Tema 7. Regulació de l'activitat enzimàtica (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Bioquímica I
Año del apunte 2014
Páginas 8
Fecha de subida 02/02/2015
Descargas 16
Subido por

Vista previa del texto

Tema 7. Regulació de l’activitat enzimàtica ÚS DE LA RADIOACTIVITAT EN LA DETERMINACIÓ DE L’ACTIVITAT ENZIMÀTICA Per determinar l’activitat enzimàtica en una radiació poden utilitzar-se isòtops radioactius, que emeten energia en forma de radiacions. La mesura de la radioactivitat pot realitzar-se qualitativament amb un comptador Geiger-Müller o bé quantitativament amb un comptador de radioactivitat de centelleig líquid. No és possible detectar la totalitat de radiació, per tant quanta més intensitat d’emissió major serà l’eficiència del recompte.
Radioactivitat combinada amb immunoprecipitació La immunoprecipitació a partir d’una mostra marcada amb S35-Met, o qualsevol altre element radioactiu, permet determinar nivells de proteïnes i si hi ha altres proteïnes associades.
L’anticòs, al no estar marcat, no s’observarà en l’autoradiografia final, doncs només s’impressionaran els llocs on hi hagi radioactivitat.
La proteïna s’immunoprecipita i s’estudia el seu comportament amb estímuls diferents. Permet determinar variacions en nivells de proteïnes, pesos moleculars i si hi ha algun element unit. En aquest cas, per exemple, s’observa algun element unit en +S3, +S4 i +S5. L’augment del pes molecular amb l’addició de l’estímul 5 indica que, per exemple, hi ha hagut una protonació.
Experiments de pols i caça Els experiments de pols i caça serveixen per determinar la vida mitjana (l’estabilitat) de les proteïnes. En aquesta tècnica la proteïnes es troba marcada radioactivament i observem, a temps 0, la quantitat total. En funció de la disminució de la quantitat proteïna que anem observant als diferents temps, podrem determinar si la degradació és ràpida o lenta i la vida mitjana de la proteïna.
En aquest cas es pot comparar la degradació de la proteïna en dues condicions diferents (-Y i +Y). En condicions de –Y no trobem proteïna passades 4 hores mentre que en condicions de +Y encara n’hi ha passades 6 hores. Aquesta comparació permet determinar que l’estabilitat és major en presència de Y i demostra que la vida mitjana de les proteïnes és susceptible a regulació.
L’estudi de la degradació de les proteïnes podria realitzar-se també mitjançant Western Blot amb l’estudi de dues mostres en diferents condicions al llarg del temps.
Ús d’isòtops estables al laboratori - Stable isotope labelling of amino acids in cells (SILAC) El SILAC és un mètode que combina el marcatge amb isòtops estables (no radioactius) amb l’espectrometria de masses per determinar variacions dels nivells de proteïnes.
A partir d’una mostra de proteïnes s’extreuen dues (o més) mostres idèntiques i es marca una amb nitrogen 15. Una mostra es manté com a control i a l’altra s’aplica un estímul determinat, com podria ser l’addició d’insulina. Les dues mostres es mesclen i es realitza una espectrometria de masses, amb la que s’obtindrà un espectre de pics dobles que representaran la mateixa proteïna: un pic correspondrà a la proteïna normal i l’altre correspondrà a la proteïna marcada. La comparació de l’alçada dels dos pics indicarà major o menor quantitat, per tant es podrà determinar quin efecte té l’estímul sobre la proteïna.
Aquest experiment també es realitza en ratolins.
Determinació de la radioactivitat específica La radioactivitat específica és la radioactivitat per unitat de massa.
Unitats radioactivitat: µCi = 2,2 x 106 dpm En l’estudi de la radioactivitat, però, només es detecten part de les desintegracions, per això es parla d’eficiència de comptatge (E).
Exemple exercici Quina radioactivitat específica té una solució preparada barrejant 2µL de piruvat C14 (10µCi/µL) i 100 µL de piruvat no marcat (fred) 10mM? E pel C14 = 0,3 Per cada 13,2 comptatges per mol tenim un pmol, per tant és possible calcular la massa a partir de la radioactivitat.
Ús de la radioactivitat per determinar l’activitat enzimàtica La radioactivitat pot ser utilitzada també per determinar l’activitat enzimàtica en una mostra.
En una reacció de conversió d’A en B, catalitzada per l’enzim AB convertasa, on A i B es puguin separar, per exemple per cromatografia, podem afegir A radioactiu i la radioactivitat que copurifiqui amb B serà indicativa de l’activitat enzimàtica.
Aquest sistema permet també quantificar masses d’una manera molt precisa. En la mateixa situació, si A i B tenen el mateix isòtop (no es perd el grup en la reacció) i es coneix la radioactivitat específica de l’A radioactiu que hem afegit la radioactivitat que copurifiqui amb B indicarà la massa de B produït.
Establiment rutes metabòliques Un altre possible ús de la radioactivitat és la determinació de precursors i l’establiment de rutes metabòliques. Si en una cèl·lula o extracte cel·lular s’afegeix A radioactiu i es detecta radioactivitat en altres compostos (B, C) podem determinar que B i C han estat formats a partir de A.
REGULACIÓ DE L’ACTIVITAT ENZIMÀTICA PEL SUBSTRAT Els enzims són catalitzadors molt susceptibles a regulació. Igual que succeïa amb l’hemoglobina, el enzims poden presentar cooperativitat. Interessa que siguin poc eficients a baixes concentracions de substrat i ho siguin molt a altes concentracions.
Els enzims cooperatius no seguiran l’equació de Michaelis-Menten ni seguiran una linia recta en la representació de Lineweaver-Burk, doncs tindran dues kM diferents, una per la forma d’alta afinitat i una per la de baixa afinitat. En aquesta segona representació podran extrapolar-se dues rectes per les formes d’alta i baixa afinitat que indicaran les dues k M.
L’enzim oscil·larà en aquestes dues formes.
En enzims cooperatius pot utilitzar-se també la representació de Hill, que indicarà el grau d’associació màxim, el número de subunitats catalítiques i les k M de les formes d’alta i baixa afinitat. Presenta alguns canvis: Totes tres representacions són representacions de la velocitat enzimàtica en funció de la concentració de substrat.
L’aspartat transcarbamoilasa és un exemple d’enzim cooperatiu que presenta 6 subunitats amb centre actiu. La seva forma quaternària és diferent en les formes T i R.
REGULACIÓ DE L’ACTIVITAT ENZIMÀTICA PER EFECTORS AL·LOSTÈRICS Els factors al·lostèrics són elements que no s’uneixen al centre actiu de l’enzim, lloc d’unió del substrat, sinó que ho fan en un altre lloc millorant o empitjorant l’activitat enzimàtica. Els activadors s’uniran a la forma R (alta afinitat) i els inhibidors a la forma T (baixa afinitat) i realitzaran un control gradual: a major quantitat de factor major serà la regulació.
DETERMINACIÓ DE LA UNIÓ D’UN LLIGAND A UN ENZIM La determinació de la unió d’un lligand a un enzim pot realitzar-se mitjançant un procés de diàlisi: si el lligand es troba unit a l’enzim no travessarà la membrana També pot determinar-se per filtració amb un lligand marcat radioactivament i un filtre permeable a aquest però no al receptor. Si el lligand es troba unit al receptor i fem passar la solució que els conté pel filtre, el complex no el traspassarà i detectarem radioactivitat. Pot utilitzar-se la representació d’Scatchard per determinar l’afinitat.
REGULACIÓ DE L’ACTIVITAT ENZIMÀTICA PER MODIFICACIÓ COVALENT L’activitat enzimàtica pot regular-se també mitjançant modificacions covalents com la proteòlisi. En aquest cas no hi ha graus d’activitat sinó que la modificació provoca l’activació o la inhibició total de l’enzim.
La proteòlisi és una modificació important en les proteases, que no se sintetitzen de forma madura sinó que una altra proteasa les ha de dividir, produint-se una reacció en cadena: En el cas de moltes proteases no interessa que funcionin dins la cèl·lula, de manera que aquesta característica permet que no s’activin fins que no surtin a l’espai extracel·lular.
Els assajos de pols i caça permeten determinar l’origen de les proteïnes. En primer lloc es realitza un Western Blot amb un anticòs anti cadena B mitjançant el qual es detecten 3 cadenes de diferent mida, doncs la cadena B està present en el quimiotripsogen, la πquimiotripsina i l’α-quimiotripsina. A continuació es realitza un experiment de pols i caça seguit d’una immunoprecipitació. Inicialment es detecta únicament el quimiotripsogen, que va desapareixent donant lloc a la π-quimiotripsina. Tots dos van disminuint i apareix l’αquimiotripsina, que porta associada alguna altra cosa (bandes inferiors).
El següent quadre mostra algunes de les modificacions covalents més comunes.
En els processos de fosforilació i defosforilació intervenen les proteïnes quinasa i fosfatasa respectivament. La promera utilitza l’ATP per incorporar un grup fosfat a la molècula, mentre que les fosfatases treuen un grup fosfat sense incorporar-lo a l’ADP.
Per determinar que una proteïna ha estat fosforilada pot utilitzar-se radioactivitat. Si s’afegeixen grups fosfats radioactius a la cèl·lula i posteriorment observem que la nostra proteïna emet radiació serà indicatiu de que ha estat fosforilada.
Per arribar a aquesta conclusió es realitzen dos experiments: un autoradiograma i un Western Blot. Amb l’autoradiograma es detecta més radioactivitat en presència de certs estímuls, però no es pot determinar si és a causa d’una fosforilació o perquè s’ha produït més quantitat de proteïna. Amb el Western Blot es detecta la mateixa quantitat de proteïna, per tant podem determinar que ha patit una fosforilació.
DISTRIBUCIÓ INTRACEL·LULAR Si proteïna i substrat no es troben en el mateix lloc la reacció és impossible. Dues tècniques analítiques, la immunofluorescència la immunohistoquímica permeten determinar la localització de les proteïnes dins la cèl·lula.
Immunofluorescència Consisteix en la fixació de les proteïnes dins la cèl·lula i l’eliminació de la membrana de manera que totes les proteïnes siguin accessibles. S’introdueix un anticòs específic per la proteïna a identificar i un anticòs secundari fluorescent.
Immunohistoquímica Permet la localització de cèl·lules positives per un determinat antigen en una barreja complexa, ja sigui teixit normal o patològic. Consisteix en al marcatge amb un anticòs secundari que es troba unit a un enzim que catalitza una reacció que produeix color.
CENTRIFUGACIÓ La centrifugació és una tècnica preparativa que permet la separació d’orgànuls d’una cèl·lula.
Quan una partícula (proteïna, cèl·lula...) és sotmesa a una acceleració angular, la velocitat a la que es mou depèn de les seves propietats i de la densitat de la dissolució. Es basa en la igualació de la força centrífuga i la força de fricció.
m·V·ρ·w2·r = força de flotació M = massa de la partícula (Da) N = número d’Avogadro V = volum específic ρ = densitat de la solució w2 = velocitat angular r = radi f = coeficient de fricció v = velocitat de sedimentació s és el coeficient de sedimentació. Moltes partícules tenen un valor s definit i indica com de ràpid baixarà la partícula a una velocitat angular determinada. Les partícules més grans cauran abans. s s’expressa en Svedbergs (S), que equival a 10-13 segons.
CONCEPTES IMPORTANTS Entendre l’ús de la radioactivitat per l’anàlisi de l’activitat enzimàtica Saber calcular la radioactivitat específica d’una barreja d’una substància marcada radioactivament i no marcada (“freda”) Interpretar el resultat d’un experiment d’immunoprecipitació (a equilibri o pols i caça) Determinar si un enzim és cooperatiu i quin grau de cooperativitat té.
Explicar com l’activitat d’u enzim es pot regualar per efectors al·lostèrics i modificació covalent Determinar com es determina la Kd de la unió d’un lligand a un enzim mitjançant la representació de Scatchard Interpretar resultats d’experiments en que enzims estiguin regulats mitjançant modificació d’aminoàcids o proteòlisi Entendre en què consisteix i per a què serveix la centrifugació.
...