Bio molecular (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2014
Páginas 82
Fecha de subida 27/09/2016
Descargas 31
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 1. ANATOMÍA DEL GENOMA.
El DNA com a material genètic. Flux de la informació genètica.
Els àcids nucleics són el material genètic dels organismes i la seva funció és emmagatzemar i expressar la informació genètica. L’estructura de totes les proteïnes ( i, en últim terme, de totes les biomolècules i de cadascun dels components cel·lulars) és producte de la informació programada en la seqüència de nucleòtids dels àcids nucleics de la cèl·lula.
La capacitat d’emmagatzemar i transmetre informació genètica sobre la naturalesa química d’una generació a la següent és el requisit bàsic de la vida.
Hi ha dos tipus d’àcids nucleics química, estructural i funcionalment diferents: • • El DNA, àcid desoxiribonucleic, (“desoxyribonucleic acid”).
L’RNA, àcid ribonucleic, (“ribonucleic acid”).
En la majoria dels éssers vius, són les molècules de DNA les que codifiquen la informació genètica. El DNA conserva i transmet la informació biològica que caracteritza a un individu i a una espècie.
El màxim grau d’empaquetament de la informació genètica són els cromosomes, que en el seu conjunt constitueixen el genoma. Un cromosoma està format per gens.
Els gens (unitats funcionals) són regions definides del genoma que contenen la informació necessària per produir una molècula d’RNA o una cadena polipeptídica funcional. És a dir, és un fragment de DNA que conté la informació per un producte funcional ja sigui una proteïna o una molècula de RNA ribosomal o de transferència.
No podem passar directament de DNA a proteïna → Cal passar a RNA missatger. L’RNA missatger NO és una molècula funcional. Entre altres funcions, l’ RNA participa en el flux de la informació genètica com a molècula codificadora intermediària entre el DNA i la proteïna.
El codi genètic ens permet transformar el llenguatge de bases de l’ADN en el llenguatge d’aminoàcids de les proteïnes. El codi genètic és pràcticament universal (universal pel que fa al nucli però no pel que fa al DNA mitocondrial).
Evidències del DNA com a portador de la informació genètica Experiments de Griffith (1928) Es va treballar amb dues soques d’ Streptococcus pneumonia, una soca era letal i l’altre no. La soca letal tenia una càpsida tòxica de polisacàrids que matava els ratolins (encapsulada llisa).
En canvi, l’altra soca no tenia aquesta càpsula i era rugosa.
Quan escalfaven les bactèries nocives, les proteïnes es destruïen i, al injectar-les al ratolí, aquest no moria.
Quan els hi injectaven les bactèries no virulentes tampoc morien.
Quan injectaven als ratolins una mescla de bacteris no virulents i bacteris virulents morts per calor s’observava que al injectar-ho al ratolí si que moria.
Van arribar a la conclusió de què en la mostra no virulenta i escalfada hi havia algun component que transformava els bacteris no virulents en letals. Quin era aquest factor transformador? Experiment d’Avey-McLeod- McCarty (1944) Ara es tracta de descobrir quin és aquest factor transformador.
Si els bacteris virulents es tractaven amb ribonucleases o proteases i s’injectaven al ratolí, aquest moria. Això volia dir que el factor transformador era resistent a aquestes proteases, per tant no podia ser una proteïna.
En canvi, si es tractaven amb desoxiribonucleasa (enzim que destrueix DNA) el ratolí No moria. Per tant, el factor transformador era el DNA.
Experiment d’Hershey-Chase (1952) Aquest experiment va demostrar que és l’ADN el portador de la informació genètica, no les proteïnes.
Es va marcar les cobertes del virus amb 35S i el DNA amb 32P. Tots dos isòtops són radioactius. El DNA marcat entra a la cèl·lula hoste, es replica i crea nous virus.
Contingut de DNA i genomes d’alguns éssers vius No hi ha relació directa entre la quantitat de DNA i el nombre de cromosomes. Per exemple, el genoma és d’igual mida que l’humà, però només està composat per 3 parells de cromosomes molt grans.
Composició dels àcids nucleics: DNA i RNA Els àcids nucleics tenen un esquelet sucre-fosfat. La informació genètica, però, la porten les bases.
Un nucleòtid està compost per una base nitrogenada, un sucre i d’un a tres fosfats.
L’RNA i el DNA tenen sucres diferents: - RNA  sucre amb hidroxil  Ribosa DNA  Sucre sense hidroxil  Desoxiribosa Com podem veure, el sucre pot tenir un grup hidroxil o no, que és important perquè desestabilitza la molècula de RNA. Per aquest motiu, el DNA s’ha seleccionat com a portador de la informació genètica.
Les bases nitrogenades poden ser purines o pirimidines: - PURINA: Nom més petit, estructura més gran. Inclou la GUANINA i la ADENINA.
PIRIMIDINA: Nom més gran, estructura més petita. Són la CITOSINA, l’URACIL i la TIMINA.
La citosina té un grup amí. La citosina desaminada dóna lloc a l’uracil. L’uracil només es troba en el RNA, si el trobem en el DNA vol dir que és una citosina desaminada i, per tant, una mutació. La timina te un grup CH3 que la distingeix de l’uracil.
Per simbolitzar els carbonis de les bases fem servir una C. En canvi, els carbonis del sucre es representen amb una C’.
El sucre i la base nitrogenada es troben enllaçats mitjançant l’enllaç N-glicosídic. En el cas de les purines, l’enllaç te lloc entre el C’1 (és a dir, el carboni 1 del sucre) i el C9 (és a dir, el carboni 9 de la purina). En el cas de les pirimidines, l’enllaç te lloc entre el C’1 i el C1 (és a dir, el carboni 1 de la pirimidina).
La purina es pot trobar en posició syn o en posició anti. En canvi, si la purina girés en posició syn hi haurien repulsions electrostàtiques entre els àtoms d’oxigen  No estable  No factible.
Per tant, la pirimidina sempre en posició anti.
Una base enllaçada a un sucre forma un nucleòsid. Si a més de la base i el sucre afegim un fosfat obtenim un nucleòtid. Llavors, es tractarà d’un nucleòsid mono, di o tri substituït per distingir quants fosfats li hem afegit: NUCLEÒSID = BASE + SUCRE NUCLEÒTID = BASE + SUCRE + FOSFAT = NUCLEÒSID + FOSFAT Els nucleòsids trifosfat són les molècules precursores en la síntesi dels àcids nucleics. Els nucleòsids monofosfats, són els monòmers constituents dels àcids nucleics. Els fosfats a pH fisiològic estan carregats negativament i són responsables de la càrrega negativa dels àcids nucleics. Per tant, en una electroforesi es dirigiran cap al camp positiu.
L’ADN te 4 bases (Adenina, Guanina, Citosina i Timina) però també pot tenir bases modificades per metilació. Aquestes modificacions són punts de regulació o control i també ajuden a preservar o protegir la informació genètica.
No obstant, hi han altres modificacions que no són pròpies del DNA i que si es troben són font de mutacions: Uracil, Xantina i Hipoxantina.
Les desaminacions també comporten canvis importants en les bases nitrogenades: Propietats Fisicoquímiques de les bases nitrogenades - Són bases febles (pKa = 9-10) Són molècules planes o quasi planes perquè tenen anells aromàtics Absorbeixen llum al UV (260 nm); propietat útil per a quantificar els àcids nucleics Són hidrofòbiques i relativament insolubles en aigua a pH fisiològic, encara que els oxígens i els nitrògens poden formar enllaços d’hidrogen.
Presenten tautomeria, específica per a cada base:  Amino (-NH2) – Imino (=NH)  Ceto (=O) – Enol (-OH) Estructura primària dels àcids nucleics: polinucleòtids i enllaç fosfodièster Els àcids nucleics són cadenes llargues formades per nucleòtids units covalentment (enllaços 3’-5’ fosfodièster) de forma lineal → Enllaç entre el grup hidroxil del carboni 3' i el grup fosfat 5'.
L’estructura primària dels àcids nucleics és la seqüència de nucleòtids.
L’esquelet lineal, constant (pentoses i fosfats que es van alternant en la cadena) té funció estructural.
La seqüència de bases púriques i pirimidíniques, variable (unides a intervals regulars a l’esquelet lineal) codifica la informació genètica.
Per conveni, la seqüència de bases s'escriu sempre de 5' a 3'. Tot i que la cadena complementària vagi de 3' a 5' la girem i la escrivim de 5' a 3'. Per exemple: Regles d'aparellament de bases: Regles de Chargaff La composició de bases del DNA és característica de cada espècie: El DNA aïllat de teixits diferents procedents de la mateixa espècie té la mateixa composició de bases. La composició de bases del DNA d’una espècie no varia amb l’edat del organisme, l’estat nutricional o els canvis medi-ambientals.
En la majoria dels DNAs, el contingut de purines és aproximadament igual al de pirimidines: Estructura secundària del DNA És el primer nivell d’estructura tridimensional que adopten les cadenes del DNA.
El DNA és polimòrfic. Pot adoptar diferents models estructurals secundaris: 1. B-DNA (doble hèlix de Watson i Crick, 1953) 2. A-DNA 3. Z-DNA 4. Estructura de forqueta i cruciforme 5. H-DNA (triple hèlix de Hoogsten) A continuació, veurem cada estructura més detalladament.
1. B-DNA Està format per dues cadenes antiparal·leles de polinucleòtids. Una va en direcció 5' → 3' i l'altra és 3' → 5'.
Són cadenes complementàries que interaccionen per ponts d’hidrogen entre parells de bases.
Les interaccions són entre purines i pirimidines. L'adenina s'aparella amb la timina amb 2 ponts d'hidrogen. La guanina s'aparella amb la citosina mitjançant 3 ponts d'hidrogen. La distància màxima per establir ponts d'hidrogen són 3 A.
Les dues cadenes formen una doble hèlix dextrògira.
Les bases, orientades cap a l’interior de l’hèlix, es disposen quasi perpendicularment a l’eix longitudinal de l’estructura i s’apilen paral·lelament entre si.
Els esquelets lineals de les cadenes se situen en l’exterior de la doble hèlix.
Hi ha 10,5 parells de bases per volta (36 Å).
S’estabilitza principalment per ponts d’hidrogen entre els parells de bases i per forces d’apilament dels anells (hidrofòbiques i de Van der Waals).
És una doble hèlix asimètrica: té un solc major i un solc menor.
Perquè hi ha un solc major i un solc menor? La formació d’un enllaç d’hidrogen entre bases requereix que els àtoms implicats es situïn sobre una línia quasi recta (formant gairebé un pla).
Els enllaços N-β-glicosídics entre base i sucre no es disposen totalment perpendiculars a l’eix longitudinal de l’hèlix.
Es generen dos angles diferents entre els enllaços N-β-glicosídics complementaris (uns 120º per un costat i uns 240º per l’altre).
Al formar-se la doble hèlix l’angle de 120º genera un solc menor i el de 240º genera un solc major.
Les proteïnes d’unió al DNA interaccionen específicament amb el solc major, què conté més grups exposats (donadors i acceptors d’hidrogen, i superfícies hidrofòbiques -grups metil i hidrògens no polars-).
El codi dels grups exposats en el solc major (G≡C: AADH, C≡G: HDAA, A=T: ADAM, T=A: MADA) permet el reconeixement específic per part de proteïnes interaccionants amb el DNA sense que sigui necessari obrir la doble hèlix.
La doble hèlix del DNA permet múltiples conformacions: Les bases nitrogenades de cada parell de bases enfrontades poden fer un cert gir helicoïdal. Com a conseqüència els solcs major i menor poden variar localment.
2. A -DNA Forma afavorida in vitro per deshidratació. No s'ha trobat in vivo.
Doble hèlix més compacta, curta i gruixuda, amb 11 pb per volta.
Dextrògira En híbrids DNA-RNA; en plegaments secundaris RNA-RNA. L'RNA és lineal però te zones auto complementàries que en forma d' A- DNA. L'OH - de la ribosa fa que l'RNA no es pugui plegar en forma de B- DNA.
3. Z- DNA Forma afavorida in vitro a altes concentracions de Na+ , que també deshidrata.
Doble hèlix més prima i llarga, amb 12 pb per volta.
Plegament zig-zag de l’esquelet covalent.
Levogira.
En seqüències curtes on s’alternen pirimidines (en conformació anti) i purines (en conformació syn), especialment C, o 5-metil-C, i G.
Taula comparativa: Variacions estructurals en algunes seqüències de DNA: repeticions invertides (palíndroms) i repeticions especulars.
PALÍNDROM = Llegit de dreta a esquerra és igual a llegir-lo d'esquerra a dreta (ex. 2002). En el cas del DNA: repetició invertida a la cadena complementària.
REPETICIÓ ESPECULAR: Efecte mirall, repetició invertida a la mateixa cadena.
Els palíndroms , que generen estructures auto complementàries dins la mateixa cadena, poden actuar com a senyals de reconeixement de moltes proteïnes reguladores de l’expressió gènica. Enzims de restricció i altres proteïnes podran reconèixer aquestes seqüències.
Les repeticions invertides (palíndroms) poden formar estructures en forqueta (hairpin) i cruciformes.
Variacions estructurals del DNA: els aparellaments de Hoogsteen permeten la formació de tríplex de DNA (H-DNA) L' H-DNA està format per 3 cadenes de DNA formen una triple hèlix.
Es forma en seqüències específiques del genoma: regions amb només purines (GA) o pirimidines (CT) en una cadena.
La formació de l’estructura està afavorida in vitro en medi àcid, què promou la protonació de les citosines.
In vivo la cadena senzilla pot interaccionar amb proteïnes.
L’estructura s’estabilitza per enllaços de Hoogsteen. Els enllaços de Hoogsteen permeten la formació d’estructures de DNA de 3 i 4 cadenes. La citosina només es pot unir a CG si està protonada.
Estructures secundàries del DNA L’estabilitat de les estructures secundàries de l’RNA es veu afavorida per tetrallaços (tetraloops) formats per la seqüència UUCG (freqüent en els extrems de les forquetes), i la formació de pseudonusos (pseudoknots) entre seqüències complementàries no contínues.
Propietats fisicoquímiques dels àcids nucleics Les cadenes dels àcids nucleics són hidrofíliques.
Són àcids amb moltes càrregues negatives a pH fisiològic.
A pH neutre i temperatura ambient, les solucions de DNA són molt viscoses; són molècules força rígides i molt llargues respecte al seu diàmetre.
Absorbeixen llum al UV (260 nm).
Són químicament molt estables, principalment el DNA.
Hidròlisi química: • Els enllaços fosfodièster i glicosídics del DNA i l’RNA s’hidrolitzen per tractament amb àcids forts.
• Els àcids febles hidrolitzen únicament els enllaços glicosídics.
• La hidròlisi alcalina trenca els enllaços fosfodièster de l’RNA, però no del DNA.
Hidròlisi dels enllaços fosfodièster de l’RNA mediada per OH -. L'RNA és més reactiu que el DNA perquè tè un grup hidroxil lliure en el C'2.
Desnaturalització tèrmica del DNA La temperatura de fusió (tm ) del DNA és la temperatura a què el 50% de la molècula està desnaturalitzada. La tm d’un dúplex s’incrementa proporcionalment al seu contingut en aparellaments G≡C. Quan més enllaços G-C més resistència a la temperatura.
Absorció de llum UV Efectes hipocròmic i hipercròmic del DNA. El DNA de cadena senzilla absorbeix llum més eficaçment que el DNA de cadena doble.
-Hipocromisme: disminució d’absorbància produïda en la formació del dúplex de DNA.
-Hipercromisme: augment d’absorbància produïda en la desnaturalització del DNA.
Hibridació del DNA El grau d’hibridació del DNA s’utilitza per comparar similituds entre espècies diferents.
Els agents desnaturalitzants, in vitro, eliminen estructures secundàries: Temperatura elevada: • 95-100ºC, per al DNA • 60-65ºC, per a l’RNA Solucions alcalines (solucions diluïdes de NaOH, pH=11), per al DNA.
Tractaments amb agents químics desnaturalitzants: • Urea • Formamida • Formaldehid Topologia del DNA: superenrotllament del DNA, topoisòmers i tipus principals de topoisomerases El superenrotllament del DNA és la doble hèlix enrotllada helicoidalment sobre sí mateixa formant una superhèlix.
El grau de superenrotllament és característic del cromosoma i del moment en què es troba.
El DNA procariota circular i relaxat és aquell que en tots els punts te 10,5 pb per volta, és a dir, no hi ha tensió. És la doble hèlix de sempre, la de Watson i Crick.
Per a que el DNA es superenrotlli li hem d'aplicar tensió. Això ho aconseguim modificant el nº de parell de bases per volta, ja sigui afegint-ne o traient-ne.
Per tant, la tensió estructural de la doble hèlix del DNA genera superenrotllament en forma solenoïdal o plectonèmica. Ambdues formes són interconvertibles i la forma solenoïdal permet una major compactació del DNA DNA plasmídics relaxats i superenrotllats PLASMIDIS = molècules petites de DNA circular tancat de doble cadena que estan en el citoplasma de molts bacteris.
Superenrotllament de DNA Per conveni, el superenrotllament pot ser: • Positiu: es genera si la doble hèlix té més voltes (per enrotllament) que el model relaxat. La superhèlix és levògira (gira en sentit contrari a la doble hèlix). La tensió estructural provocada s’estabilitza provocant superenrotllament positiu.
• Negatiu: es genera si la doble hèlix té menys voltes (per desenrotllament en algun punt de la molècula) que el model relaxat. La superhèlix és dextrògira (gira en el mateix sentit que la doble hèlix). La tensió estructural provocada s’estabilitza provocant superenrotllament negatiu.
En els éssers vius les voltes superhelicoidals són negatives perquè la doble hèlix del DNA està parcialment desenrotllada: • Té menys voltes que el model relaxat de Watson i Crick.
• Té més de 10,4 pb / volta.
El superenrotllament negatiu es dóna en tots els DNA cel·lulars i està estrictament regulat.
Compacta el DNA però facilita la separació de les cadenes durant la replicació i la transcripció, ja que la doble hèlix està una mica desenrotllada.
Lk és el nombre d'enllaç, el nombre de vegades que dues cadenes es creuen tenint en compte l'estructura del B- DNA i si hi han superenrotllaments o no.
Lk0 és el nombre d’enllaç del DNA relaxat (es pren com a referència).
La diferència d’enllaç, ΔLk, permet determinar el grau de superenrotllament del DNA: ΔLk = Lk- Lk0 El Lk és la suma de dos components: Lk = Tw + Wr , on Tw (twist) = nombre de girs de les cadenes de la doble hèlix (enrotllament helicoïdal de les cadenes entre si) Wr (writhe) = nombre de torsions de l’eix de la doble hèlix (nombre de voltes de superhèlix) Per exemple: , si li traiem 2 voltes: De parcialment desenrotllat (accessibilitat) pot passar a superenrotllat (protecció de la informació genètica. I viceversa.
Topoisòmers Isòmers estructurals que només es diferencien en una propietat topològica, com el nombre d’enllaç topològic (Lk).
Són resultat dels diferents superenrotllament del DNA.
graus de Els topoisòmers es poden transformar entre si mitjançant el tall d’una o les dues cadenes de DNA i posterior unió Els topoisòmers es poden separar entre si mitjançant electroforesi en gel d’agarosa (el superenrotllament condensa el DNA).
Hem dit que per passar d'un topoisòmer a un altre hem de trencar i unir cadenes → Qui ho fa? → TOPOISOMERASES.
Topoisomerases Les topoisomerases són enzims encarregats in vivo d’ interconvertir els topoisòmers del DNA.
Catalitzen el canvi en el nombre d’enllaç del DNA (Lk).
Augmenten o disminueixen el grau d’enrotllament del DNA: el superenrotllen o el relaxen.
També encadenen i desencadenen molècules de DNA circular.
Són imprescindibles en la transcripció, replicació i compactació del DNA Hi ha dos tipus principals de topoisomerases: • Tipus I • Tipus II Topoisomerases Tipus I Trenquen únicament una de les cadenes del DNA i catalitzen la relaxació del DNA superenrotllat, en un procés termodinàmicament favorable.
Eliminen superenrotllament negatiu. Cada cicle catalític incrementa el Lk en una unitat (Lk+1) Inhibidors de la topoisomerasa tipus I humana s’utilitzen com agents antitumorals.
Topoisomerasa Tipus II en procariotes = DNA girasa Trenca les dues cadenes del DNA.
Genera superenrotllament negatiu , utilitzant l’energia d’hidròlisi de l’ATP.
Ajuda a compactar el DNA després de la replicació.
Cada cicle catalític disminueix el Lk en dos unitats (Lk-2) La topoisomerasa II bacteriana (DNA-girasa ) és diana de diversos antibiòtics.
Les topoisomerases II d’eucariotes no generen superenrotllament negatiu.
Les topoisomerases tenen també l’estructura del DNA: altres importants funcions en el manteniment de • Enrotllen i desenrotllen molècules de DNA circular.
• Desenrotllen els cromosomes lineals després de la replicació.
• Desfan nusos del DNA generats en algunes reaccions de recombinació.
Contingut en DNA d’alguns virus i genomes d’organismes vius A un nivell superior en l’escala evolutiva li correspon un contingut més gran de DNA.
Entre els eucariotes, el contingut de DNA no té relació lineal amb la complexitat biològica.
La complexitat d’un organisme té una relació més directa amb el nombre de gens.
Paradoxa del valor C: no hi ha una correlació directa entre la mida del genoma i el nombre de gens.
Una gran quantitat del DNA eucariota no codificava per cap producte gènic (fins fa poc, veure en internet sobre junk DNA) Hi ha una correlació inversa entre la complexitat de l’organisme i la densitat gènica: com més simple és l’organisme més densitat gènica presenta. (nombre de gens / mida del genoma).
El genoma procariota: compactació del DNA d’Escherichia coli El genoma és una molècula única de DNA de gran mida (4.6 · 106 pb), molt compactada i condensada en una zona central del citoplasma cel·lular.
L’estructura del genoma es coneix com a NUCLEOIDE: és una doble hèlix circular unida a proteïnes formant 500 llaços o dominis d’unes 10 Kb cadascun.
Les proteïnes són de tipus histona, petites i generalment bàsiques (HU, 19 kDa).
Aquesta estructura en dominis: • Protegeix la informació gènica • Augmenta el grau de compactació de la molècula Genoma eucariota Compactació: superenrotllament i unió a proteïnes.
El grau de compactació del DNA varia en funció de les fases del cicle cel·lular: • El màxim nivell d’empaquetament del DNA és el cromosoma, visible en el nucli en metafase.
• Quan les cèl·lules estan en interfase, el DNA està menys condensat en forma de cromatina.
El DNA no està empaquetat sol. Els cromosomes i la cromatina estan formats per DNA, proteïnes i una petita porció d’RNA.
Condensació del DNA Histones Són proteïnes molt petites que ajuden a compactar el DNA. Són proteïnes bàsiques, carregades positivament a pH fisiològic, que interaccionen electrostàticament amb els fosfats del DNA (carregat negativament). Tenen alt contingut en Lys i Arg.
Són les principals proteïnes, molt conservades evolutivament, constituents de la cromatina en els eucariotes.
Estabilitzen l’estructura del DNA ajudant a compactar-lo.
Hi ha 5 tipus principals d’histones: H1, H2A, H2B, H3, H4. H3 i H4 estan molt conservades entre les diferents espècies.
Hem de poder empaquetar el DNA però també desempaquetar-lo en el seu moment → Modifiquem covalentment les histones. Segons la fase del cicle cel·lular pateixen modificacions químiques què alteren la càrrega elèctrica i regulen el grau de condensació del DNA i la transcripció: metilacions, acetilacions, fosforilacions, ADP-ribosilacions, glicosilacions, sumoïlació, ubiquitinació...
Acetilació d'histones Al acetilar les histones, aquestes perden càrregues positives. De manera que perden les interaccions amb el DNA i ja no queda tan empaquetat. Per tornar a empaquetar necessitem enzims que desacetilin.
Factors epigenètics Epigenètica = per sobre de la genètica → Factors que modifiquen la cromatina sense modificar la seqüència de DNA.
Factors epigenètics: factors que modifiquen l’estructura de la cromatina actuant sobre el DNA o proteïnes associades. No són canvis en la seqüència. Són modificacions químiques de les histones o de les bases del DNA.
Epigenètica: estudi del conjunt de canvis en el patró d’expressió gènica, que no impliquen alteració en la seqüència del DNA i són hereditaris. Permet entendre la diversitat morfològica i funcional de les cèl·lules que tenen el mateix genoma Tot el que van fer els pares i els avis, el que van menjar, l’entorn en que van créixer, l’aire que van respirar, les malalties que van patir... afecten els fills i els nets. Tot el que l’home fa i viu li afecta directament a ell però també als seus descendents.
Fibra de 10 nm Els nucleosomes són complexos formats per l’associació d’histones amb el DNA. És la unitat elemental de la cromatina i dels cromosomes Està format per un nucli proteic, octàmer d’histones centrals format per 2 ( H2A, H2B, H3 i H4) sobre el qual s’enrotlla el DNA. Fent enrotllaments successius se'ns desenrotllaria → histona H1 (histona d’unió) interacciona amb el DNA adjacent al nucleosoma però no forma part de l’octàmer (actua com a grapa subjectant l’estructura). Per tant: NUCLI = 8 histones NUCLEOSOSMA = NUCLI + H1 Els procariotes NO tenen histones, però si proteïnes similars a histones.
La fibra de 10 nm és la fibra que formen els nucleosomes (connectats entre si per fragments de DNA).
Hi ha 1 nucleosoma per cada aproximadament 200 pb. Podem distingir: • El DNA nucli (core), DNA (de 146-147 pb) superenrotllat negativament (dóna ≈1.7 voltes a l’octàmer d’histones); és un DNA de mida força constant en totes les espècies.
• El DNA nexe (linker), DNA que connecta els nucleosomes, de longitud variable (20-60 pb).
En el nucli del nucleosoma les cadenes laterals queden cap a fora perquè: 1. Després les haurem de modificar 2. Ajuden a formar la fibra de 30 nm Aquestes fibres (10 nm) proporcionen un empaquetament del DNA de 6 vegades superior al de la doble hèlix. Volem aconseguir compactar 7000-10000 vegades. En el microscopi aparenta un collar de perles.
Fibra de 30 nm La fibra de 10 nm s’enrotlla sobre ella mateixa amb la intervenció de la histona H1.
El grau d’empaquetament és d’unes 40-100 vegades respecte la doble hèlix.
S’han proposat diversos models per explicar com s’associen els nucleosomes en la fibra de 30 nm: el model del solenoide i el model zig-zag. Encara no està del tot clar.
Per transcriure → No superenrotllament → Fibra de 10 nm. El DNA en les regions del cromosoma que s’estan replicant o transcrivint es presenta poc (fibra de 10 nm) o nul·lament (DNA nu) compactat.
Les cues N-terminals de les histones de l’octàmer resten cap a l’exterior, i són necessàries per a formació de la fibra de 30 nm. Les cues N-terminals de les histones de l’octàmer poden ser modificades químicament, desestabilitzant la fibra de 30 nm, i permetre la transcripció gènica.
Nivells superiors de compactació del DNA Durant la interfase les fibres de 30 nm semblen formar «loops» llaços o bucles (20-100 kpb) i superenrotllaments lligats a una matriu proteica no histona (esquelet nuclear o cromosòmic).
Aquestes proteïnes solen ser del tipus topoisomerasa (sobretot la tipus 2) Aquesta estructura compacta més el DNA i sembla que permet distribuir els gens en unitats transcripcionals.
A partir d'aquí es donen enrotllaments successius però no està clar el seu mecanisme.
Pleguem els loops en dominis per: 1. Evitar danys (protegir) 2. Classificar gens relacionats (ex. histones) 3. Ajudar a plegar Graus de compactació de la cromatina Eucromatina: • Regions de cromatina amb un grau d’empaquetament baix, no visibles al microscopi òptic.
• El DNA es pot replicar i transcriure, és accessible.
Heterocromatina: Regions de cromatina molt més empaquetada (10000 x), visible al microscopi òptic i no activa transcripcionalment. Potser de dos tipus: • Constitutiva: sempre amb el màxim nivell d’empaquetament i és transcripcionalment inactiva (centròmers, telòmers).
• Facultativa: cromatina que no sempre està tant compactada. Quan no està compactada, pot haver transcripció, expressió gènica (en un moment donat o en un determinat teixit).
En els humans, per a equiparar el nivell d'expressió dels gens lligats al cromosoma X en els dos sexes, un dels dos cromosomes X femenins és inactiu. Les dones tenen únicament un cromosoma X actiu, igual que els homes, i en ambdós sexes aquest cromosoma s’expressa al mateix nivell. El cromosoma X inactiu de la dona està totalment condensat en forma de heterocromatina facultativa.
Cromosoma metafàsic (forma condensada del cromosoma) Durant la metafase, el DNA que ja s’ha replicat es condensa en heterocromatina adquirint l’aspecte típic dels cromosomes visibles al microscopi òptic.
En metafase, cada cromosoma presenta dos estructures en forma de bastó, les cromàtides. Cada cromàtide és una fibra de heterocromatina superenrotllada sobre sí mateixa.
El cromosoma: • Compacta el DNA • Estabilitza les molècules de DNA i les protegeix de l’entorn cel·lular • Permet la transferència segura a les cèl·lules filles de tota la informació codificada.
• Organitza la informació continguda en el DNA, facilitant l’expressió gènica.
Centròmers i telòmers • Heterocromatina constitutiva • Funció estructural • Màxima compactació • No s'expressen Centròmer: Lloc d’unió del cromosoma a les fibres del fus mitòtic. Lloc d’unió de les cromàtides germanes.
Telòmers: Seqüències dels extrems dels cromosomes associades a proteïnes que participen en l’estabilitat i manteniment de la integritat estructural. Asseguren la replicació completa dels extrems dels cromosomes lineals.
Genoma Humà • Genoma nuclear humà diploide (cèl·lules somàtiques): 46 cromosomes lineals (22 parells de cromosomes homòlegs més els cromosomes sexuals X i Y).
• Genoma nuclear humà haploide (cèl·lules sexuals): 3.2 · 109 pb distribuïts en 23 cromosomes lineals • Genoma mitocondrial humà 16.5 · 103 pb en una molècula circular.
37 gens per molècula (13 proteïnes, 22 tRNA i 2 rRNA).
Moltes còpies per cèl·lula Manteniment estructural dels cromosomes: proteïnes SMC SMC = Structure Manteniment Chromosomes Formada per dues subunitats: • Cohesines: Implicades en la unió de cromàtides germanes en la replicació i en el manteniment de la unió durant la compactació en la metafase (procés essencial per a la correcta segregació dels cromosomes en la divisió cel·lular). Formen una anell amb la kleisina, què es pot expandir o contraure per hidròlisi d’ATP.
• Condensines: Essencials per a la condensació dels cromosomes durant la mitosi.
Comparació del genoma eucariota amb el d’E. coli E. coli • Pràcticament la totalitat del DNA és codificant i de còpia única.
• Els gens estan disposats de manera contigua. Hi ha molt poc DNA no codificant entre els gens.
• Els gens són continus, no estan fragmentats.
Eucariotes • El DNA té moltes seqüències repetides i la majoria d’aquestes repeticions no codifiquen cap producte gènic.
• La majoria dels gens són de còpia única.
• Els gens estan separats uns dels altres per llargues seqüències intergèniques de DNA no codificant.
• Els gens estan interromputs per llargs fragments de DNA no codificant (introns); no són continus Tipus funcionals de DNA en els cromosomes eucariotes • DNA codificant de proteïnes (exons, introns, UTRs, pseudogens) i RNAs.
• DNA intergènic: DNA repetitiu dispers (LINEs, SINEs, LTRs, transposons) i DNA repetitiu agrupat i altres (satèl·lits, microsatèl·lits, minisatèl·lits).
Característiques dels gens En els gens (eucariotes i procariotes) distingim: • Una seqüència estructural, que es transcriu i codifica per a RNAs o proteïnes.
• Seqüències reguladores, que controlen la transcripció de les seqüències estructurals.
Els gens eucariotes són gens fragmentats formats per: • Exons: són les seqüències codificants del gen (50-200 pb) que es troben en el RNAm madur. DNA codificant.
• Introns: seqüències no codificants del gen de mida variable (0,5-5 Kb) que no es troben en el RNAm madur. DNA no codificant.
Tenim més introns que exons. Els gens de les histones és dels pocs gens que no tenen introns.
Es transcriuen els introns i exons; s'eiminen els introns.
Genoma eucariota Cadena codificant, amb sentit.
Cadena no codificant, motlle (template) de la transcripció.
La cadena codificant del gen té la mateixa seqüència que l’RNA producte de la transcripció.
Es numera la cadena codificant del gen a partir de l’extrem 5’. El nucleòtid 1 del gen és el primer nucleòtid que es transcriu.
En la majoria dels gens eucariotes la seqüència de nucleòtids del DNA no és col·lineal amb la de l’RNA madur ni amb la dels aminoàcids: existeixen seqüències transcrites però no traduïdes, els introns Gens Eucariotes Seqüències que codifiquen per un producte gènic: tots els tipus de RNAs i de proteïnes de l’organisme.
Tenen un locus determinat en els cromosomes.
En el genoma haploide trobem: • Gens de còpia única: no repetits que codifiquen per a la majoria de les proteïnes.
• Gens moderadament repetits (famílies gèniques clàssiques) que codifiquen per a RNAs (tRNA, rRNA) i algunes proteïnes (histones).
• Famílies multigèniques.
Pseudogens processats Còpies de DNA a partir d’RNAs madurs, sintetitzades per transcripció inversa (transcriptasa inversa), que s’han integrat en el genoma.
Són gens silenciosos que no es poden expressar perquè no tenen regions promotores funcionals (regió de control de l’expressió) Transcriptasa inversa: una polimerasa de DNA amb motlle d’RNA És una polimerasa de DNA que utilitza RNA com a motlle. La transcriptasa inversa està present en: • Retrovirus • Retrotransposons LTR • Telomerasa DNA repetitiu DNA dispers per tot el genoma seguint una distribució aparentment a l'atzar.
DNA agrupat: són repeticions d’unitats disposades en tàndem.
DNA satèl·lit: repeticions d’unitats altament repetitives (centenars de milers de pb) agrupades en regions del genoma, com telòmers i centròmers. Són repeticions en tàndem d’unitats de 5-200 pb.
• Minisatèl·lits: repeticions en tàndem d’unitats de fins a 25 pb que ocupen fins a 20 kb.
• Microsatèl·lits: repeticions en tàndem d’unitats de fins a 13 pb que ocupen fins a 125 pb. Molts microsatèl·lits tenen gran polimorfisme entre individus d’una espècie i finsi-tot entre els 2 cromosomes homòlegs d’un individu. Presenten canvis en la seqüència i en el nombre de repeticions. S’utilitzen com a “empremtes” de DNA per proves forenses i de paternitat.
Gens Accessoris Són seqüències moderadament repetides (2-100.000) i disperses en el genoma que aparentment no tenen funcions clares per a l’organisme. Venen de fora, quan ens infectem amb un virus p. ex Són gens integrats en el genoma per transposició a partir d’una còpia d’RNA per transcripció inversa: • Pseudogens processats • Elements mòbils o TRANSPOSONS: ◦ Seqüències LINEs ◦ Seqüències SINEs ◦ Retrotransposons LTR (similars a retrovirus) ◦ Transposons de DNA Conceptes bàsics de genètica Cromosomes homòlegs (vs. cromosomes heteròlegs): cromosomes morfològicament idèntics i que contenen els mateixos gens.
Cromosomes autosòmics (vs. cromosomes sexuals): cromosomes no implicats en la determinació del sexe.
Un locus genètic és la posició definida que ocupa un gen (o una seqüència no codificant) en un cromosoma.
Un al·lel és una de les variants gèniques que pot presentar la seqüència d’un gen, en la població.
Polimorfisme gènic = existència en un locus de dos o més al·lels alternatius per a un determinat gen.
Genotip: constitució genètica d’un organisme. Conjunt d’al·lels presents en tots els cromosomes d’un individu o espècie.
Genotip per a un determinat locus d’un gen: parell d’al·lels presents en aquell locus en els cromosomes homòlegs.
Fenotip: manifestació externa del genotip. Conjunt de caràcters observables (morfològics, bioquímics, moleculars) resultat de l’expressió del genotip i de la interacció de l’organisme amb el medi extern.
Fenotip per a un determinat caràcter: caràcter observable resultat de l’expressió d’un parell d’al·lels i de la interacció de l’organisme amb els factors ambientals.
Un homozigot per a un determinat caràcter o gen, té al·lels idèntics en un determinat locus del parell de cromosomes homòlegs.
Un heterozigot per a un determinat caràcter o gen, té al·lels diferents en un determinat locus del parell de cromosomes homòlegs.
Al·lel dominant: la seva presència es manifesta sempre en el fenotip.
Al·lel recessiu: es manifesta únicament en homozigosis Dominància: fenotip que es manifesta sempre en l’heterozigot. El fenotip no permet distingir entre l’homozigot i l’heterozigot.
Dominància incompleta (semi dominància): el fenotip de l’heterozigot és intermedi al dels respectius homozigots.
Codominància: el fenotip de l’heterozigot expressa simultàniament els dos fenotips dels respectius homozigots TEMA 2: REPLICACIÓ DEL GENOMA Replicació del DNA És la duplicació completa del genoma.
La replicació del DNA és semiconservativa : • Cada cadena del DNA parental serveix de motlle per a la síntesi d’una nova cadena complementària.
• En la divisió cel·lular, cada cèl·lula filla rep molècules de DNA formades per la cadena nova acabada de sintetitzar i la cadena motlle parental.
DNA polimerases Les DNA polimerases necessiten: • Els 4 desoxirribonucleòtids trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) i Mg2+ com a cofactor.
• Un petit fragment d’RNA (in vivo) amb un grup hidroxil-3’ lliure que actua d’encebador. No poden iniciar la síntesi incorporant el primer nucleòtid.
• Una cadena senzilla de DNA que actua de motlle.
Llegeixen la seqüència de la cadena motlle en la direcció de 3’ a 5’.
Catalitzen l’elongació de la nova cadena en la direcció de 5’ a 3’.
DNA polimerasa I: mecanisme catalític proposat Les DNA polimerases catalitzen l’atac nucleofílic d’un hidroxil 3’ lliure sobre el fosfat més intern del dNTP (fosfat α) que s’addicionarà, formant un enllaç fosfodièster, sempre que el nucleòtid a incorporar sigui complementari al del motlle DNA polimerases: característiques 1. Processivitat: nombre de nucleòtids que addicionen sense desenganxar-se del motlle.
2. Velocitat: nombre de nucleòtids incorporats per segon.
3. Fidelitat: capacitat d’elongar la cadena sense cometre errors de complementarietat.
La geometria en l’aparellament de les bases contribueix a la fidelitat de la replicació del DNA ja que únicament els aparellaments correctes tenen cabuda al centre actiu de la DNA polimerasa.
El centre actiu de les DNA polimerases no catalitza eficaçment l’addició de ribonucleòtids per incorrecte alineament entre el fosfat α del ribonucleòtid i l’extrem 3’-OH de la cadena a elongar.
Replicació del DNA en procariotes L’objectiu de la replicació és que en la divisió cel·lular cada cèl·lula filla rebi una còpia completa del genoma.
L’inici de la replicació ha d’estar controlat amb precisió; en el procés té un important paper la metilació del DNA.
El temps de replicació del cromosoma d’ E. coli, és constant (uns 40 minuts).
En procariotes, no hi ha cap interval de temps entre el final de la replicació i el començament de la divisió; la divisió es produeix quan ja s’ha iniciat un nou cicle de replicació.
DNA polimerases (E-coli) • Funció de síntesi: elevada velocitat • Funció reparadora: baixa velocitat • Reparació forats: baixa processivitat • Reparació lesions importants: processivitat moderada • Síntesi total del DNA: alta processivitat DNA polimerasa I (E-coli) La DNA polimerasa I , és monomèrica, presenta una baixa velocitat de polimerització (16-20 nucleòtids/segon) i té tres dominis amb diferents activitats enzimàtiques: Exonucleasa de 3’ a 5’: • Trenca enllaços fosfodièster a partir d’extrems 3’-hidroxil lliures quan detecta que l’últim nucleòtid incorporat no és complementari al motlle.
• És una activitat correctora d’errors: corregeix immediatament els errors de l’activitat polimerasa.
Exonucleasa de 5’ a 3’: • Trenca enllaços fosfodièster a partir d’extrems 5’-fosfat lliures.
• Pot eliminar un únic nucleòtid o fragments de 5 o 6 nucleòtids.
• Elimina els encebadors d’RNA utilitzats en la replicació. També corregeix lesions en el DNA.
La DNA polimerasa I té una gran fidelitat, comet un error cada 107 nucleòtids incorporats, gràcies a l’activitat correctora de proves. Les DNA polimerases s’utilitzen per copiar cadenes in vitro amb la finalitat de marcar-les, amplificar-les o seqüenciar-les. S’utilitza freqüentment el fragment Klenow de la DNA polimerasa I.
Activitat exonucleasa de 3’ a 5’ de la DNA polimerasa I: correcció d’errors Trenca enllaços fosfodièster a partir de l’extrem 3’-hidroxil lliure quan detecta que l’últim nucleòtid incorporat no és complementari del motlle.
Activitat correctora lligada a la replicació.
In vitro , la DNA polimerasa I d’E. coli comet 1 error cada 104 -105 nucleòtids incorporats.
L’activitat exonucleasa 3’ a 5’ (correctora d’errors) redueix els errors a 1 cada 107 nucleòtids incorporats. La tasa de mutació observada és 1 cada 1010 nucleòtids incorporats, gràcies als sistemes de reparació del DNA postreplicació.
Activitat exonucleasa de 5’ a 3’ de la DNA polimerasa I: eliminació d’encebadors d’RNA (Nick translation) Trenca enllaços fosfodièster a partir de l’extrem 5’-fosfat lliure.
Elimina els encebadors d’RNA i corregeix lesions del DNA DNA polimerasa III (E.coli) És el principal enzim responsable de la síntesi del DNA en la replicació.
És molt ràpid i poc abundant (250-1000 nucleòtids/segon).
És un complex multienzimàtic gran amb múltiples subunitats formant una estructura dimèrica asimètrica (holoenzim DNA Pol III). L'asimetria és perquè s'han de sintetitzar les dues cadenes alhora.
Aquesta estructura dimèrica acobla unes abraçadores o grapes al voltant de la doble hèlix (subunitats o abraçadores β). La complexitat de l’enzim facilita que l’enzim repliqui les dues cadenes del DNA al mateix temps i en la mateixa direcció.
L’associació de les abraçadores β amb la DNA polimerasa III és responsable de la gran processivitat d’aquest enzim durant la replicació.
La DNA polimerasa III consta de diferents subunitats: Cadascun dels dos monòmers sintetitza una de les cadenes.
Té activitat catalítica en diferents subunitats: • Activitat polimerasa de 5’ a 3’, responsable de l’elongació de les noves cadenes (subunitats α).
• Activitat exonucleasa de 3’ a 5’, correctora de proves en el moment de la replicació (subunitats ε).
• Activitat responsable de carregar les abraçadores β a les cadenes (complex ϒ) • Les subunitats α i ε unides per la subunitat θ formen el nucli de l’enzim (amb activitat polimerasa però amb baixa processivitat) Aquest canvi de direcció el fa la subunitat més gran.
Mecanisme de la DNA pol III per a incorporar l’anell β al voltant del DNA.
La DNApol III s’associa a unes subunitats en forma d’anell, abraçadores β , que s'acobla al voltant de la doble hèlix. L’acoblament de les abraçadores β al DNA proporciona gran processivitat i velocitat a la DNA pol III. El carregador de l’anell de la DNA Pol III és un complex proteic (complex ϒ ) de cinc subunitats amb activitat controlada per ATP Orígen de replicació en E.coli E. coli té un únic origen de replicació (oriC) en el seu cromosoma a partir del qual les dues cadenes del DNA es copien simultàniament.
El genoma d’E. coli és un replicó (DNA que es replica a partir d’un únic origen de replicació).
L’oriC consta de 245 pb amb: • 3 seqüències (de 13 pb) pràcticament idèntiques, ordenades en tàndem, molt riques en A i T: punt d’inici de separació de les cadenes (DUE). Per obrir necessitem que la seqüència sigui rica en A i T perquè s'uneixen per 2 ponts d'hidrogen només. Les helicases que s'encarreguen d'obrir els ponts d'hidrogen són el DNAc i el DNAb.
• 5 seqüències repetides R (de 9 pb) orientades en diferent sentit, que són el punt d’unió de la proteïna DnaA, iniciadora de la replicació.
• Regió rica en seqüències GATC palindròmiques (dianes de metilació de les adenines).
La metilació de les adenines la fa la Dam metilasa.
• FIS i IHF és el lloc d'unió de proteïnes que dobleguen el DNA per poder obrir la DUE.
Single- Stranded DNA- Binding (SSB): evita que les cadenes que hem separat es tornin a obrir.
La metilació de l’oriC controla la replicació en E. coli Ambdues cadenes del dúplex han d’estar metilades per ser replicades. La proteïna SeqA manté el DNA hemimetilat (sense metilar) després d’un cicle de replicació. La separació de SeqA permet la metilació per la Dam metilasa i l’inici de la replicació (entrada de DnaA) Regulació de la replicació del DNA en E coli En la divisió cel·lular cada cèl·lula ha de rebre una única còpia completa del genoma.
El temps de replicació del cromosoma d’ E. coli és constant (40 minuts). En un medi òptim de creixement el bacteri es divideix en 20-30 minuts. Podem replicar cada 20 min perquè és el temps que triga la seq. A en saltar.
Una nova replicació ha de començar abans que la divisió s’hagi completat.
En procariotes, no hi ha interval de temps entre la replicació i la divisió.
L’inici de la replicació ha d’estar regulat: • Per la metilació del DNA, per la metilasa Dam • Pels nivells disponibles de la proteïna iniciadora DnaA lligada a ATP • Pels nivells disponibles de la proteïna SeqA Model d’iniciació en E. coli Metilació d’oriC: • La replicació comença amb la metilació de les adenines de les seqüències GATC de l’oriC per l’enzim la Dam metilasa.
Separació de les hebres de la doble hèlix en l’oriC: • La metilació d’oriC provoca la unió de la proteïna DnaA (8 molècules lligades a ATP) a les 5 repeticions de 9 pb i a tres llocs I addicionals, formant un complex inicial helicoïdal dextrògira.
• Es forma un complex obert d’iniciació per desnaturalització seqüencial de les repeticions de 13 pb. La reacció requereix ATP, la proteïna bacteriana tipus histona (HU), IHF i FIS.
• Participen també hexàmers de la proteïna DnaB, helicasa que s’uneix a cadascuna de les cadenes i les separa (trenca ponts d’hidrogen) utilitzant ATP i una proteïna adaptadora, DnaC.
• La proteïna de fixació al DNA de cadena senzilla, SSB (“single-stranded DNA-binding protein”) ajuda a mantenir les cadenes separades durant la replicació.
Forquetes de replicació en E. coli La replicació és bidireccional a partir del complex obert en l’oriC.
En el complex obert es formen dues forquetes de replicació que avancen en sentit contrari recorrent tot el genoma.
Síntesi dels encebadors: primasa La primasa (DnaG) és una RNA polimerasa que inicia la replicació del DNA en catalitzar la síntesi dels encebadors: fragments d’RNA de 10-60 nucleòtids.
Els seus substrats són els ribonucleòsids trifosfat: ATP, GTP, CTP i UTP. Necessita Mg2+.
Seguint el motlle, polimeritza de 5’ a 3’,un fragment d’RNA, deixant un extrem 3’-hidroxil lliure.
No té activitat correctora d’errors.
La unió de l’encebador d’RNA a la cadena motlle forma una estructura que és reconeguda per la DNA polimerasa III, facilitant la ràpida elongació de l’encebador.
Elongació de les cadenes en E. coli La DNA polimerasa III (dímer asimètric) sintetitza les dues cadenes elongant els encebadors.
Cada monòmer de l’enzim s’uneix a una de les cadenes motlle (parentals) i sintetitza la nova cadena complementària.
Llegeix els motlles a mesura que es desplaça en la direcció de 3’ a 5’.
Replica les dues cadenes del DNA simultàniament i en la mateixa direcció de 5’ a 3’: • Una de les cadenes la sintetitza de forma contínua a partir d’un únic encebador; és la cadena guia o conductora (leading strand).
• L’altra cadena la sintetitza de forma discontínua, en fragments curts (≈1000-2000 nucleòtids en els procariotes), fragments d’Okazaki, a partir de tants encebadors com fragments; és la cadena retardada (lagging strand).
Elongació: forqueta de replicació en E. coli Cada forqueta de replicació avança amb la intervenció de diverses proteïnes: • Una helicasa: separa les cadenes.
• La proteïna d’unió a DNA de cadena senzilla (SSB): evita la renaturalització de les cadenes.
• La primasa: sintetitza els encebadors dels fragments d’Okazaki.
• La DNA polimerasa III: elonga les cadenes.
• La DNA polimerasa I: elimina els encebadors (amb l’activitat exonucleasa de 5’ a 3’) i omple els forats.
• La topoisomerasa II (DNA girasa): elimina el superenrotllament positiu generat al davant de la forqueta per la separació de les cadenes.
• La DNA lligasa: uneix tots els fragments de la cadena retardada.
En E.coli la replicació requereix més de 20 proteïnes diferents. El conjunt de totes les proteïnes implicades en la replicació és el REPLISOMA Les helicases de DNA desfan la doble hèlix, permetent el pas de la forqueta de replicació.
L’ helicasa (DnaB en E. coli) es mou sobre la cadena retardada en direcció 5’ a 3’, en un procés que depèn d’ATP.
Quan l’ helicasa separa les cadenes, el DNA corrent amunt de la forqueta de replicació se superenrotlla positivament. Si no s’eliminés aquest superenrotllament la forqueta s’aturaria.
La intervenció de la topoisomerasa II (DNA girasa) solventa el problema, redueix el número d’enllaç, treu superenrotllament positiu i genera superenrotllament negatiu.
Síntesi de fragments d'Okazaki: La DNA lligasa és un enzim que lliga extrems 3’-hidroxil lliures amb extrems 5’ fosfat formant enllaços fosfodièster en cadenes de dúplex de DNA. La reacció utilitza: • El coenzim NAD+, en E. Coli.
• L’energia de hidròlisi de l’ATP, en eucariotes i alguns virus.
La DNA polimerasa forma un llaç (model del trombó) en la cadena retardada que li permet llegir el motlle en la direcció correcta (de 3’ a 5’) i sintetitzar fragments curts en la direcció de 5’ a 3’.
Terminació de la replicació en E. coli La replicació acaba on es troben les dues forquetes de replicació, en l’extrem oposat a l’oriC, denominat Ter (terminal).
Ter conté múltiples còpies (per si alguna falla → control) d’una seqüència de 20 pb que es troben disposades en el cromosoma en dos grups amb orientació oposada. Són punts d’unió de la proteïna Tus (Substància que Utilitza el Terminal).
Aquestes seqüències Ter (terminal) actuen com a trampes que atrapen (i aturen) les forquetes de replicació quan es forma el complex Tus-Ter.
Només actua un complex Tus-Ter per replicació, què atura una forqueta de replicació. L’altra forqueta s’atura quan es topa amb la forqueta oposada (ja aturada).
Controlen l’arribada coordinada de les dues forquetes i eviten la sobrerreplicació.
La replicació genera cromosomes encadenats que han de ser separats per una topoisomerasa de tipus II (topoisomerasa IV), que trenca les dues cadenes d’un dels cromosomes i les separa.
Replicació del DNA en eucariotes La replicació en el genoma nuclear dels eucariotes, encara que és més complex, segueix els mateixos principis que en procariotes: • És semiconservativa i bidireccional a partir dels orígens de replicació.
• Les DNA polimerases sintetitzen simultàniament les dues cadenes del DNA de 5’ a 3’.
• Es necessiten encebadors d’RNA.
• La síntesi d’una cadena és contínua i la de l’altra és discontínua, en fragments d’Okazaki (100-400 pb) que després són lligats (replicació semidiscontínua). Els fragments d'Okazaki en eucariotes són més petits.
• Quan s’inicia la síntesi d’un replicó (fragment de DNA que se sintetitza a partir d’un mateix origen de replicació) continua fins al final, no s’atura (replicació seqüencial).
Tindrem tants replicons com orígens de replicació hi hagin.
Replicació del DNA en eucariotes: diferències amb E. coli La replicació la duen a terme dues DNA polimerases que treballen sincrònicament en la forqueta de replicació.
El genoma nuclear eucariota té múltiples cromosomes a replicar, de gran longitud i lineals.
Els cromosomes nuclears d’eucariotes tenen múltiples orígens de replicació (distanciats entre 30 i 300 Kb).
En eucariotes hi ha un interval de temps (fase G2 del cicle cel·lular) entre el final de la replicació (fase S) i el començament de la mitosi.
Eucariotes → Hi han les polimerases α, β, δ, ε, Procariotes → La polimerasa III tè subunitats α, β, δ, ε, DNA polimerases en eucariotes Les polimerases de DNA d’eucariotes no tenen activitat exonucleasa 5’ a 3’.
Les exonucleases que eliminen els encebadors d’RNA són enzims independents.
DNA-polimerases d’eucariotes essencials per a la replicació del genoma El complex DNA Pol α/primasa inicia noves cadenes. Està format per dues subunitats DNA pol α (alfa) i dues subunitats primasa. L’activitat primasa sintetitza l’encebador d’RNA i a continuació l’activitat DNA Pol α comença a polimeritzar DNA. No tè activitat correctora.
Té baixa processivitat, raó per la qual és ràpidament reemplaçat per polimerases amb més elevada processivitat, com la DNA Pol δ o la DNA Pol ε (procés denominant canvi de polimerases).
La DNA Pol δ (delta) sintetitza la cadena retardada. La DNA Pol ε (èpsilon) sintetitza la cadena guia. Se sap que aquestes dues polimerases fan la resta del treball (síntesi de cadenes, eliminació de primers i omplir forats) → No es coneix del tot La DNA Pol ϒ (gamma) és la única DNA polimerasa no localitzada en el nucli cel·lular. Està en el mitocondri, on replica i repara el DNA mitocondrial.
La resta de polimerases estan implicades fonamentalment en la reparació del DNA nuclear.
Canvi de polimerases durant la replicació del genoma en els eucariotes La processivitat de les DNA Pol δ o ε es veu incrementada per l’associació amb proteïnes que formen una pinça que llisca sobre el DNA (sliding clamp) Orígens de replicació en eucariotes Els cromosomes eucariotes tenen molts orígens de replicació (replicons), fet que facilita i accelera la replicació de molècules de DNA de gran longitud.
És una replicació bidireccional Complex prerreplicatiu (pre-RC) en eucariotes La replicació en els eucariotes està regulada i coordinada amb el cicle cel·lular.
Els complexos prerreplicatius (pre-RC) es formen en els inicis de replicació (replicons), al final de la fase M (mitosi) en les cèl·lules de ràpid creixement i de la fase G1 en les de creixement lent.
Formació del complex pre-RC: un complex de 6 proteïnes = ORC = complex de reconeixement de l’origen s’uneix al replicó i recluta altres proteïnes (Cdt1 i Cdc6), permetent que una helicasa replicativa hexamèrica (MCM2-7, proteïnes de manteniment del minicromosoma) formi un anell i funcioni de manera similar a la helicasa DnaB en E. coli.
Forqueta de replicació en eucariotes En la fase S del cicle cel·lular les quinases Ddk i Cdk fosforilen Cdc6 i Cdt1, què se separen del complex pre-RC, el qual s’activa.
Al complex pre-RC activat s’hi uneixen altres proteïnes, com les DNA Pol δ, ε i α/primasa.
Un cop la DNA Pol α/primasa inicia la replicació, el fragment que ha sintetitzat és reconegut per la proteïna carregadora de l’abraçadora (RF-C), què permet la unió d’una abraçadora PCNA, similar a l’abraçadora β de la DNA Pol III d’E. coli.
La DNA Pol ε comença a sintetitzar la cadena guia.
La desnaturalització de la doble hèlix permet a la DNA Pol α/primasa sintetitzar encebadors addicionals, permetent la síntesi de fragment d’Okazaki en la cadena retardada per la DNA Pol δ.
Els nivells de la quinases dependent de ciclines (Cdk) controlen la formació i activació del complex pre-RC El control de la funció del complex pre-RC per les Cdk assegura que el genoma eucariota es repliqui només un cop en cada cicle cèl·lula.
Taula comparativa. Replicació E.coli vs Replicació en humans Replicació del DNA en eucariotes: manteniment dels extrems de molècules lineals de DNA En cada cicle de replicació els extrems d’una molècula de DNA lineal es poden anar escurçant perquè l’extrem 3’ de la cadena retardada no es pot copiar donat que: 1. Es troba a menys de 200 pb de l’últim fragment Okazaki (no hi ha espai per a un nou complex d’inici de fragment Okazaki).
2. Encara que hagi espai per posicionar l’últim fragment Okazaki, el seu encebador d’RNA no pot ser convertit a DNA (es requeriria un nou fragment Okazaki començant des de l’exterior de la cadena de DNA).
Alguns virus i bacteris amb cromosoma lineal poden solventar el problema gràcies a l’ús de proteïnes que interaccionen amb la DNA polimerasa i l’estabilitzen en l’extrem 3’ del DNA motlle, no necessitant encebador d’RNA per a la síntesi de l’últim fragment Okazaki.
Els eucariotes tenen seqüències telomèriques (DNA minisatèl·lit composat per centenars de còpies de DNA repetitiu en tàndem) situades als extrems del cromosomes eucariotes i que poden ser exteses mitjançant un mecanisme independent amb participació de l’enzim telomerasa.
Seqüències telomèriques en eucariotes Els telòmers són seqüències de DNA no codificants, especialitzades i associades a proteïnes.
Estan en els extrems dels cromosomes lineal, on els protegeixen (en cada cicle de replicació no es copien entre 50-200 pb dels extrems 3’ de les cadenes parentals).
Els telòmers són seqüències de DNA repetitiu: • Múltiples repeticions (150-2000) en tàndem d’un oligonucleòtid curt (4-12 nucleòtids).
• L’extrem 3’ sobresurt 12-16 nucleòtids respecte l’extrem 5’ de la cadena complementària.
En mamífers l’extrem 3’ dels telòmers està protegit per una estructura en forma de llaç, llaç T.
Per a la formació dels llaç T participen diverses proteïnes TBP (Telomere Binding Protein).
El llaç T segresta i protegeix els extrems telomèrics 3’ de cadena senzilla de l’acció de les nucleases Paper de la telomerasa en la replicació dels cromosomes lineals Els telòmers s’escurcen en la replicació, però són regenerats per la telomerasa, que és una ribonucleoproteïna (enzim associat a RNA): El component proteic és una transcriptasa reversa (polimerasa que sintetitza DNA a partir d’RNA motlle).
El fragment d’RNA associat és de mida variable segons la espècie i té una seqüència complementària a la seqüència telomèrica.
En la majoria de les cèl·lules somàtiques dels teixits adults, no hi ha activitat telomerasa.
L’escurçament dels telòmers és un rellotge biològic que mesura l’envelliment.
Està present en totes les cèl·lules d’elevada proliferació. És diana terapèutica (càncer).
Mutacions i reparació del DNA Mutacions. Classificació.
Una mutació és una alteració permanent en la seqüència del DNA, en regions codificants i no codificants.
Conjuntament amb la recombinació meiòtica són la principal font de variabilitat genètica dels organismes.
Les mutacions es poden classificar seguint diversos criteris: 1. Segons el tipus de cèl·lula 1. Germinal → Malalties congènites o hereditàries. Minoritàries.
2. Somàtica → El grau de mutació depèn de la fase del desenvolupament en què s'origini. Majoritàries. L’individu portador d’una mutació somàtica produïda desprès del zigot, però abans de completar el desenvolupament, és un mosaic de dues o més línies cel·lulars genèticament diferents.
2. Segons la magnitud 1. Puntuals o gèniques → Afecten o un o uns pocs nucleòtids 1. Substitució 1. Transicions = Canvi d'una base púrica per una altra també púrica. O una base pirimidínica per una altra també pirimidínica.
2. Transversions = Canvi de purines per pirimidines o de pirimidines per purines.
2. Delecció. Si deleccionem un nucleòtid es canvia el marc obert de lectura de la proteïna. La proteïna no serà funcional. Si deleccionem tres nucleòtids, suprimim un aminoàcid. Normalment no passa res, però si és un aminoàcid del centre actiu o que ajuda al seu plegament pot ser greu.
3. Inserció 2. Cromosòmiques → Reordenaments de segments de cromosomes 3. Genòmiques → Nombre erroni de cromosomes 3. Segons els efectes Resum dels tipus de mutacions segons els efectes: 4. Segons les causes Mutacions gèniques en seqüències reguladores = Mutacions en la regió reguladora del gen poden afectar la transcripció; no es pot expressar el gen o bé ho fa sense control.
Hi han malalties moleculars causades per mutacions: • Malalties monogèniques = Mutacions puntuals en un únic gen • Malalties multifactorials = Múltiples mutacions, factors epigenètics i factors exògens.
Protooncogens: • Factors de creixement • Receptors de factors de creixement i d’hormones • Proteïnes de transducció de senyals.
• Proteïnes activadores del cicle cel·lular (ciclines, quinases).
• Factors de transcripció de proteïnes del cicle cel·lular.
Oncosupressors: • Factors inhibidors del creixement • Receptors d’aquests factors inhibidors o d’hormones que frenen el creixement.
• Proteïnes de transducció de senyals.
• Proteïnes inhibidores del cicle cel·lular.
• Factors de transcripció de gens que frenen el cicle cel·lular.
Són causa de càncer, les mutacions que afecten especialment a gens que regulen la proliferació cel·lular, l’apoptosi (mort programada) o la senescència cel·lular (l’envelliment): • Protooncogens = gens normals que estimulen la proliferació. Per mutació se transformen en oncogens (gens que causen càncer).
• Gens supressors de tumors (oncosupressors)= gens normals que inhibeixen el creixement cel·lular. Per mutació la pèrdua de la seva funció causa càncer.
Principals tipus de mutacions segons les causes 1. Mutacions associades a errors en la replicació.
2. Mutacions no associades a la replicació: ◦ Desaminació de bases.
◦ Pèrdua de bases per hidròlisi de l’enllaç N-glicosídic.
◦ Alquilació de bases per agents químics.
◦ Alteracions de les bases per radiacions.
◦ Oxidació de bases per agents oxidants (ROS).
◦ Alteracions en la doble hèlix per agents intercalants.
1. Mutacions associades a la replicació = Errors de les polimerases no corregits per les activitats correctores d’errors: • Substitucions d’una base per una altra no complementària, generalment un tautòmer menys estable. És de freqüència molt baixa gracies a l’activitat correctora d’errors.
• Delecions o insercions de bases per la presència en el motlle de seqüències curtes amb repeticions directes o invertides que la polimerasa no llegeix correctament.
2. Mutacions no associades a la replicació: • Desaminació espontània de bases o induïda per agents químics. L’adenina, la citosina i la guanina poden ser desaminades espontàniament o per acció d’agents químics. La desaminació espontània de la citosina és la més freqüent en mamífers (100 desaminacions/dia). L’agent químic causant de més desaminacions és l’àcid nitrós, que es produeix a partir de conservants alimentaris, nitrit i nitrat sòdic.
La 5-metilcitosina, freqüent en el DNA dels vertebrats, és una base susceptible de patir mutacions. Per desaminació genera timina, que no és reconeguda pels sistemes de reparació.
• Pèrdua de bases per hidròlisi de l’enllaç N-glicosídic. La pèrdua espontània de purines és la més freqüent. Genera un lloc AP (lloc apurínic/apirimidínic). El nucleòtid sense base, poc estable, es degrada i queda un trencament en la cadena. La calor indueix la hidròlisi de l’enllaç N-glicosídic.
• Alquilació de bases per agents químics.
Introducció de grups metil o etil en un àtom d’oxigen o nitrogen de les bases, no catalitzat enzimàticament. Totes les bases es poden metilar.
La dimetilnitrosamina o el dimetilsulfat són exemples d’agents alquilants.
• Alteracions de les bases per radiacions Dímer de timina: formació d’un anell de cicle butà o un fotoproducte, entre dues timines (pirimidines) adjacents, que impedeix l’aparellament amb les bases complementàries.
Provoca distorsions estructurals en la doble hèlix que afecten la replicació i la transcripció.
• Oxidació de bases per agents oxidants (ROS). Les espècies reactives d’oxigen (ROS) són potents agents oxidants generats en l’ambient cel·lular, i per radiacions ionitzants i substàncies químiques. Les oxidacions poden provocar aparellaments de bases incorrectes.
• Alteracions en la doble hèlix per agents intercalants Els agents intercalants són molècules policícliques, planes i hidrofòbiques que a l’unirse a les bases del DNA provoquen alteracions voluminoses i distorsions en la doble hèlix. En la replicació, provoquen l’eliminació o l’addició d’ un o més parells de bases als costats de la molècula intercalada. Són molècules mutagèniques i carcinogèniques.
Principals sistemes de reparació del DNA en E. Coli • Reparació d’aparellaments (lligada a la replicació) incorrectes • Reparació per escissió de base: bases desaminades, metilades, llocs AP.
• Reparació per escissió de nucleòtid: Grans distorsions, dímers de timina, lesions per benzopirens.
• Reparació directa: dímers de timina, bases metilades.
• Reparació per síntesi de DNA translesió (reparació propensa a error o resposta SOS) • Reparació per recombinació.
El nombre de mutacions que acumula una cèl·lula està inversament relacionat amb l’eficiència dels sistemes de reparació Sistema de reparació d’aparellaments incorrectes (MMS, mismatch repair system) Sistema de reparació que funciona coordinadament amb la replicació. Corregeix els errors que han escapat a l’activitat correctora de proves de la polimerasa.
Augmenta la fidelitat de la replicació.
Aquest sistema de reparació ha de discriminar entre la cadena motlle metilada (correcta) i la nova cadena acabada de replicar, sense metilar, que conté l’error.
L’ hemimetilació de seqüències GATC és el senyal de reconeixement de les proteïnes reparadores.
Finalitzada la replicació, la metilasa Dam metila les adenines de totes les seqüències palindròmiques GATC del DNA.
Quan la nova cadena està metilada, ja no es pot reparar cap error per aquest sistema.
També hi han unes proteïnes de reconeixement (MutSMutL) detecten l’aparellament incorrecte i recluten una endonucleasa específica (MutH) L’endonucleasa reconeix els llocs hemimetilats GATC propers a la mutació que li indiquen quina cadena ha de tallar; la no metilada.
Una helicasa desfà els ponts d’hidrogen i una exonucleasa degrada el fragment que conté la mutació.
El fragment de cadena eliminat és sintetitzat per una polimerasa (DNA pol III o DNA pol I) i finalment lligat per la DNA lligasa.
Amb algunes diferències, aquest sistema està també en eucariotes. La nova cadena és reconeguda pels fragments d’Okazaki i el sistema no precisa endonucleasa.
Sistema de reparació per escissió de base (Base-excision repair system, BER) Aquest sistema repara lesions petites que no generen grans distorsions en el DNA: • Bases desaminades.
• Bases metilades per agents químics.
• Llocs AP.
Aquest sistema utilitza: • DNA glicosidases específiques per a cada lesió, que reconeixen les bases incorrectes i hidrolitzen l’enllaç N-glicosídic, deixant un lloc AP.
• AP endonucleases específiques trenquen l’enllaç fosfodièster que conté el lloc AP (per l’extrem 5’) i deixen un forat en la cadena.
• Una polimerasa (DNA pol I en E. coli) treu un fragment amb el nucleòtid alterat i el substitueix .
Finalment la DNA lligasa lliga la cadena.
També està en eucariotes, on participen diverses DNApolimerases.
Sistema de reparació per escissió de nucleòtids (Nucleotide-excision repair system, NER) Sistema de defensa més important contra les lesions causades pels benzopirens (tabac).
Reconeix i repara alteracions que causen distorsions en la doble hèlix, com els dímers de timina. En humans, és l’únic sistema que permet reparar els dímers de timina.
Utilitza una endonucleasa específica (ABC excinucleasa), què reconeix i es lliga al lloc de la lesió, talla la cadena senzilla per dos llocs separats i allibera el fragment que conté la lesió.
Una helicasa (UvrD) separa el fragment tallat.
Finalment una polimerasa (DNA pol I en E. coli i DNA pol  en humans) omple els nucleòtids que falten i la lligasa tanca la cadena.
Sistemes de reparació directa No s’eliminen ni la base ni el nucleòtid que s’han de reparar.
És una reparació que utilitza diferents mecanismes, com: 1. Reparació directa per la fotoliasa (fotoreactivació): reparació dels dímers de timina.
2. Reparació directa per metiltransferases específiques: reparació de O 6-metilguanina.
1. Reparació directa per la fotoliasa (fotoreactivació): reparació dels dímers de timina La fotoliasa és un enzim que reconeix el dímer i trenca directament els enllaços covalents, regenerant les bases. Catalitza una reacció de transferència electrònica iniciada per llum visible.
Només funciona en presència de llum visible, ja que utilitza els cofactors: • FADH2 • Un folat (absorbeix energia lluminosa a λ = 300-500 nm).
Aquest sistema no està en mamífers placentaris, com els humans.
2. Reparació directa per metiltransferases específiques: reparació de O 6-metilguanina.
La O6-metilguanina pot ser reparada per dos sistemes: • Per escissió de base • Per reparació directa En la reparació directa participa un enzim “suïcida”, una metiltransferasa específica, què transfereix irreversiblement el metil de la base a una cisteïna del seu centre actiu.
Aquest sistema també està en eucariotes.
Reparació de lesions de la cadena motlle que bloquegen la replicació: Si la cadena motlle té una lesió no reparada es bloqueja la replicació. En una forqueta de replicació bloquejada hi ha dues vies possibles de reparació: • Reparació per síntesi de DNA translesió (sistema de reparació propens a error o resposta SOS) • Reparació per recombinació homòloga, que requereix obtenir la informació de la seqüència motlle en una cadena de DNA homòloga.
1. Reparació per síntesi de DNA translesió (sistema de reparació propens a error o resposta SOS) La síntesi de DNA translesió (resposta SOS) permet que no s’aturi la replicació.
En E. coli participen polimerases especialitzades que superen les lesions del motlle (DNA Pol IV i V).
Tenen baixa fidelitat. No tenen activitat correctora de proves (exonucleasa 3’) Introdueixen errors probabilitat.
Són mutagèniques.
amb elevada polimerases En eucariotes, un exemple és la DNA Pol η (eta), què afegeix preferentment adenines davant d’un dímer de timina.
2. Recombinació del DNA Intercanvi genètic entre diferents cromosomes o entre diferents regions del mateix cromosoma: • Mantenir la diversitat genètica.
• Reparar el DNA.
• Regular l’expressió gènica.
Mecanisme de recombinació homòloga Alineament dels cromosomes homòlegs.
Ruptura bicatenària per una endonucleasa específica (o per lesió en el DNA).
Una exonucleasa (RecBCD) degrada les cadenes trencades, deixant extensions 3’ de cadena senzilla.
La proteïna RecA (d’intercanvi de cadena) promou que la cadena senzilla envaeixi el dúplex intacte, desplaçant una de les cadenes.
Els extrems 3’ de cadena senzilla actuen d’encebadors per a la DNA polimerasa, que fa una elongació reparadora.
La migració de la cadena genera una estructura amb dos entrecreuaments (unions o intermediaris de Holliday: estructura formada per intercanvi d’una cadena entre dos dúplex de DNA). .
Resolució de les unions de Holliday per una endonucleasa específica (RuvC).
L’escissió de les unions de Holliday, per una endonucleasa (RuvC), regenera dues molècules de DNA recombinant independents.
El procés és conservador: els dos productes tenen els mateixos gens en el mateix ordre lineal que els substrats.
Segons com es resol l’estructura es poden originar dos conjunts de productes, segons es recombinin o no les regions adjacents al DNA híbrid.
El complex RecBCD s’uneix al DNA per un extrem bicatenari trencat.
Es desplaça desnaturalitzant (activitat helicasa ) i degradant (activitat nucleasa ) el DNA.
L’activitat del complex canvia al trobar-se amb una seqüència chi (GCTGGTGG): disminueix la degradació de l’extrem 3’ i augmenta la de l’extrem 5’.
Es genera una cadena senzilla protuberant d’extrem 3’.
Les seqüències chi disperses pel genoma de E. coli promouen la recombinació.
RecA és la proteïna central de la recombinació homòloga.
Catalitza l’aparellament de les cadenes homòlogues del DNA.
Promou la invasió de la cadena senzilla 3’ al dúplex de DNA homòleg, utilitzant la hidròlisi d’ATP.
La forma activa de la proteïna RecA és un filament helicoïdal format per milers de monòmers de la proteïna que s’uneixen cooperativament al DNA.
Tots els organismes tenen proteïnes homòlogues a RecA (Rad51 i Dmc1 en eucariotes).
Recombinació específica de lloc Les molècules que recombinen no són homòlogues Requereix: • Una recombinasa (integrases i resolvases) • Unes seqüències específiques homòlogues curtes (20-200 pb) en els dos llocs a recombinar, on actua la recombinasa.
Funcions molt especialitzades i variades segons les espècies: • Regulació de l’expressió d’alguns gens.
• Reordenaments de DNA programats en el desenvolupament dels organismes.
• Reordenaments de DNA lligats a la replicació d’alguns DNA vírics o plasmídics.
Transposició Recombinació per transposons: elements genètics mòbils; seqüències de DNA que es desplacen pel genoma. La transposició pot ser replicativa o conservativa.
La transposició és un mecanisme generador de variabilitat genètica. Tipus de transposons: • Transposons de DNA • Retrotransposons: ex. seqüències LINEs i seqüències SINEs.
La majoria dels transposons bacterians són transposons de DNA. Els més senzills : • Tenen en els extrems seqüències de inserció (IS) requerides per la transposició; són repeticions invertides.
• Generalment codifiquen l’enzim que catalitza la transposició, transposasa (talla en els llocs donador i receptor).
• No tenen llocs d’inserció molt específics.
• No requereixen homologia.
• Generen duplicacions curtes en el lloc d’inserció (5-10 pb).
Retrotransposons: Els retrotransposons (sense LTR o retrotransposons de poli-A) no tenen repeticions invertides terminals i en els dos extrems de l’element tenen seqüències diferents. En l’extrem 3’ tenen un segment de parells de bases A-T (poli-A).
Els autònoms codifiquen les proteïnes necessàries per a la transcripció inversa i la integració.
Son retrotransposons el DNA repetitiu dispers LINEs i SINEs. No hi ha SINEs autònoms i aquests s’integren utilitzant la integrasa dels LINEs.
...