivitat Tenen capacitat de corregir errors Totes corregeixen, per tant fidelitat en la replicació.
in vivo: Mg+2 i quan ho fem in vitro: Mg+2 o Mn+2 Procariota (E.coli)  té poc DNA i té 1 origen de replicació (monofocal) Eucariota  múltiples orígens (multifocal) 1 hebra continua  1 encebador fet x primasa 7. Formació forques de replicació helicases trenquen ponts H 1 discontinua (=retardada)  need >1 cebador 8. Sentit de la còpia 5’3’ 9. Sentit lectura 3’5’ Semiconservativa: Meselson – Stahl amb marcatge radioactiu del N15 10. Copia Bidireccional Simultània sintetitza la mateixa DNA polimerasa (dímer) que fa les 2 cadenes noves Els encebadors s’eliminen, quedant forats que omple la lligasa PRINCIPALS DNA POLIMERASES D’EUCARIOTES Les DNA polimerases d’eucariotes són més petites i tenen menys subunitats que les polimerases bacterianes. A diferència dels procariotes: les DNA polimerases d’eucariotes no tenen activitat exonucleasa de 5’ a 3’. L’activitat exonucleasa de 5’ a 3’ (que elimina els encebadors d’RNA) són enzims independents.
Les DNA polimerases d’eucariotes essencials per a la replicació del genoma són les següents:  El complex DNA Pol α/primasa inicia noves cadenes. Està format per dues subunitats DNA pol α (alfa) i dues subunitats primasa. L’activitat primasa sintetitza l’encebador d’RNA i a continuació l’activitat DNA Pol α comença a polimeritzar DNA. Té baixa processivitat, raó per la qual és ràpidament reemplaçat per polimerases amb més elevada processivitat, com la DNA Pol δ o la DNA Pol Ԑ (procés denominant canvi de polimerases).
 La DNA Pol δ (delta) i la DNA Pol Ԑ (epsilon) son les responsables de l’elongació de les cadenes.
 La DNA Pol γ (gamma) és la única DNA polimerasa no localitzada en el nucli cel·lular. Està en el mitocondri, on replica i repara el DNA mitocondrial.
Biologia Molecular i Genòmica  La resta de polimerases (se n’han descrit més de 13) estan implicades fonamentalment en la reparació del DNA nuclear.
TIPUS α β γ δ ε Nuc Nuc Mit Nuc Nuc Primasa Sí - - - - Exonucleasa 3’5’ - - Sí Sí Sí Exonucleasa 5’3’ - - - - - Localització Durant la replicació del genoma en els eucariotes té lloc un canvi de polimerases. La processivitat de les DNA pol δ o Ԑ es veu incrementada per l’associació amb proteïnes que formen un anell que llisca sobre el DNA (sliding clamp).
Biologia Molecular i Genòmica ORIGENS DE REPLICACIÓ EN EUCARIOTES Els cromosomes eucariotes tenen molts orígens de replicació i molts replicons, fet que facilita i accelera la replicació de molècules de DNA de gran longitud. Els orígens de replicació eucariotes tenen seqüències riques en AT però no tant definides com els procariotes. És una replicació bidireccional. No s’activen tots els orígens de replicació alhora, sinó per regions i de forma regulada.
PROCÉS DE LA REPLICACIÓ 1. FORMACIÓ DELS COMPLEXOS PRE – REPLICATIUS (pre – RC) La replicació en els eucariotes està regulada i coordinada amb el cicle cel·lular.
L’inici de la replicació requereix dues fases:  Selecció del replicó i formació d’un complex prereplicatiu (pre-RC), en la fase G1.
 Activació del complex pre-RC, en la fase S: es desenrotlla el DNA i es recluten les DNA polimerases.
El complex pre-RC està format per:  El complex proteic de reconeixement de l’origen (ORC).
 Dues proteïnes carregadores de l’helicasa (Cdt1 i Cdc6).
 L’helicasa de la forqueta replicativa (Mcm2-7).
2. ACTIVACIÓ DELS COMPLEXOS PRE – RC Els pre-RC s’activen per dues proteïnes quinases (Ddk i Cdk) que únicament són actives quan les cèl·lules entren en la fase S del cicle cel·lular. Aquestes quinases fosforilen proteïnes del pre-RC, que al ser fosforilades se separen del complex.
Al complex pre-RC activat s’hi uneixen les DNA-polimerases i altres proteïnes auxiliars, i s’inicia la replicació: l’helicasa separa les cadenes i es formen les forquetes de replicació.
Biologia Molecular i Genòmica QUINASES DEPENENTS DE CICLINES (CDK) El control en la formació i activació del complex pre-RC, per les quinases dependents de ciclines (Cdk), assegura que el genoma eucariota es repliqui només un cop en cada cicle cel·lular.
Durant el cicle cel·lular se sintetitzen i degraden una família de proteïnes petites, les ciclines.
Ciclines específiques s’uneixen i activen les proteïnes quinases dependents de ciclines (Cdk).
Aquestes quinases activades, activen els pre-RC. Quan les quinases estan activades (fases S, G2 i M) no es poden formar nous complexos pre-RC.
3. FORQUETA DE REPLICACIÓ EN EUCARIOTES Un cop la DNA Pol α/primasa inicia la replicació, el fragment sintetitzat és reconegut per la proteïna carregadora de l’abraçadora (RF-C) què uneix l’abraçadora PCNA al voltant de les dues cadenes (similar a l’abraçadora β de la DNA Pol III d’E. coli).
La DNA Pol (δ o Ԑ ) comença a sintetitzar la cadena guia.
La DNA Pol α/primasa sintetitza encebadors addicionals pels fragments d’Okazaki de la cadena retardada, que seran elongats per la DNA Pol (δ o Ԑ ).
4. FINALITZACIÓ DE LA REPLICACIÓ En cada cicle de replicació, una molècula de DNA lineal s’escurça perquè els extrems 3’ de les cadenes parentals no es poden copiar (entre 50-200 pb). En l’extrem 5’, les cadenes retardades, acabades de sintetitzar, són més curtes que les cadenes motlle. En l’extrem 3’ de la cadena motlle queda una extensió protuberant de cadena senzilla.
En l’extrem 5’ terminal de les cadenes retardades falta espai per a iniciar un nou fragment d’Okazaki.
El primer de l’últim fragment d’Okazaki és eliminat i no pot ser reemplaçat per DNA.
Biologia Molecular i Genòmica SEQÜÈNCIES TELOMÈRIQUES Els telòmers són seqüències de DNA no codificants, especialitzades i associades a proteïnes. Protegeixen els extrems dels cromosomes lineals contra la pèrdua de la informació gènica, vital per a la cèl·lula, que succeiria en cada cicle de replicació. Els telòmers són seqüències de DNA repetitiu agrupat (DNA-satel·lit):  Múltiples repeticions directes (150-2000) en tàndem d’un oligonucleòtid curt (4-12 nucleòtids).
 L’extrem 3’ sobresurt 12-16 nucleòtids respecte l’extrem 5’ de la cadena complementària.
En mamífers l’extrem 3’ dels telòmers està protegit per una estructura en forma de llaç, llaç T. Per a la formació del llaç T participen diverses proteïnes TBP (Telomere Binding Protein). El llaç T segresta i protegeix els extrems telomèrics 3’ de cadena senzilla de l’acció de les nucleases i dels enzims de reparació del DNA.
Si els telòmers s’escurcen massa, no es poden lligar les proteïnes i els extrems queden desprotegits. Els enzims reparadors poden fusionar extrems de diferents cromosomes, i el DNA es torna inestable i es perd la viabilitat cel·lular.
PAPER DE LA TELOMERSA EN LA REPLICACIÓ DELS CROMOSOMES LINEALS Els telòmers s’escurcen en la replicació, però poden ser regenerats per la telomerasa, que és una ribonucleoproteïna (enzim associat a RNA):  El component proteic és una transcriptasa reversa (polimerasa que sintetitza DNA a partir d’RNA motlle). El virus de la SIDA té la transcriptasa reversa. Té 3 activitats en 1: o DNA polimerasa depenent de RNA: o RNAasa H: o DNA polimerasa depenent de DNA: copia el RNA del virus a DNA degrada el RNA del virus copia RNA viric DNA viril DNA viric+eucariota  DNA AZT: inhibidor de la transcriptasa inversa (anàleg nucleòsid)  El fragment d’RNA associat és de mida variable segons la espècie i té una seqüència complementària a la seqüència telomèrica.
Biologia Molecular i Genòmica En la majoria de les cèl·lules somàtiques dels teixits adults, no hi ha activitat telomerasa. L’escurçament dels telòmers és un rellotge biològic que mesura l’envelliment. Està present en totes les cèl·lules d’elevada proliferació (cèl·lules canceroses). És diana terapèutica de fàrmacs antitumorals.
EXTENSIÓ DELS TELOMERS PER LA TELOMERASA La telomerasa elonga l’extrem protuberant 3’, produint una cadena motlle suficientment llarga per a que, posteriorment, la DNA polimerasa α sintetitzi un primer terminal i copiï l’extrem. L’activitat exonucleasa elimina el primer i queda un extrem 3’ protuberant, però el telòmer s’ ha allargat.
DNA MITOCONDRIAL    Són 2 cadenes circulars 1r es copia la de fora (H) i després a L, no es copien alhora.
Les 2 es copien continues i aquí no hi ha fragments d’Okazaki.
 És semiconservativa perquè obtenim una cadena nova i un altre antiga  Té 2 orígens; 1 en H i l’altre a L (bifocal) Biologia Molecular i Genòmica MUTACIONS Les mutacions es donen de manera natural ja que el genoma és inestable. Hi ha dos tipus de cèl·lules que poden patir mutacions:   Cèl·lules somàtiques. Les mutacions no es transmeten a la descendència (la resta) Cèl·lules germinals, l’òvul i l’espermatozoide. Les mutacions es poden transmetre a la descendència.
TIPUS DE MUTACIONS      Puntuals (a petita escala). Canvia una base nitrogenada. Micromutació.
No puntuals (a gran escala). Canvia més d’una base nitrogenada. Macromutació.
Substitucions: o Transicions: purina per purina (A, G) i pirimidina per pirimidina (C,T) o Transversions: purina per pirimidina o viceversa.
Deleccions: pèrdua de bases Insercions: addició de bases o puntuals o expansions repetides de tripletes o elements transponibles o duplicacions en tàndem EFECTE DE LES MUTACIONS  Silencioses: no es manifesten, no canvia el fenotip (neutres) o canvi del 3r nucleòtid d’un codó (sense mutation).
o mutacions en: introns zones no codificants zones no reguladores  No silencioses: es manifesten, algunes són fins i tot mortals. Afecten al fenotip. Poden ser beneficioses o de terminació prematura.
o canvi d’un aa per un altre diferent (missense mutation) o terminacions prematures codó de STOP (nonsense mutation) o alteracions al marc de lectura (frameshift mutation) o canvi en les seqüències GT/AG intròniques, 5’UTR, 3’UTR o alteracions en el promotor Biologia Molecular i Genòmica CAUSES DE LES MUTACIONS  Errors al replicar, deguts a la tautomeria. Són els més freqüents. Hi ha sistemes de reparació  Mutacions espontànies o Desaminació oxidativa: es perd NH2 - Citosina → uracil - Adenina → hipoxantina - 5-metilcitosina → timina - Guanina → xantina o Pèrdua de bases nitrogenades: es forma un forat anomenat AP perquè es trenca l’enllaç Nglicosídic i es perd la BN.
o Modificació de les bases per mutàgens endògens. Per exemple, la respiració aeròbica produeix radicals d’oxigen semireduïts, això produeix mutacions en el DNA.
 Agents mutàgens o Químics: - 5-bromouracil: anàleg de la timina que produeix la transició A - T → G – C - Aflatoxina B1: transversió G - C → T – A - Àcid nitrós: accelera la desaminació oxidativa - Bromur d’etidi - Benzopirè del tabac: en l’organisme es forma un epòxid que s’uneix al DNA i és cancerígen - Sulfonats: DMS, EMJ o Físics: - Raigs X, raigs γ - Radiació UV: provoca la formació de dímers de timina. El sistema de reparació són les fotoliases.
- Test de Ames: es fa amb la salmonel·la. Permet determinar si una substància és mutagènica i cancerígena.
SISTEMES DE REPARACIÓ   Reparació d’aparellaments incorrectes durant la replicació.
o Proteïnes Mut:  Mut S i Mut L: reconeixen l’aparellament incorrecte i reconeixen el motlle i s’uneixen a ell.
 Mut H: trenca la cadena errònia o Endonucleasa: talla un tros o DNA pol III: torna a col·locar el tros però correcte o DNA lligasa: uneix fragments Per tall o escissió de base (BER): per a reparar el DNA danyat 1) DNA glicosilasa elimina les BN incorrectes 2) Queda un lloc AP 3) AP endonucleasa talla per a deixar passar la DNA – pol I 4) DNA pol I col·loca la BN correcta Biologia Molecular i Genòmica    5) DNA lligasa sella Per tall o escissió de nucleòtid (NER) 1) ABC escinucleasa reconeix el dany i talla el tros 2) DNA pol I reomple el forat 3) DNA lligasa empalma Reparació directa. Per exemple, quan es formen dímers de timina produïts per UV, venen les fotoliases, que utilitzen llum visible com a font d’energia i tallen.
Recombinació. Funcions de diversitat genètica i reparació.
- No és patològic - Reordenament de la informació genètica dins d’una molècula de DNA o entre DNA.
- S’ha de formar els intermediaris de Holliday, característics de totes les recombinacions Funcions 1. Reparació d’errors 2. Regulació de l’expressió gènica 3. Correcta segregació durant la divisió dels cromosomes 4. Diversitat genètica perquè sinó seríem tots iguals 5. Biotecnologia 6. Replicació 7. Reordenaments programats durant el desenvolupament embrionari Tipus a) Homòloga: La més famosa. Entre seqüències de DNA d’elevada similitud.
Passa de forma habitual  diversitat genètica També és sistema de reparació.
b) Específica del lloc: Entre zones petites però elevada homologia, en una seqüència de DNA definida.
Els enzims s’anomenen recombinases i actua sobre la seqüència única i curta de DNA.
c) Per transposició: No fa falta homologia Intervé un segment curt de DNA amb la notable capacitat de traslladar-se d’una localització en el cromosoma a l’altre d) Ilegítima: entre diferents sp i utilitzant vectors e) Resposta SOS: És la és freqüent i actuen sb la DNApol IV i V Recombinació per arreglar el DNA danyat És un sistema que augmenta la taxa d’errors però q pot replicar el DNA molt danyat Biologia Molecular i Genòmica PROBLEMES EN LA REPARACIÓ DEL DNA  Xeroderma pigmentosum: Defecte en el sistema d’escissió dels nucleòtids, no tenen moltes escinucleses.
Molts sensibles a radiació UV La pell s’endureixen i acaben donant un càncer. A més anormalitats oculars i neurològiques.
És autosòmic recessiu  Càncer colon-rectal hereditari no polipos (HNPCC): Problema en la Mut S i L, estan mutades (no tenen per què estar-ho les dues)  Corea de Huntigton: Apareixen moltes glutamines i no es repara. Té problemes en la reparació. Excés de triplets CAG.
TEMA 3. Transcripció La transcripció és diferent segons si ens trobem en un organisme procariota o eucariota:  En procariotes: tot en el citosol. No hi ha separació ni espacial ni temporal.
DNA  transcripció RNA traducció PROTEÏNES En eucariotes: sí que hi ha separació espacial i temporal.
DNA transcripció NUCLI preRNA maduració NUCLI RNA traducció CITOSOL (ribosoma) PROTEÏNES A partir d’una proteïna no es pot deduir el DNA. La transcripció és la síntesis del RNA. Té les següents característiques:      Qualsevol de les dues cadenes de DNA pot fer de motlle Actuen les RNA polimerases És menys fidel que la replicació perquè no es corregeixen errors.
No tots els gens es transcriuen.
Té caràcter asimètric: només es copia una cadena (la que es llegeix). La transcripció produeix una sola cadena de RNA. Es creen diferents gens, uns codificats en la “cadena de dalt” i altres per la Biologia Molecular i Genòmica cadena de baix. Les dues cadenes codifiquen missatges diferents: les dues cadenes codifiquen gens.
La seqüència codificant per la cadena de dalt és diferent que la de baix.
L’RNA es diferencia del DNA per l’ús d’uracil enlloc de timina i per tenir una ribosa enlloc d’una desoxiribosa.
L’uracil interacciona per ponts d’hidrogen amb l’adenina en la molècula de RNA de cadena senzilla. A més, la seva direcció és 5’ – 3’, mentre que la del DNA és la contrària.
L’RNA pot adquirir diferents estructures secundàries. És de cadena senzilla i adopta estructures tridimensionals diferents, amb funcions específiques, fent servir hairpins, loops...
Al final de la síntesi del RNA, obtenim dos tipus de RNA: RNA estructural o catalític i RNA missatger que donarà lloc a una proteïna.
RNA POLIMERASES         Utilitzen DNA com a motlle No necessiten primer Fan la síntesis en sentit 5’ – 3’, mitjançant la formació d’enllaços fosfodièster Fan la lectura de la cadena motlle en sentit 3’ – 5’ (antiparal·lela i complementària a la nova cadena d’RNA).
Necessiten Mg2+ com a cofactor i els quatre nucleòtids No tenen activitat correctora Tenen una alta processivitat: sintetitza tota la cadena de cop Trobem únicament un tipus en procariotes i tres en eucariotes: RNA pol I, RNA pol II i RNA pol III.
TIPUS DE RNA Hi ha molts tipus però només tres són els més importants:    RNA ribosomal: forma part de l’estructura dels ribosomes RNA de transferència: porta els aminoàcids RNA missatger: porta informació per a fer proteïnes (codons). Té algunes propietats: o Té la seqüència complementaria del motlle però amb U enlloc de amb T.
o Massa heterogènia o S’associa a ribosomes o Velocitat de recanvi alta: formació i degradació constant Biologia Molecular i Genòmica TRANSCRIPCIÓ EN PROCARIOTES Els promotors són seqüències que avisen que s’aproxima l’inici de la transcripció. Sempre comencen per una guanina o una adenina (G o A).
RNA pol La RNA pol és un holoenzim de 500 kD amb sis subunitats de 5 tipus: α2, β, β’, σ i ω.
    α: s’uneix a les seqüències reguladores β: forma enllaços fosfodièster β’: s’uneix al DNA σ: és la responsable de l’inici de la transcripció. Escaneja el DNA buscant els promotors de manera unidireccional. Una vegada localitzat, es col·loca en el inici i comença la síntesis.
β i β’ és el centre catalític. Els quatre tipus de subunitats (α2ββ’ω) determinen el “core” o nucli de l’holoenzim. El nucli és igual per a tots els RNAs. La subunitat σ és diferent, és el que diferencia els tipus de RNA.
L’estructura d’un operó procariòtic i d’un gen eucariòtic conté seqüències reguladores i seqüències estructurals. La seqüència de DNA corresponent a un gen també ens diu en quin moment s’ha de fabricar el producte gènic, en quines cèl·lules i en quina quantitat.
Per la iniciació de la transcripció existeixen seqüències específiques de reconeixement al DNA: promotors.
Un promotor és una regió de l’ADN que controla l’inici de la transcripció del gen a ARN. Està format per una seqüència específica d’ADN localitzat just on es troba el punt d’inici de la transcripció de l’ADN i conté la informació necessària per a activar o desactivar el gen que regula. Hi ha promotors tant a eucariotes com a procariotes. Les funcions bàsiques requereixen la σ70.
Les mutacions en els promotors poden variar l’eficència de la transcripció. Les mutacions a la regió -35 afecten la unió de la RNA polimerasa. Les mutacions a la regió -10 afecten la separació de les cadenes.
Biologia Molecular i Genòmica La regió -35 és la seqüència TTGACA. La regió -10 és la caixa TATAAT, a la que se li anomena seqüència Pribnow: s’obre el DNA per aquesta seqüència. Aquestes dues caixes són elements clau dels promotors perquè s’hi uneixi la polimerasa, però hi ha altres elements reguladors. Existeixen promotors forts i promotors febles segons les seqüències. És tant important la conservació de la seqüència com la de la posició relativa dels diferents elements.
ETAPES DE LA TRANSCRIPCIÓ INICI Formació del complex tancat: unió de l’RNA polimerasa.
1. La subunitat σ de la RNA pol reconeix el promotor.
2. RNA polimerasa té activitat helicasa: fa 17 parells de bases per a crear la bombolla de transcripció 3. La girasa (topoisomerasa de tipus II) introdueix el superenrotllament negatiu per darrere de la bombolla per a evitar l’enrotllament positiu que es crea davant de la bombolla de transcripció.
La transició des del complex promotor tancat al complex promotor obert és un succés essencial de la transcripció. A partir de la caixa de -10 (Pribnow), s’obre la doble hèlix perquè és una zona rica en A i T.
Tenim el complex obert.
Biologia Molecular i Genòmica ELONGACIÓ 4. RNA pol comença a sintetitzar RNA.
5. Es forma un híbrid (heterodúplex) DNA – RNA 6. La bombolla es va desplaçant Les DNA polimerases són més ràpides. La mateixa molècula sintetitza tota la cadena.
TERMINACIÓ Hi ha dos tipus de terminació:  Independent de la proteïna: en el DNA motlle haurà una regió palindròmica rica en GC seguida d’una regió rica en AT. Quan es transcriu al RNA, aquest és autocomplementari i forma una horquilla que obliga a l’heterodúplex a trencar-se i s’allibera el RNA. Depèn només de la seqüència. És independent d’error.
 Dependent de proteïna: no hi ha la regió palindròmica. Ve la proteïna ρ (rho) que s’uneix a l’extrem 5’ del RNAm i trenca els ponts d’hidrogen per a deixar anar l’heterodúplex. Aquesta proteïna consumeix ATP. Depèn de la seqüència de DNA i de la proteïna rho. És una helicasa que té 6 subunitats. Disminueix la velocitat de la polimerasa i la transcripció al trobar-se amb una seqüència rica en CG. Amb l’estructura secundària del RNA i a més les unions febles al motlle U=A, tot plegat fa que la polimerasa es pari el RNA es desenganxi sortint del complex.
Biologia Molecular i Genòmica TRANSCRIPCIÓ EN EUCARIOTES Els eucariotes disposen de tres tipus de RNA:    RNA pol I: sintetitza RNA ribosomal excepte RNA 5s. Un tipus de transcrit precursor 45S que dóna lloc als rRNAs: 18S, 5,8S i 28S. No és sensible a la α-amantina.
RNA pol II: sintetitza RNAm i alguns snRNA (small nuclear RNA). Milers de transcrits diferents.
Sensible a la α-amantina.
RNA pol III: sintetitza RNAt i RNA 5s. Uns 100 tipus de transcrits. Inhibit només per altes concentracions de α-amantina.
Els promotors eucariotes solen ser -30 (TATA box), que s’activa per senyals. El promotor de la RNA pol II determina la eficàcia i la especificitat de la transcripció del gen. La caixa TATA i la seqüència Inr formen el promotor basal, que inicia la transcripció amb una freqüència molt baixa. Per aconseguir una seqüència alta, són necessàries seqüencies generals com la CAAT o la GC box o seqüències específiques que activaran gens específics.
La RNA polimerasa II requereix de molts factors proteics TF per unir-se al DNA. Els TF són els factors de transcripció. Parlarem dels TF II, que són els que actuen amb la RNA pol II.
Biologia Molecular i Genòmica RNA POL II Estructura similar a l’RNA polimerasa de procariota. Té 12 subunitats, amb àtoms de Zn i Mg. Té un domini CTD “C-terminal domain” repetit molts cops que s’ha de fosforilar per tal de començar a elongar la nova cadena. Per tant, tenen OHs. No té afinitat directa pel promotor del gen, sinó que necessita TF per unir-s’hi.
INICI 1. El TF II D està format per TBP, que reconeix el promotor, i 12TAF, que s’uneix directament al DNA i marca l’inici de la transcripció.
2. El TF II F i el TF II E s’uneixen i atrauen la RNA pol II.
3. La TF II H actua com a helicasa fent la bombolla, i com a kinasa, fosforilant la RNA pol II pel domini CTD i activant-la.
TBP, TFs i RNA pol II formen un complex basal tancat.
També actuen el TF II A i el TF II B. El TF II A estabilitza la TBP i la unió de la TAF. El TF II B fa d’intermediador en el reclutament de la RNA pol II: influeix en la selecció del punt de partida de la transcripció.
La proteïna TBP o TATA-binding protein fa un complex entre ella mateixa i la caixa TATA. Això fa que es corbi la molècula de DNA i es formi un nucli per unir altres factors. S’uneix al solc petit del DNA.
ELONGACIÓ 4. La RNA pol II activa comença a afegir nucleòtids (NTP) mitjançant enllaços fosfodièster.
Biologia Molecular i Genòmica TERMINACIÓ 5. La RNA pol II es desfosforila i es recicla.
Altres seqüències llunyanes a l’origen de transcripció poden regular la transcripció.
El genoma mitocondrial és diferent al nuclear. Es transcriu amb una RNA polimerasa mitocondrial i té un TF mitocondrial (mTFA).
DIFERÈNCIES ENTRE LA TRANSCRIPCIÓ EN PROCARIOTES I EN EUCARIOTES Els procariotes no tenen separació espaial entre la transcripció i la traducció, per tant no hi ha processament del RNA. En canvi, els eucariotes sí que la tenen, i necessitem un processament del RNA per a formar el RNA madur (RNAm).
RNA POL I Té un complex que té IBP que s’uneix a -100 i activa la pol I. No té TATA box però hi ha seqüència UCE, que és una seqüència control situada a -100. Entre els factors que hi participen, es troba la TBP.
RNA POL III També necessitem TBP. El seu promotor està dins de la part que es transcriu a RNA. Les caixes reguladores estan dins del gen que es transcriu: són les caixes A box o B box si volem transcriure tRNAs, i la caixa C box si volem transcriure rRNA 5s.
TIPUS DE GENS   Facultatius: s’expressen amb un estímul (70%). S’expressen en un determinat teixit o estadi de desenvolupament... Donen especificitat de regulació (ex: gens que s’expressen en presència d’una hormona).
Constitutius: s’expressen sempre, són gens housekeeping que codifiquen per a proteïnes molt generals.
Tots dos són reconeguts per TF.
Biologia Molecular i Genòmica BLOQUEJADORS DE LA TRANSCRIPCIÓ Els antibiòtics bloquegen la transcripció perquè s’uneixen al DNA i el deformen, de manera que no deixen formar la bombolla ni treballar a la RNA pol (actinomicina D, acridina i daunomicina). La rifampicina s’uneix directament a la RNA pol i s’utilitza com a antibiòtic per a la tuberculosi. Hi ha tòxics com la α-amantina, que inhibeixen la RNA pol II i III (aquesta última a altes concentracions) en els eucariotes.
FOOTPRINTING La interacció de l’RNA polimerasa amb el DNA es pot visualitzar mitjançant la tècnica de footprinting, en la qual es pot veure que la regió protegida és de uns 60 – 80 pb i inclou ambdues regions de -10 i -35.
Detecta interaccions DNA-proteïna i està basat en el principi de què, si una proteïna s’uneix a una determinada seqüència d’ADN, aquest fragment és protegit de talls enzimàtics.
RESUM       Totes les molècules es sintetitzen per acció de la RNA pol d’acord amb les instruccions rebudes pels motllos de DNA. La direcció de la síntesi del RNA és 5’ – 3’, la mateixa que per a la síntesi de DNA.
La RNA pol de E. Coli és un enzims amb múltiples subunitats.
La transcripció s’inicia als llocs promotors i per a l’inici de la transcripció és necessari que la RNA pol desenrotlli de forma local la doble hèlix del motlle.
L’elongació té lloc a les bombolles de transcripció que es desplacen al llarg del motllo de DNA.
Als eucariotes, la síntesi de RNA té lloc al nucli on es troben tres tipus de RNA pol: RNA pol I que elabora els precursors dels RNA ribosomals; RNA pol II que sintetitza els precursors dels mRNAs i RNA pol II que sintetitza els precursors dels RNA de transferència.
Els promotors dels eucariotes són complexes i estan formats per diferents elements que són reconeguts per proteïnes anomenades factors de transcripció.
...