Tema 4: Bancos de DNA genómico 1/2 (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnología del DNA recombinante
Año del apunte 2017
Páginas 10
Fecha de subida 03/10/2017
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Profesor: Jaume Pinyol

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TEMA 4 A) BANCOS DE DNA GENÓMICO TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE.
María Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología.
Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Los bancos de DNA genómico son colecciones de clones que contienen fragmentos de DNA genómico de un organismo. Contienen, o se intenta que contengan, representado todo el genoma de un organismo.
Interés: - - El objetivo de los bancos de DNA genómico es muy parecido a los bancos de cDNA. La diferencia es que los de genómico tenemos representadas todas las secuencias del genoma, mientras que en los de cDNA tenemos representadas todas las secuencias que codifican para proteínas. Se utilizan cuando queremos obtener la secuencia concreta del organismo sobre el cual hemos hecho el banco.
Permiten estudiar la estructura completa de los genes y sus secuencias reguladoras.
Proyectos de secuenciación del genoma.
La metodología para hacer los bancos de DNA genómico es un poco diferente que cDNA.
Paréntesis: los bancos de DNA genómico continúan siendo vigentes y son una herramienta (eina) útil (en el caso de eucariotas) para acabar obteniendo la secuencia concreta.
A pesar de que hay métodos de ultrasecuenciación, es necesario recurrir a bancos de DNA genómico, pero en el caso de los microorganismos ha quedado obsoleto, sobre todo para genomas de microorgarnismos inferiores a 5 mega bases. En los métodos de ultrasecuaenciacion ya es posible obtener la secuencia concreta del genoma de un microorganismo si tiene esta medida igual o inferior. Para eucariotas es imprescindible, por tanto, hablamos de ellos.
Si nos interesa la secuencia reguladora de un gen, ¿utilizamos un banco de DNA genómico o cDNA? Genómico, porque en el cDNA sólo hay las secuencias que codifican para las proteínas.
Para la secuencia de un telómero también utilizaremos un banco de DNA genómico.
En el caso de eucariotas superiores, determinar en un banco de DNA genómico cuál es la secuencia codificante de un gen puede ser problemático.
En un banco de DNA genómico raramente encontraremos intrones e exones, para eso cDNA.
REPRESENTATIVIDAD.
El criterio de representatividad del DNA genómico es análogo a la del cDNA. El número de clones que necesitamos para obtener un banco de DNA genómico depende de: 1. La medida del genoma.
2. La medida de los insertos que haya en el DNA genómico 3. Del número de clones independientes.
- Probabilidad de encontrar un clon con la secuencia deseada: 1 Belén Pérez Sanmartín - 2º Biotecnología Fijando una probabilidad del 99% y aislando “n”: Cuanto más pequeño sea el genoma y cuanto más grande sean los bioinsertos, menor será el número de clones necesarios para que sea un banco representativo. Insertos más pequeños, más clones.
LOS BANCOS DE DNA GENÓMICO CONTIENEN FRAGMENTOS DE DNA SOLAPANTES.
Si compramos un banco de DNA genómico, que no sea un banco de DNA genómico amplificado (fotocopias) porque tienen la misma limitación que el cDNA.
2 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Para los bancos de DNA genómico SIEMPRE se ha de tener insertos que solapen con otros insertos de este DNA genómico. Necesitamos insertos solapantes, a diferencia que los cDNAs.
¿Por qué? Si los fragmentos de un DNA genómico no son solapantes, no podemos obtener clones adyacentes ni reconstruir un genoma entero.
Hay un primer clon con un gen de interés el cual es más grande que el gen que hemos aislado (cosa normal en un eucariota superior), si el banco de dna genómico no es solapante... Si el banco de DNA genómico está formado por fragmentos solapantes por hibridación podemos encontrar clones que solapen con el primero...
Misma filosofía que cuando se secuencian proteínas. Si los clones no estuvieran solapados no podríamos determinar la secuencia de una proteína.
- Cómo buscar clones que solapen con el primero, proceso general: Si los dos clones comparten secuencia, entonces estos cuadran y se puede secuenciar, serán fragmentos solapantes.
1. Lo normal es obtener una sonda de los dos extremos del primer clon que hemos obtenido.
2. Esta sonda la utilizamos para hibridar la genoteca (banco de DNA genómico), de esta manera si hay clones solapantes podemos detectar otro que solape con él y así sucesivamente.
Alternativamente, hoy en día lo que podemos hacer es secuenciar todos los genes de un banco de DNA genómico y entonces hacer esta operación de hibridación mediante ordenador (en vez de Southern). Hay programas informáticos que permiten detectar la igualdad de secuencia en el fragmento del extremo de estos clones y, por lo tanto, solapan.
LOS FRAGMENTOS DE DNA SOLAPANTES PERMITEN (EN TEORÍA) RECONSTRUIR UN CROMOSOMA ENTERO.
3 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología ¿Cómo hacemos para que en el banco de DNA genómico los fragmentos estén solapados?, es decir, para que tengan secuencias comunes entre ellos --> OBTENCIÓN DE FRAGMENTOS SOLAPANTES.
En la clase problemas nos comentó que hay enzimas de restricción de 4 bases que su frecuencia de corte es de una diana cada aproximadamente 256 bases, es decir, 1/256 nucleótidos.
Si hacemos una restricción completa con Sau3A1 tendremos 256 fragmentos que solapan entre ellos.
Imaginar que tenemos el cromosoma humano y todas las dianas sau3A1 que puede haber en el cromosoma 1. En vez de hacer una restricción completa haremos una restricción parcial para que le demos tiempo al enzima de cortar una de cada 256. Si le hace falta una hora, le dejamos 1 minuto y la diana que corte al cromosoma 1 será prácticamente aleatoria. De tal manera que si hacemos restricciones parciales lo que obtenemos son fragmentos de este cromosoma 1 que solaparán con un cierto extremo. Y, ¿por qué sau3A1 tiene una frecuencia de 4 bases? Porque cuantas más dianas, más posibilidad de afectar. 4 bases porque es isocaulómero con BamHI.
Podemos cortar el vector con BamHI y clonar los extremos cohesivos de sau3A1 que vienen de la digestión parcial de DNA genómico.
Conclusión: ¿Por qué sau3A1? La diana es de 4 bases con lo cual tenemos millones de dianas Sau3A1 permitiendo que haya un corte aleatorio que genera un extremo cohesivo de 4 bases que es compatible con BamH1 por tanto se puede clonar sin problema porque es cohesivo y compatible con BamHI.
ESQUEMA PARA LA CONSTRUCCIÓN DE UN BANCO DE DNA GENÓMICO.
1. Material de partida: células, tejidos o todo el organismo.
En la construcción de un banco de DNA genómico la diferencia clara con un cDNA es que podemos usar cualquier tejido del organismo. No todos los tejidos diferentes expresan los mismos genes (los de cDNA son dependientes de tejido).
Se acostumbra a utilizar el tejido más simple para trabajar, es decir cualquiera que permita hacer extracciones de DNA de forma más simple. Si hacemos un banco de DNA genómico con un ratón, pues cogemos el hígado, no una uña por ejemplo. El tejido más simple.
Hay que tener cuidado con los bancos de DNA genómico obtenidos a partir de células del sistema inmune. Hay un proceso de diversificación y no todas las células del sistema inmune tienen el mismo genoma: por ej. Inmunoglobulinas. Recomendación: no utilizar células blancas.
2. Aislamiento de DNA de alto peso molecular.
Una vez hemos elegido el tejido que utilizaremos, aislaremos DNA de alto peso molecular. No es ninguna tontería.
Si hacemos una extracción de DNA normal, habitualmente cuando pipeteamos el DNA, se rompe y cuando precipitamos el DNA con etanol también se rompe. Una extracción normal sin demasiadas precauciones rinde unos fragmentos que son entre 15-20 kb. Si obtenemos fragmentos de esta longitud no valdrá para hacer un banco de DNA genómico, hace falta una media megabase.
4 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología El material de partida serán trozos de 20 kb que estarán solapados, pero que después de digerir con sau3A1 tengamos fragmentos de 20 kb.
Criterio: cuando se hace una extracción de DNA para tener un banco de DNA genómico, los fragmentos han de ser siempre como mínimo el doble de grandes de lo que admite el vector.
Consejo: Puntas de pipeta cortadas. Al aumentar el diámetro de la punta, el DNA se corta menos y podemos eliminar los reactivos orgánicos por diálisis, obtenemos fragmentos que van de 60-70 kb, y ya está bien.
Los métodos de clonaje de DNA estándar (como clonar fragmentos con un YAC) no valen. Lo que hemos de hacer es inmovilizar el tejido en un bloque de agarosa y hacer la extracción de DNA sobre estas células inmovilizadas. El DNA queda prácticamente intacto, se rompe muy poco.
Proceso: 1.
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Disgregamos las células.
Las sedimentamos en un tubo.
Se elimina el sobrenadante.
Se mete agarosa liquida.
Se mueve con las células.
Se deja solidificar dejando trozos de 2,3,4... mm de lado que tendrá las células.
Sobre las células se hace la extracción de DNA y no se rompe.
Una vez lo digerimos, lo ponemos en una “buchaca” de electroforesis y podemos resolverlo por electroforesis de campo pulsante.
3. Digestión parcial. Se pueden aislar fragmentos de una medida determinada.
Una vez aislamos el DNA de alto peso molecular, hacemos las restricciones parciales.
Habitualmente utilizaremos: A) Sau3A1 para clonar con vectores de BamHI para genomas que sean 50% A-T y 50% C-G.
B) Tsp309I, para clonar con vectores de EcoRI para genomas ricos en A-T.
4. Desfosforilar los fragmentos de DNA.
Una vez echa esta digestión parcial desfosforilamos los fragmentos. Esto es esencial para evitar que durante la ligación que haremos con el vector, un fragmento se junte con otro que no esté en el orden correcto (parecerá que la secuencia correspondiente a estos dos fragmentos está presente de forma contigua en el genoma, pero no).
¡¡No pueden haber insertos quiméricos!! Se llaman así, es decir, procedentes de la ligación de dos fragmentos que antes estaban separados en el genoma.
5. Clonar los DNAs en el vector apropiado. El vector dependerá de la misma medida (M) del genoma.
Una vez tenemos fosforilados los fragmentos los clonaremos con el vector apropiado que dependerá de la medida del genoma.
6. Titulación y “screening” del banco.
PURIFICACIÓN Y PREPARACIÓN DEL DNA GENÓMICO.
5 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología La parte más complicada de la obtención de un banco de DNA genómico son las digestiones parciales. El problema principal es que el DNA se rompe muy fácilmente durante su purificación (extremos no cohesivos).
Para genotecas en fago Lambda y cósmidos solo hace falta una extracción de DNA standard con precauciones.
Para genotecas en BACs y YACs se ha de recurrir a hacer la extracción de DNA sobre células inmovilizadas en bloques de agarosa.
Las digestiones parciales (Sau3A1) requieren optimización. Son difícilmente escalables. Es necesario hacer un ensayo piloto previo para maximizar el rango de pesos moleculares.
De esta forma sabremos la medida de los fragmentos que salen antes de digerirlos parcialmente con Sau3A1 y después podemos ver, por ejemplo, que han salido más peques de lo que me hacían falta.
Cogemos una pequeña cantidad y se digieren diferentes tiempos con Sau3A1 y trias el peso molecular que va bien. Ya sé que cogiendo tantos microgramos con tanto de sau3a1 y a tanto tiempo tengo la distancia que quiero: pues no, no saldrá.
1. Partimos de un DNA genómico que después de la extracción tiene tantos kb, digerimos a diferentes tiempos con sau3a1 (para ver qué tiempo nos interesa).
2. Cogemos aquel tiempo en el que el máximo nos queda en lo que nos ha admitido el vector de clonaje.
3. Ahora escalamos la restricción, no hacemos una única restricción, hacemos una con un punto anterior y una con un punto posterior. Lo escalamos a los microgramos que queramos. Hacemos siempre 30 segundos antes y 30 segundos después en el punto que hemos visto que daba el máximo porque sino deberíamos repetirlo otra vez.
FAG LAMBDA. VECTORES DE SUSTITUCIÓN.
Ya nadie hace bancos de DNA genómico con el fago Lambda, pero buena parte del genoma humano se ha hecho con bancos de DNA genómico de fagos Lambda.
A nivel de homenaje de los Lambdas como vectores de substitución lo comentamos (xd).
6 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Tenemos el DNA genómico digerido con Sau3A1 y lo vamos a clonar en un vector de este fago.
¿Cómo preparamos el vector? 1. Digerimos secuencialmente el fago Lambda con EcoRI y BamHI. ¿Por qué? Porque cuando digerimos con EcoRI y BamHI nos queda el brazo izquierdo y el brazo derecho con la diana Bam, mientras que la parte central nos queda flanqueada por dianas EcoRI.
2. Se precipita con etanol o isopropanol para eliminar el pequeño conector entre las dianas EcoRI y BamHI. El conector que va entre Bam y Eco es suficientemente pequeño como para que no precipite de forma eficiente, 10 bases no precipitan en etanol. Así, recuperaremos sólo: 2.1. El brazo de la izquierda cos-Bam.
2.2. Lo del centro Eco-Eco.
2.3. El brazo de la derecha cos-Bam.
3. Cuando volvamos a poner a ligar eso con el inserto obtenido después de las digestiones parciales con Sau3A1, si el brazo izquierdo y el derecho ligan, son demasiado pequeños para que el Lambda pueda encapsidar.
El brazo izquierdo no puede ligar con el brazo central porque tiene dianas Eco y solo puede ligar consigo mismo, ¿cuál es la manera de que encapside? A) Coger un inserto de 10-15 kb.
B) Otra posibilidad es aprovechar la selección genética.
En la parte central encontramos los genes de recombinación general de Lambda que son rec y gam.
Si por mala suerte algún fragmento de DNA en la parte del centro no queda bien cortado, se puede volver a religar, la presencia de estos dos genes se pueden aprovechar.
Si está bien cortado la única posibilidad de que encapside es coger un inserto de 10-15 kb. Si no corta bien algún fragmento es Bam-Bam, podría religar con los brazos del vector y no nos interesa.
7 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Si esto sucede, si plaqueamos la genoteca sobre E. Coli portadora del fago P2 en lisogenia, dado que el gen gam es incompatible con el gen old del fag P2 hay una incompatibilidad genética y se mueren.
Si queda mal cortado la parte central y religa con el vector, tenemos los genes red y gam, en concreto gam es incompatible con old codificado por el fag P2 y lo mismo de antes, si plaqueamos, los fagos Lambdas que tengan la parte central no podrán crecer.
Vía selección genética o la otra vía conseguimos que de cada 1000 clones tiene un Lambda uno de cada 10000 no lleva inserto ¿? - El fago Lambda WT tiene fenotipo Spi+ (sensible a la interferencia para el fago P2).
Un fago Lambda red- gam- tiene fenotipo Spi- (insensible a la interferencia para el fago P2).
Cuando el fago Lambda WT infecta E. Coli, la célula huesped pasa a ser recBCD-. La presencia del gen old del fago P2 es letal en combinación con el fenotipo recBCD-.
OBTENCIÓN DE UN BANCO DE DNA GENÓMICO EN FAGO LAMBDA.
8 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología CÓSMIDOS.
Hacer un banco de DNA genómico con cósmidos es utilizar vectores de tipo plásmido que solo llevan la región cos del fago Lambda y, entonces, estas regiones se utilizan simplemente como un método para encapsidar in vitro la genoteca.
Por otra parte, es lo mismo que hacer un banco de DNA genómico con Lambda, pero en vez de Lambda, un vector de DNA plasmídico que lleva los extremos cos del fago Lambda.
YACS Y BACS.
YACs y BACs: son vectores de muy elevada capacidad para clonar insertos de hasta 200-300 kb o nt (¿?) en el caso de los BACs o bien hasta 1,5 megabases.
- Los YACs nos portan: 1.
2.
3.
4.
Los dos telómeros de levadura Un oriC Una diana EcoRI Un factor de selección.
Una vez introducimos las megabases dentro del YAG se puede propagar dentro de levaduras sin problemas.
-Los BACS están ligados con el factor F. Sería el equivalente de los YACs pero en bacterias.
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