Tema 2 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Química i Enginyeria de proteïnes
Año del apunte 2014
Páginas 21
Fecha de subida 14/10/2014
Descargas 37
Subido por

Vista previa del texto

Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 L’ENLLAÇ PEPTÍDIC I LA SEQÜÈNCIA POLIPEPTÍDICA ENLLAÇ PEPTÍDIC L’enllaç peptídic permet la unió i formació de compostos polipeptídics té lloc entre el ’α – carboxílic i α – amino i és un enllaç de tipus amida en el qual s’allibera una molècula d’aigua de manera que és una reacció de condensació de manera que la seva ruptura és una hidròlisis. Aquest enllaç és extremadament estable si la reacció no esta catalitzada. Si traiem les cadenes laterals anomenem esquelet carbonat (o en anglès backbon) a la part que conté els carbonis α i els enllaços, és el conjunt d’enllaços peptídics i carbonis α sense tenir en compte les cadenes laterals.
L’enllaç entre 2 o més aminoàcids dona lloc a una polaritat de la cadena, que sempre comença en N-terminal i acaba en c-terminal de manera que quan posem una seqüència sempre cal indicar l’extrem ja que si els canviem, tot i que tinguin les mateixa composició les característiques de les proteïnes és diferent, és a dir, la polaritat és molt important.
La formació de l’enllaç és molt important per la formació i estructura tridimensional de les proteïnes: les càrregues no estan disposades de forma uniforme sinó que l’oxigen del carboxílic es queda amb la càrrega negativa i el nitrogen de l’amino es queda amb la càrrega positiva el que provoca la generació d’un dipol. Aquest aspecte és molt important per les estructures secundàries i terciàries ja que el dipol es va invertint de forma consecutiva si el posem al voltant d’un eix. Aquest és un enllaç molt especial ja que té un caràcter de doble enllaç parcial: no és ni un enllaç simple ni doble sinó que es compota com un enllaç entremig de les dues propietats i això és perquè està estabilitzat per ressonància de manera que a la pràctica podem considerar que té una distribució asimètrica de la càrrega i un enllaç doble parcial.
Aquesta estabilització per ressonància és una forma d’estabilitzar els enllaços molt forta, això vol dir que la constant de trencament d’aquest enllaç, que no és un enllaç doble, té una constant d’hidròlisi molt baixa i per tant una vida mitjana de mig mil·lenni en condicions no catalitzades, és a dir, les proteïnes no es trenquen sense la presciència d’un enzim. Com que el caràcter és de doble enllaç parcial la distància entre el carboni i el nitrogen (que formen l’enllaç peptídic) és superior a la d’un enllaç simple i inferior a la d’un enllaç doble, és a dir, els àtoms estan en un entremig.
1 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Aquest caràcter a més provoca que la molècula no pugui rotar al voltant de l’enllaç peptídic de manera que els 6 àtoms que connecten (carboni, nitrogen, carboni α, hidrogen) estan en un mateix pla perquè tots depenen de l’enllaç peptídic. Això provoca que haguem de veure les proteïnes com una espècie de “plaques”.
Sabem que normalment trobem les proteïnes en forma globular en que els enllaços poden girar al voltant del carboni α, de manera que els dos plans poden girar respectivament.
Els dos girs es donen al voltant del mateix residu: trobem el nitrogen d’un residu i del carboni que giren en el carboni α, que tindrà un cadena lateral determinada α.
Com que no poden rotar per l’enllaç peptídic roten pel residu que els uneix (carboni α ) i això defineix dos angles ben diferenciats: angle fi (Ø) i angle psi (ψ). Aquests angles poden girat totalment tot i que en general els moviments que es generen són: +180 (gir a la dreta) o -180 (gir a l’esquerra) i són els angles diedres de la proteïna. Per tal d’anomenar ens angles d’una proteïna diem per exemple Alanina 1 (180 180) i cal tenir present que coneixent tots els angles dièdres d’una proteïna podem conèixer totalment la seva conformació a l’espai. Aquests angles no ens diuen res de la cadena lateral sinó que només ens informen dels angles de gir de l’esquelet principal, de manera que no ens aporten informació sobre les cadenes laterals i conseqüentment no podrem dibuixar l’estructura secundària.
Un enllaç que no pot girar pot tenir la conformació cis o trans, és a dir aquest enllaç pot deixar les cadenes laterals en llocs oposats (trans) o a prop en l’espai (cis). Com qualsevol enllaç doble sabem que pot tenir ambdues conformacions però que la forma cis té més dificultats estèriques de manera que la immensa majoria d’enllaços peptídics tenen aquesta conformació trans.
2 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Una excepció del cas anterior és la prolina que sabem que és un iminoàcid ja que té la cadena lateral ciclada i per tant no tenim l’hidrogen unit al nitrogen. Aquest aspecte provoca que els enllaços cis i trans tinguin una energia semblant, no perquè els dos siguin “bons” sinó perquè realment són igual de dolents ja que aproximen molt les cadenes laterals. Cal tenir present que segueix sent més estable trans que cis però hi ha una proporció (1:4) de cis que abans no estava present.
Aquest aspecte és molt important perquè no es poden interconvertir: si un enllaç ha d’estar en trans i aquest es queda en posició cis la proteïna no serà funcional. Existeix un enzim anomenat prolil – trans – isomerasa que s’encarrega d’acumular aquests enllaços que no han quedat en la seva configuració correcte i catalitzar el canvi. Aquesta catalització és molt lenta però cal tenir present que és un enzim molt important.
PÈPTIDS La majoria dels pèptids que tenim són bioactius, són molècules amb activitat biològica. En molts casos veurem que aquests pèptids tenen ponts disulfur, tenen pocs residus però molt freqüentment tenen aquest tipus d’enllaç perquè com són molt petits no poden formar un nucli hidrofòbic, no tinc suficients residus per formar una capa externa polar i una capa externa apolar de manera que l’enllaç disulfur els hi dona una conformació especial i concreta que l’obliga a plegar-se amb una certa conformació.
Sabem que els pèptids naturals són neurotransmissors, hormones, antibiòtics... La gran majoria de proteïnes, de factors, no reconeixen la seqüència del pèptid únicament sinó que reconeixen la conformació i la seqüència. Sabem que la oxitocina (hormona molt important pel part) i la vasopressina (hormona que controla els nivells salins) a la pràctica són pràcticament iguals ja que només presenten dos canvis:  Isolecuina i Phenilalanina: tenen els dos caràcters hidrofòbics i per tant no és important.
 Leucina i Arginina: canvi d’un aminoàcid hidrofòbic per un carregat positivament El receptor de la vasopressina té un residu carregat negativament que permet la unió i que a més no pot reconèixer la Leucina, de la mateixa manera el receptor d’oxitocina té un residu hidrofòbic que només reconeix la leucina i no pot reconèixer una càrrega.
3 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Els pèptids en general són molècules petites i molt sovint unides per ponts disulfur.
Cal tenir present que el fet que siguin petites no vol dir que no siguin importants ja que per exemple dins d’aquest grup trobem la insulina o d’altres molècules amb funcions biològiques molt importants. Un altre exemple de pèptid és la α-amanitin, una molècula que amb uns micrograms són suficients per matar aproximadament a 100 persones ja que és una estructura molt tòxica entre d’altres coses perquè no es pot degrada fàcilment, no tenim enzims. Te una estructura cílica i tot i que la molècula només tingui una cisteïna ha aconseguit elaborar un enllaç covalent entre la cisteïna i el triptòfan, que queda exposat a solvent a més de tenir la molècula tancada ja que en l’extrem N i C terminal formen un nou enllaç peptídic i amida.
Reactivitat química dels pèptids Efecte sobre el pKa La reactivitat d’un grup no només depèn del caràcter del grup sinó que també depèn del seu entorn químic, per això el carboxílic (també l’amino) té un pka diferent quan el trobem dins d’un pèptid que no lliure o quan està en N-terminal o en una cadena lateral, d’aquesta manera qualsevol grup químic té una reactivitat que depèn del seu entorn dielèctric.
L’agua té una constant dielèctrica gran: quan tinguem grups ionitzables al costat de l’aigua els tindrem ionitzats però els mateixos grups quan els trobem al interior (que es pot veure com un solvent orgànic, amb una constant molt baixa) els grups estaran protonats. D’aquesta manera sabem que els grups tindran propietats molt diferents en funció si estan dins o fora la proteïna.
Un exemple d’aquest cas és la histidina, un residu molt important perquè té un pka a prop de pH fisiològic i per tant el seu estat de protonació pot variar al voltant d’aquest pH, podent donar o captar electrons. El seu pKa modula el seu entorn químic: les histidines dels enzims estan en entorns químics que provoquen que siguin reactiven en aquell entorn i el seu pKa pot ser molt diferent al que tenen en dissolució.
Per demostrar que realment el pKa dels aminoàcids la seva reactivitat depenia del seu entorn es va elaborar una experimentació amb una determinada proteïna en la que es van canviar residus que estiguessin a prop de l’espai d’una histidina. Es va canviar un aspàrtic (36) a glutamina: sabem que l’aspàrtic està carregat negativament però la glutamina no està carregada tot i que es polar, d’aquesta manera el que s’està fent és eliminar una càrrega negativa de la molècula el que provoca que el pKa de la histidina baixi perquè si té un entorn carregat negativament el protó té més dificultats per marxar ja que es sent atret.
4 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Si es canvia un aspàrtic (99) i un glutàmic (156) per serina el que fem és treure dues càrregues negatives de l’entorn de manera que el pKa de la histidina baixa encara més ja que tenim menys càrrega que retingui el protó. Un altre canvi que també es va elaborar va ser els mateixos aminoàcids per lisines de manera que s’eliminen dues càrregues negatives però s’afegeixen dues càrregues positives el que equival a treure 4 càrregues negatives de manera que el pKa baixa encara més: la reactivitat de la molècula pot arribar a baixar 10 vegades ja que és una escala logarítmica.
Efecte sobre la solubilitat 0La ionització dels aminoàcids també afecta a la seva solubilitat, que pot ser un problema quan volem purificar proteïnes ja que una proteïna no sempre té una solubilitat molt alta i no sempre està dissenyada per viure en l’entorn del tub d’assaig. Cal tenir present que si una proteïna no és soluble agrega i no serveix per res. La solubilitat depèn de:  Concentració de sal  pH  temperatura  solvents orgànics En definitiva podem dir que la solubilitat depèn del seu estat d’ionització, amb el que podem jugar, és a dir, podem elaborar que una proteïna estigui més o menys ionitzada i que per tant sigui més o menys soluble. Un exemple de la força d’ionització es com comprovar segons: en general quan comencem a afegir sal a una solució en que tenim una proteïna la solubilitat augmenta (això ja ens diu que mai podem purificar una proteïna amb aigua destil·lada perquè agregarà) perquè les càrregues positives i negatives poden interaccionar entre elles formant ponts salins.
5 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Hi ha unes sals, especialment aquelles que tenen sulfat sòdic o d’amoni que tenen una propietat molt important: a partir d’una certa concentració tenen una gran afinitat per l’aigua (sempre tenen aquesta afinitat) de manera que segresten l’aigua que trobem a la superfície de la proteïna i això el que fa és que les regions petites i hidrofòbiques interaccionin entre elles formant agregats, que precipiten. En aquest cas concret això no és molt bo perquè el que volem és tenir una proteïna purificada a una certa concentració que permeti l’assaig (la concentració de la proteïna és també molt important i el mètode més barat i còmode és introduir sulfat d’amoni). La proteïna que tinc en dissolució comença a precipitar, que en ficar-la en centrifugació ens donarà un pellet constituït per la dissolució de la proteïna. En general els agregats són dolents si no els podem dissoldre tot i que si podem arribar a dissoldre aquest precipitat sabem que desagregarà i l’estructura proteica no es veurà afectada.
SEQÜÈNCIA AMINOÀCIDICA I EVOLUCIÓ Seqüència d’aminoàcids El dogma central de la biologia ens diu que: seqüència de DNA  seqüència d’una proteïna  una conformació  una funció, i aquesta regla en general és certa amb algunes excepcions.
La longitud d’una proteïna es troba entre 30/40 a 25.000 aminoàcid si per tant la mida mínima d’una proteïna es podria considerar que és de 30 a 60 aminoàcids i aquest tamany està determinat per la mida del ribosoma. Observem doncs que els ribosomes no poden sintetitzar pèptids per la seva mida de manera que existeixen a la cèl·lula perquè es sintetitzen com a molècules més grans i es processen. El nombre de seqüències que podem assolir amb només 20 aminoàcids és astronòmica, molt gran; si imaginem una proteïna d’uns 300 aminoàcids (que és el tipus més normal) el nombre de combinacions possibles per formar la seqüència es de 20 300 i només una petita part d’aquestes combinacions donaran lloc a una proteïna funcional.
Diferències evolutives entre proteïnes Així doncs sabem que si dues proteïnes s’assemblen en seqüència no pot ser casual perquè les combinacions possibles són molt grans, de manera que si hi ha aquesta semblança direm que les proteïnes estan relacionades des del punt de vista evolutiu. Aquells investigadors dedicats a estudiar l’evolució de les proteïnes el que fan és extreure cèl·lules d’organismes i mirar la seqüència d’una o dos proteïnes (citocrom C, hemoglobina) i aquesta seqüència es compara amb una espècie coneguda. Observem doncs que aquesta comparació ens permet diferenciar l’espècie de forma definitiva. Per comparar la seqüència cal elaborar una matriu (que ens donarà un número) en la que es compari cada una d’aquestes seqüències el que ens permetrà elaborar un arbre evolutiu en que podem saber qui prové de qui i quina es la distancia evolutiva en temps geològic entre una espècie i una altra.
6 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Observem una matriu de diferència que es diu per la proteïna del citocrom C de diferents espècies (no hi ha bacteris perquè el citocrom es localitza a la mitocòndria) les diferències entre elles, ens diu les diferències entre espècies. Observem que entre l’home i chimpancé no hi ha cap canvi, entre l’home i un mico hi ha únicament 1 canvi mentre que amb un llevat presenta 51 canvis. Quan més a prop estic d’aquest organisme més s’assembla la meva proteïna de manera que aquesta taula ens classifica les espècies en funció de les diferències que hi ha entre la seqüència d’aquesta proteïna.
Només mirant la seqüència podem dir quines espècies s’assemblen perquè, per exemple, la proteïna de llevats va patir canvis de conformació i seqüència i per tant en comparació a la proteïna del home es troba lluny en seqüència. La diferència entre aus i mamífers és de 10 mentre que la diferència entre totes les aus és aproximadament de 2. La diferència entre organismes pluricel·lulars i unicel·lulars és de 50, de manera que en general com més gran és la diferència més allunyats estan evolutivament.
Això hem serveix també per flaquejar, per mirar una família de proteïnes en la qual una branca molt petita estaran molt relacionades i cada branca més gran estaran més lluny. Observem en el següent esquema la família de les proteïnes quinases en que aconseguim saber a quina família específica corresponen. Les seqüències de quinases no es varien per espècie sinó per tipus de quinasa i per tant en la funció que tenen. Si una proteïna reconeix com a substrat a una ubiquitina, totes les proteïnes que reconeguin la mateixa espècie quedaran agrupades independentment de l’organisme en que es manifestin.
Podem construir també un arbre filogenètic basat en les diferències del citocrom C, una molècula present en tots els eucariotes perquè es troba a la cadena respiratòria de les mitocòndries. Aquest fet permet construir un arbre i saber a partir de l’espècie que es comencen a diversificar plantes, fongs i animals. Observant l’arbre es pot comparar que els llevats s’assemblen més entre ells que amb qualsevol dels altres, un aspecte molt lògic.
7 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Evolució de les proteïnes No totes les proteïnes evolucionen a la mateixa velocitat, les proteïnes evolucionen (acumulen mutacions i divergeixen de la seqüència inicial) i aquest procés no sempre és ràpid. Les proteïnes essencials si muten i deixen de funcionar l’organisme morirà de manera que com més important sigui la proteïna per l’organisme més lentament mutarà i conseqüentment més lentament evolucionarà.
En el gràfic podem observar el nombre de canvis per cada 100 residus, és a dir, quans canvis s’acumulen en una proteïna per cada 100 residus que té a mesura que passa el temps (en el gràfic s’acumulen 1.000 anys). El punt 0 és el que ens trobem actualment. Observem que tenim 4 proteïnes marcades:  La histona H4 està al nucleosoma i s’encarrega d’empaquetar el DNA. Aquest empaquetament és una funció bàsica i per tant si tenim una mutació i la histona no funciona l’organisme no és viable. Aquest aspecte provoca que la histona H4 evolucioni de manera molt lenta, acumula una tassa de mutació molt lentament, sent el promig que acumula una mutació cada 600 milions d’anys de manera que entre vertebrats i insectes com a promig hi ha 1 o 2 canvis per cada 100 aminoàcids, és a dir, són pràcticament iguals.
 El citocrom C també es molt important per la cadena respiratòria i tot i ser molt important admet més canvis que l’anterior en zones no funcionals que poden acomodar els canvis i per tant acomoden l’evolució i divergència entre diferents espècies.
 La hemoglobina evoluciona ràpidament  Els fibrinopèptids (producte d’una proteòlisi limitada) divergeixen ràpidament entre mamífers.
Si volem veure com evolucionen els mamífers no podem agafar una proteïna conservada evolutivament com la histona H4 sinó una que tingui una tassa d’evolució molt ràpida mentre que si volem veure les diferències entre tots els organismes hauríem d’agafar una proteïna amb una tassa d’evolució moderada, que ens permeti modelar i observar tot l’espectre.
8 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Variabilitat en proteïnes L’evolució ens permet canviar la seqüència perquè la forma de la proteïna és la que determina en major quantitat la seva funció i aquesta forma o conformació pot ser adoptada per diferents seqüències. En general l’ordre de conservació de les propietats és el següent:  Conformació  Longitud de la seqüència (petites delecions i modificacions però poques per poder adoptar la mateixa conformació)  Seqüència d’aminoàcids  Posició del tercer codó del codi genètic (aquest tercer codó és pràcticament no codificant ja que si canvia en molts casos la proteïna codifica pel mateix aminoàcid) Més variació SEQÜENCIACIÓ D’UNA PROTEÏNA Mètodes experimentals Podem saber la seqüència d’una proteïna llegint la seqüència del gen, tenint present que totes les proteïnes humanes estan seqüenciades perquè ho està el seu genoma. Llegint la seqüència podem determinar la seqüència de la proteïna però no podem conèixer res de la seva forma activa, és a dir, pot ser que aquesta forma activa hagi patit proteòlisis o d’altes fenòmens de manera que normalment el que es fa és seqüenciar una proteïna i estudiar-la.
Mètodes teòrics Existeixen dos mètodes per mitjà dels quals puc seqüenciar una proteïna i pels dos no és necessari una gran quantitat de proteïna purificada sinó que si podem veure la proteïna en una banda d’electroforesis la podem seqüenciar.
Seqüenciació d’Edman Per elaborar la seqüenciació d’Edman és necessari un seqüenciador de proteïnes, una màquina que elabora reaccions molt ràpid ja que ho fa automàticament. Aquesta és la tècnica més antiga i el resultat de la purificació serà millor o pitjor en funció de la purificació que presenti la proteïna.
En aquest mètode es fa servir la reactivitat química del grup N- terminal (només tenim un extrem en tota la proteïna) que es reactiu sempre que està per sobre del seu pKa de manera que treballarem en un medi alcalí (àcid) en que l’extrem està protonat. Fem servir un reactiu que no és igual però té la mateixa funció que el clorur de benzil i és anomenat PITC: el que farà és atacar el carboni que està enllaçat aper dos enllaços dobles i això fa que s’uneixi al N-terminal de la proteïna, que quedarà marcada.
9 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Amb el clorur de benzil només ens quedaria macat un residu que es passaria per cromatografia per saber quin es.
Aquest complex PITC és molt poc estable en medi àcid i es fa servir com un agent trifuoracètic (àcid molt fort) i en aquestes condicions el que es produeix és un atac de manera que s’allibera per una banda la seqüència de la proteïna amb un aminoàcid menys i per tant amb un nou extrem N-terminal i l’aminoàcid original situat en aquesta posició unit amb un compost determinat que té color i per tant es visible. El que es fa és, després de la reacció, s’introdueix en una columna (com en els derivats del benzil) i en funció del temps de dilució sabem quin aminoàcid és. Existeixen patrons que es comparen de derivats d’aquests aminoàcids i ens permet saber el temps de dilució.
Sabem que el residu en posició 2 anteriorment ara és el nou residu en N-terminal per tant si netegem tot es pot tornar a elaborar la reacció, és a dir, podem tornar a introduir PITC, medi alcalí, acidificar i tornar a tenir un nou aminoàcid que correspondrà a la segona posició de la meva proteïna. D’aquesta manera vaig llegint quin aminoàcid està en posició Nterminal.
Aquesta màquina (abans es feia manualment) el que et dona són cromatogrames i el que tu has de llegir és quina és l’elució de l’aminoàcid. Teòricament si que podem arribar a seqüenciar una proteïna de 150 aminoàcids però cal tenir present que aquesta reacció té una eficiència del 90%, és a dir, quan elaborem el primer tall el 90% de les molècules són tallades i reaccionen amb el compost però hi ha un 10% restant que entrarà en el segon cicle de la reacció perquè no són tallat i per tant entraran a reaccionar amb la proteïna ja tallada i que té un nou extrem N-terminal. Quan elaborem un cromatograma al inici tindrem un pic únic corresponent al derivat del primer aminoàcid (suposem Alanina) mentre que en segon pic el que tindré es un pic d’alanina (primer aminoàcid) ja que hi havia una proporció no tallada) i un segon pic de Valina (suposem que és el segon aminoàcid) de manera que al anar acumulant cicles també vaig acumulant el 10% de les molècules que no es tallin. Aquest fet no presenta un problema sempre que els aminoàcids siguin diferents però si són iguals no podrem diferenciar quins corresponen a cada tall, no sabem si la contribució és del primer o del segon aminoàcid.
10 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Seqüenciació d’una proteïna llarga A la pràctica aquesta tècnica ens permet seqüenciar fins a 100 aminoàcids tot i que normalment s’elabora amb uns 40 aminoàcids de manera que si volem seqüenciar una proteïna molt gran és necessari tallar-la el que suposa un problema ja que hem de conèixer quins són els pèptids resultats i al elaborar el tall no sabem en quina posició talla i en conseqüència no sabem quin són els pèptids. Si suposem que tallem de forma equidistant, codifico els pèptids i el seqüencio no hi ha manera de saber quin és el primer, segon o tercer.
Tenim una proteïna amb un pont disulfur; el primer que hem fer és saber quina és la seva composició (quins aminoàcids té però no l’ordre d’aquests) de manera que el primer que faré és una hidròlisis total. Si introduïm el pèptid o proteïna a pH molt àcid (per exemple amb àcid clorhídric) i a una temperatura elevada podem arribar a trencar l’enllaç peptídic. Un cop tenim tots els aminoàcids els podem marcar i introduir-los en una columna per quantificar quants aminoàcids tinc de cada tipus (això ho sabem perquè hi ha un estàndard dels pics).
Per poder elaborar talls en la proteïna cal tenir present que aquesta ha de ser accessible i per tant no pot esta plegada de manera que l’experimentació sempre s’elabora en condicions desnaturalitzants. A més els ponts disulfur s’han de reduir per evitar les unions covalents i confusions en l’obtenció dels pèptids.
11 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 A continuació el que farem es tallar específicament la cadena sabent quins aminoàcids té, en general durant les experimentacions s’utilitzen tres reactius diferents. Un exemple de tall és amb tripsina, una eina enzimàtica que talla en els bàsics, arginina i lisina i que en aquest cas donarà lloc a 4 pèptids diferents (ha elaborat 3 talls) que els portaré a seqüenciació amb Edman, per exemple. Més tard tallarem amb bromur de cianogen, una eina química, (talla darrere de meteonines) el que donarà lloc a 3 pèptids diferents als anteriors. Una vegada hem fet això hem d’orientar els pèptids i per tant necessitem saber quin és el primer aminoàcid de manera que farem reaccionar amb FDNB, que reacciona amb N-terminal quan aquest està desprotonat el que ens marcarà el primer aminoàcid. Per tal de conèixer l’aminoàcid hidrolitzem i passem per una columna.
Tenint els coneixements anteriors ara podem ordenar els pèptids de cada tall ja que sabem quin és el primer aminoàcid, d’aquesta manera sabem que la proteïna comença amb T-2 (seguint la imatge) i també podem saber quin és el pèptid que es troba en C-terminal ja que serà l’únic que no acabi en lisina o arginina de manera que el pèptid T-3 és el que es troba al final ja que acaba en aspàrtic. Els altres dos pèptids no els podem ordenar però gràcies al tall amb bromur de cianogen (és cancerigen) també podem conèixer els dos extrems de la proteïna i per superposició dels pèptids inicials i finals podem conèixer aquells que estan entremig.
En general sabem que com més llarga sigui la proteïna més reactius són necessaris. Cal tenir present que hi ha reactius molt específics que només tallen darrere d’un determinat aminoàcid. La seqüenciació dels pèptids sempre es fa amb Edman perquè és una seqüenciació petita.
Espectrometria de masses És un tipus de seqüenciació més nova. Agafem la proteïna i hem de tenir un sistema que li introdueixi càrrega, un cop carregada la farem volar, accelerar en un camp magnètic per diferència de potencial, aquest ens permet seleccionar els ions (proteïna carregada) amb una relació massa/carrega i després tindré un detector que hem digui quants tinc de cada tipus.
Aqueta tècnica serveix per seqüenciar (hi ha dos tècniques diferents) i per d’altres coses.
12 Judith González Gallego a) Química i enginyeria de proteïnes T2 Técnica amb electroesprai (ESI) Aquesta permet treballar en solucions i pot tenir més d’una proteïna. S’aplica una diferència de potencial molt forta (3.000 V) mentre que el lloc d’entrada a la càmera estarà a 8 V. El que es genera es una espècie d’esprai on les proteïnes o la solució van adquirint dues propietats diferenciades:  Perdent electrons i per tant es carreguen positivament  Perdent aigua El que entrarà al tub de 8V són proteïnes amb càrregues positives addicionals. El que les proteïnes triguen travessar aquest tub és de milisegons i dependrà de la seva massa i la seva càrrega. Imaginem que només tenim una proteïna i que aquesta vola de forma desplegada (sempre ho fan) de manera que adquirirà tres ions, +30, +40 i +50 per tant la que té més càrrega per la mateixa massa volarà més ràpid. Aquesta forma va guanyar el premi Nobel de química ja que és una tècnica molt utilitzada.
El que ens dona aquesta tècnica és un pic de dinosaurus, totes aquestes molècules (tots els pics) corresponen a la mateixa proteïna i veurem que això ens permet mesurar la massa molecular d’una forma molt exacta.
13 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 b) MALDI-TOF Aquesta segona tècnica és com l’ electroesprai amb la única diferència és la forma en que es càrrega la proteïna. En aquest cas tenim una matriu molt petita (tant com la punta d’un llapis) en la que diposito la proteïna, a més hi ha un compost químic que té una propietat i és que és capaç de donar protons a les molècules adjacents. Així doncs el que fem és col·locar la nostra proteïna sobre la matriu i la irradiem amb un làser el que provoca una transferència de protons des de la matriu fins la proteïna. En el MADLI sempre hi ha menys càrregues, la transferència de protons és menor. Sabem que la molècula que té més càrregues va més ràpid perquè té la mateixa massa però el doble de càrrega.
Obtenim diferents pics que corresponen a la mateixa proteïna i són relacions de massa càrrega.
14 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Anàlisi dels pics obtinguts anteriorment Cal tenir present que aquests pics es poden analitzar per diferents tècniques (s’hagi elaborat l’experimentació amb electroesprai o amb MALDI-TOF).
a) Anàlisis per mitjà d’un mases: càlcul del pes molecular Observem en la imatge molts pics que corresponen a una mateixa proteïna (normalment si hi ha molts pics es que l’experimentació s’ha elaborat amb ESI) de manera que tinc moltes relacions massa – càrrega i per fer-ho fem servir la següent equació que es satisfà per cadascun dels pics: m/z = (MW + nH  MW: massa molecular de la proteïna  nH+:nombre de protons adquirits  n: càrrega de la proteïna + )/n on sabem que: Tenim una equació amb dues incògnites (pes molecular i n) però si comparem dos pics ho podrem resoldre, és a dir, per comparació de pics puc arribar a tenir 8 incògnites i 12 equacions de manera que es pot resoldre amb molta exactitud.
Aquesta màquina ens dona un promig i permet analitzar proteïnes fins a 900 KDa sense purificar.
Té una resolució de 40ppm,és a dir, si la proteïna té un milió de Daltons ens equivoquem en només 40 Daltons i si la proteïna té 100 Daltons només ens equivoquem en 04, Daltons de manera que el pes molecular que obtenim per mitjà d’aquesta tècnica és molt precís i és doncs una tècnica molt important en el redisseny de proteïnes. La sensibilitat d’aquesta tècnica és d’attomol: necessito molt poca proteïna i la tècnica en permet distingir una hexoquinasa normal d’una que només ha canviat els seus protons per dauteri, és a dir, és capaç de captar el canvi de 4 Daltons. També ens permet veure si la proteïna està fosforil·lada perquè tindrem un fosfat més de pes, en general podem dir que pot trobar qualsevol modificació postraduccional.
b) Masses – masses: seqüenciar una proteïna Per tal de seqüenciar una proteïna utilitzem un masses – masses està constituït per dos aparells de masses (és l’explicat anteriorment) en tàndem. En el masses de nou el que haig de fer és fragmentar la proteïna en pèptids, però només necessito un reactiu, com per exemple la tripsina, per generar pèptids dels quals analitzaré el seu pes molecular. El mateix pèptid l’envio a una càmera de col·lisió que conté un gas noble i en les condicions que ho envio col·lisionarà amb el gas i el que es trencarà serà l’enllaç peptídic (en el més útil dels casos).
15 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Podem ajustar l’energia per elaborar que es trenqui únicament un enllaç peptídic de manera que genero fragments que difereixen en un únic aminoàcid. En aquest cas no genero tots els aminoàcids individualment sinó fragments que es solapen i difereixen d’un aminoàcid. Si passem això per un masses el que tindré son pics, cada pic es diferencia per un aminoàcid que no està i per tant la diferència entre dos pèptids correspondrà a la presència d’un determinat aminoàcid on la distància a la qual es situen els pics està relacionada amb les propietats dels aminoàcids de manera que podem, analitzant els pics, saber l’aminoàcid que falta en cada moment.
Aquest aspecte ens permet llegir la seqüència seguida, de forma immediata. Sabem que els aminoàcids mesuren al voltant de 110 Da de manera que no ens podem equivocar en l’identificació perquè l’error està al voltant de 0,004 , és a dir, tinc una sensibilitat de tattamol, podem seqüenciar per mitjà d’aquesta tècnica qualsevol cosa, fins i tot aquelles que no veiem.
Per exemple, si tenim una proteïna que volem seqüenciar totalment el primer que farem es digerir-la amb tripsina (dona talls amb molta especificitat i de qualitat). Un dels principals problemes quan vull treballar amb els masses i vull fer digestions és la manipulació de les mostres perquè tot i que la proteïna sigui pura pot estar contaminada per una altra proteïna que nosaltres tenim de manera que al digerir amb tripsina obtinc el tall de les dues proteïnes: la nostra proteïna i la queratina ja que aquesta tècnica és molt sensible i si queda queratina en les cèl·lules mortes tot i que no la puguem observar la tècnica la detecta. Així doncs la majoria de programes tenen una espècie d’eina que permet suprimir la queratina.
El que fem és calibrar l’aparell perquè aquest pes molecular el faci passar a una altra màquina, al segon espectrofotòmetre de masses però abans d’arribar a aquest es troba amb un gas noble que li provoca una col·lisió. L’energia d’aquesta col·lisió pot ser controlada de manera que només es trenca l’enllaç peptídic el que permet generar fragments amb un nombre determinat d’aminoàcids. Aquest aspecte genera dos tipus d’ions:  Ions tipus Y: és el que queda en l’extrem C-terminal  Ions tipus B: queden a l’extrem N-terminal Calibrem les màquines només per veure els ions tipus Y ja que si observem els dos és un procés molt caòtic. Cal tenir present que aquesta segona fragmentació no està controlada, no sabem on es produirà el que si podem fer es controlar l’energia perquè es trenqui com a màxim un enllaç peptídic. Aquest fet em permet tenir una diferència de pes molecular entre cada fragment d’un aminoàcid i per tant, sabent el pes molecular de cada aminoàcid podem conèixer la seqüència tenint present que el pèptid sempre falta en N-terminal i l’extrem C-terminal sempre és el mateix.
16 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Aquesta experimentació és molt exacte i la distància entre dos masses (pics) depenen del tipus d’aminoàcids: si l’aminoàcid és molt petit la distància serà també molt petita. Aquesta és una màquina amb molta sensibilitat i precisió. Normalment no necessitem elaborar aquest procediment, és a dir, només s’utilitza quan estem dissenyant proteïnes noves o bé quan estic trobant proteïnes que encara no s’han trobat i això és la minoria de vegades perquè normalment es treballa amb proteïnes conegudes aïllades d’un tipus de teixit.
c) Finger print: identificació de la seqüència En un gel SDS ens surten una sèrie de bandes que depenen del pes molecular, recordem que en un gel es proteïnes corren com el logaritme del seu pes molecular, és a dir, la distància recorreguda depèn d’aquest factor (logMr). Aquest gel és un gel bidimensional (actualment és un estàndard en investigació) que permet separar en dues dimensions i per tant, en funció de dos paràmetres:  Punt isoelèctric  Pes molecular Imaginem que la primera dimensió la corro en un tubet (del tamany d’un boli) on les proteïnes correran segons el seu punt isoelèctric, el que em permetrà electroenfocar les proteïnes fins al punt isoelèctric en que la càrrega neta és 0 i és allà on es quedaran quietes. Sabem que les proteïnes corren en el seu estat natiu. Aquest tubet el col·loquem a sobre del gel i el que fem, sota d’aquest es posar un gel SDS de manera que la primera dimensió s’ha separat segons el punt isoelèctric i ara elaborem la segona dimensió, que baixarà segons el pes molecular. D’aquesta manera sabem que les línies horitzontals tenen el mateix pes molecular i les verticals tenen totes el mateix punt isoelèctric.
Aquesta experimentació permet augmentar molt la resolució ja que es molt difícil que una proteïna tingui el mateix punt isoelèctric i el mateix pes molecular. És una tècnica molt utilitzada en clínica ja que amb el sèrum d’un pacient podem buscar marcadors, detectem si en el pacient apareixen o desapareixen unes bandes. Actualment hi ha una base de dades i el que fas es comparar el teu gel amb aquest i determinar una sèrie d’aspectes.
Si el que volem fer és identificar una proteïna tallem amb un bisturí i col·loquem en un tubet i elaborem una digestió enzimàtic amb tripsina, el que ens generarà una sèrie de pèptids que introduirem en un masses. Aquests pèptids tindran una mida definida i aquest patró elaborat amb els masses té una massa definida que depèn de la quantitat d’arginines i lisines que tinguin i on estan col·locades i és un patró pràcticament únic per cada proteïna. El que elabora la màquina és treballar online, treballa amb bases de dades mundials i per tant obtindrem un patró que és comparat amb una base de dades que té els genomes seqüenciats dels organismes i les proteïnes que es poden generar a partir d’aquests genomes i per tant, els fragments que es generarien si talléssim amb el mateix enzim (tripsina). Al comparar amb la base de dades, si el patró correspon amb molta alta probabilitat (ja que el masses és molt exacte) a un trobat podem dir que és la proteïna que tenim i per tant no fa falta seqüenciar la proteïna perquè la seqüència ja està en la base de dades.
17 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 De forma general i esquemàtica podem entendre aquesta tècnica com: Això permet fer moltes coses, una d’elles és saber si una proteïna en l’interior cel·lular es troba format un complexe macromolecular (aquest aspecte és difícil de saber amb d’altres tècniques). Imaginem una proteïna C de la qual volem saber amb què interactua dins la cèl·lula: purificarem només la nostra proteïna i la columna purificarà la proteïna i tot el que estigui unida a ella dins la cèl·lula de manera que si eluïm i elaborem un gel SDS obtindrem tres bandes (per posar un exemple) una que correspondrà a la proteïna que coneixem i dos bandes més que no coneixem. Si retallem aquestes bandes i fem un bidimensional, massa i un fingerprint trobarem el codi de la proteïna.
D’aquesta manera observem que, en un experiment d’un dia tenim el complex amb el que està interaccionant la nostra proteïna al interior de la cèl·lula o bé quan la cèl·lula està elaborant una funció.
SÍNTESIS DE PÈPTIDS Per sintetitzar pèptids tenint aminoàcids hem de formar enllaços peptídics i per tant la síntesis s’elabora sempre sobre una reina (bola petita) que actua coma suport sòlid i normalment és una bola de poliestirè. Unirem l’aminoàcid de forma individual a la bola, sempre necessito que l’aminoàcid que entri tingui l’extrem N-terminal bloquejat amb un compost ja que es un extrem molt reactiu. Amb aquest bloqueig aconseguim eliminar la reactivitat de l’extrem i a més aconseguir que només reaccioni per un lloc l’aminoàcid (pel carboxil). Per col·locar el segon necessitarem que aquest també estigui bloquejat en Nterminal (es bloqueja gràcies al compost F-moc, que el trec del primer aminoàcid i el poso en el segon). La reacció amb el carboxil és molt poc reactiva i per tant hem d’activar-lo.
Ara el que fem es col·locar aquest aminoàcid en presència del primer aminoàcid per tal que es formi l’enllaç peptídic. El segon aminoàcid està bloquejat en N-terminal de manera que el desbloquegem per introduir el tercer aminoàcid, que el fem reaccionar i això es repeteix successivament.
18 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Observem un esquema de la síntesis: La síntesis que elaborem és lenta i sempre va en direcció C-terminal a N-terminal i per tant la síntesi química de pèptids funciona en sentit invers a la síntesis de proteïnes dins la cèl·lula. El gran problema de la síntesi de pèptid és que són molt cards perquè cal tenir present que les reaccions d’acoblament no són totalment eficients de manera que és possible que quan tinguem la molècula amb el primer aminoàcid no s’hagi unit res (el segon aminoàcids) en alguns casos i en d’altres que s’hagi unit el segon aminoàcids de manera que quan entri el tercer aminoàcid només una part de les molècules són les que volem i haurà unes altres que estaran malament unides i no seran útils. Aquest aspecte provoca que haguem de purificar el pèptid i comprovar amb un masses si el pèptid és correcte.
La síntesis de pèptids serveix per fer el que anomenem llibreries combinatòries que permet generar pèptids que continguin totes les combinacions d’aminoàcids. Imaginem tres aminoàcids (A,B,C) que poden ser els aminoàcids que crec que estan dins d’una seqüència. El que fem és elaborar una primera reacció en un tub on acoblem la reina a l’aminoàcid A, un altre reacció ho acoblem a l’aminoàcid B i per últim un tercer tub en que la reina estigui unida a l’aminoàcid C. Si barregem tots els tubs, tindrem una barreja de 3 reines (si treballem amb els 20 aminoàcids tenim una barreja de 20 reines) i el que farem es tornar-los a separar, però aquesta separació no és exacte, és a dir, en cada tub tinc reines A, B i C de manera que tinc totes les combinacions d’aminoàcids possibles.
19 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Aquest és un procés que augmenta el nombre de pèptids de forma exponencial de manera que si tenim 2 residus podem arribar a formar 400 pèptids diferents i amb 3 aminoàcids es poden generar 8.000 pèptids diferents.
20 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T2 Imaginem que sabem que hi ha una proteïna implicada en càncer que pot tenir un inhibidor de caràcter peptídic i per tant és un pèptid que funcionaria com a diana terapeuta. El que podem fer és estudiar amb molt detall aquest pèptid, saber quin és el seu centre actiu i el que s’acumula allà o bé podem elaborar una tècnica exponencial: unim la proteïna i imboitzim la reina de manera que fem passar tota la llibreria, si el pèptid que inhibeix aquesta proteïna és bo sabem que s’unirà a la proteïna que hem immobilitzat anteriorment.
Això té un problema: en la llibreria tenim una gran quantitat de pèptids de manera que el pèptid que jo estic buscant és una proporció molt petita d’una llibreria i per tant, com és una fracció tant petita, si la unió és feble no la podrem recuperar (per recuperar-la necessitem tenir molta afinitat). Es per aquest motiu que s’ha inventat un nou sistema basant en les llibreries amb microxips. Aquestes tenen un substrat en el qual immobilitzen un grup NH protegit però molt làbil i tot el xip està recobert amb aquest grup i a la vegada té coordenades, de manera que jo se on està cada pèptid.
Al inici de l’experimentació tots són iguals però el que podem fer és activar selectivament alguns d’aquests grups NH perquè siguin reactius i això ho fem il·luminant amb llum ultraviolada. El que passa és que el protector marxa i per tant el que podem fer és introduir a la solució l’aminoàcid que vulguem però aquest només es podrà unir als llocs que prèviament he activat (per exemple, si introdueixo lisina només s’introduirà als llocs activats) i a continuació podem introduir un altre aminoàcid activant uns altres llocs (com per exemple glicina). Amb això aconsegueixo saber en cadascun dels punts quina és la seqüència, és a dir, coneixem la seqüència per totes les coordenades. Ara podem agafar la quinasa i marcar-la amb un florofor, passar-la per la llibreria i s’unirà al pèptid de manera que coneixem la coordenada del xip que ens interessa.
21 ...