Tema 3 - Blotting (I) - Introducció a les tècniques (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 16
Fecha de subida 26/03/2016
Descargas 21
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tema 3 – Tècniques de blotting APROXIMACIONS GENERALS PEL GENOTIPAT Veurem les tècniques de blotting, les hibridacions in situ i els macro i microarrays.
Les tècniques de blotting o de transferència es basen en el mateix fonament que les autoradiografies, i permeten identificar la presència o absència de determinades bandes en un gel d’electroforesi de proteïnes o d’àcids nucleics.
El blotting consisteix en la transferència de material d’un suport sòlid no adient a un suport adient, el qual ens permetrà dur a terme un anàlisi.
El blotting és una tècnica que va ser desenvolupada inicialment per Sir Edwin Southern l’any 1975. Aquest senyor va revolucionar les tècniques d’anàlisi molecular dissenyant la tècnica batejada amb el seu nom, el Southern blot. Fins llavors, els genomes s’estudiaven a partir d’enzims de restricció i la realització de mapes físics. Amb això s’obtenien bandes discretes, però en genomes complexes hi ha moltes dianes i fragments de diferents grandàries, per tant no era tan obvi; si digerim genomes complexes amb enzims de restricció no obtindrem bandes, obtindrem carrils difuminats. En tenim un exemple tot seguit (en les columnes on tenim enzims com BamHI, EcoRI...).
La novetat que aporten les sondes és que limiten l’anàlisi a una regió concreta i hibriden sobre fragments de DNA digerits i separats (electroforesi) prèviament. Un cop es té tot preparat, es transfereix al gel mitjançant les tècniques de blotting.
55 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Algunes premisses i variants dels dissenys El DNA difon; això pot comportar problemes a l’hora d’unir la sonda. Això fa que no puguem modular la temperatura per controlar la hibridació. Si ho féssim, estaríem contaminant la mostra, perquè estem treballant sobre gels que es podrien fondre i barrejar-se amb el DNA.
Quan fem les electroforesis prèvies per separar les mostres, hem de tenir en compte que: per separar àcids nucleics farem servir gels d’agarosa, i per separar proteïnes farem servir gels de poliacrilamida. Ara bé; aquests gels són molt dèbils. El que es fa llavors és el blotting, la transferència dels gels d’electroforesi a un de més rígid, que acostumen a ser membranes de nictrocel·lulosa.
També s’han fet variants del disseny explicat en les quals es pot trobar allò que es busca en medis porosos (electroforesi) i després es fa una transferència a una membrana de nylon, de manera que sigui més manipulable i aquí sí puguem realitzar canvis de temperatura.
Finalment també trobem variants en les quals no cal separar per electroforesi; separem directament sobre les membranes de nylon.
TÈCNIQUES DE BLOTTING A partir de les tècniques de blotting s’han derivat una sèrie de tècniques d’anàlisi molecular que permeten estudiar DNA, RNA, proteïnes i interaccions entre aquests components.
Aquestes tècniques vinculades al blotting són: - Western analysis: permet l’anàlisi de proteïnes.
Southern/Northern analysis. permet l’anàlisi de DNA/RNA.
Slot/Dot blotting.
Bacterial colony blotting. permet l’anàlisi de i detecció de colònies bacterianes.
56 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Southern blot El Southern blot es basa en la localització en un conjunt de molècules o fragments de DNA aquells que contenen una seqüència concreta mitjançant l’ús de sondes específiques i la hibridació.
1. Aïllament del DNA El primer que fem és desestructurar la mostrar i aïllar-ne el DNA que volem analitzar. Quan la mostra perd l’estructura, perdem la capacitat d’analitzar in situ, i passem a analitzar molècules. Per això és important que el DNA estigui intacte, ni degradat ni contaminat, el volem íntegre i purificat. També és important que n’hi hagi en suficient quantitat i en bones condicions. Aquest procés pot ser molt llarg.
2. Digestió enzimàtica Digerim la mostra de DNA per tenir-la en fragments petits. Usarem enzims de restricció específics de diana, amb la qual cosa sempre obtindrem el mateix patró de fragments.
3. Separació electroforètica Un cop digerit el DNA, el separem per grandària mitjançant electroforesi. Com hem dit, el material sobre el qual es fa aquesta electroforesi és massa dèbil i no permet fer la hibridació.
Per això farem la transferència a una membrana de nylon més sòlida.
4. Desnaturalització La mostra que volem analitzar (l’àcid nucleic) l’hem de desnaturalitzar, així com la sonda, ja que posteriorment hauran d’hibridar en forma de monocadena.
La del DNA es desnaturalitza per pH (solució altament alcalina); com ja hem dit, està en un gel d’agarosa, no ho podem fer per temperatura, perquè sinó es barrejaria el DNA amb el gel d’agarosa desfet. En canvi la sonda si que es pot desnaturalitzar per temperatura.
5. Transferència Procedim a la gràcia de les tècniques de blotting, que és la de transferir el DNA separat, ocupant la mateixa posició.
6. Fixació Fixem el DNA de cadena senzilla sobre un suport sòlid.
57 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 7. Hibridació Hibridem el DNA amb la sonda desnaturalitzada específica. Per fer això, s’incuba la sonda sobre el suport on es troba la mostra de DNA, de manera que quan baixi l’astringència, és a dir, quan disminueixi la severitat de les condicions, es facilitarà la hibridació de les sondes amb el DNA.
8. Rentats Fem rentats per treure les restes de sonda que no han aparellat i que podrien interferir amb els resultats.
9. Detecció Per últim, realitzem la detecció. Detectarem la marca associada a la sonda de DNA, no el DNA en si. Per tant la sonda ha d’estar prèviament marcada.
Això ho hem explicat basant-nos en el Southern, però amb aquest procés podem analitzar DNA, RNA i proteïnes (és pràcticament extrapolable per un procediment general de blotting).
Obtenim una població de fragments de DNA, de molècules de RNA o de proteïnes. Tot seguit l’explicarem més en detall.
58 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Separem electroforèticament per grandària en unes condicions determinades. Quan transferim a un filtre que serà el que usarem per l’anàlisi ja estem fent un blotting. En aquest filtre es procedirà a fer l’anàlisi, ja sigui mitjançant sondes, anticossos específics de proteïnes...
Tant el Southern, Northern i Western es van desenvolupar als anys 70. El primer senyor es deia Southern. A partir d’aquí es van donar noms a les altres tècniques derivant de la idea de les direccions (i pa ke kieres saber eso jaja saludos).
Amb el Southern es poden detectar la presència de certes seqüències, canvis de seqüència del DNA (sempre que impliquin alguna diana de restricció de l’enzim utilitzat); amb el Northern podem analitzar grandària i abundància dels RNAs (en principi aquests no es digereixen), i amb el Western detectem canvis en la quantitat i grandària de les proteïnes.
Una aplicació d’aquestes tècniques de blotting és la detecció d’oncogens a través d’alteracions al DNA i/o proteïnes i gràcies a modificacions epigenètiques (com ara canvis de metilació nuclear).
Això es pot fer mitjançant blotting, emprant diferents aspectes que ens interessin en el diagnòstic a l’hora de determinar si hi ha una variació i què la seva causa.
Per tant són tècniques que permeten un anàlisi molt ampli: es poden analitzar àcids nucleics obtinguts de diferents formes i no sempre cal electroforesi.
59 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 PROCEDIMENT GENERAL DEL BLOTTING Separació electroforètica Les tres tècniques bàsiques de blotting tenen en comú la separació del material mitjançant electroforesi usant materials de superfície porosa on s’apliquen un camp elèctric, per tant en funció de les càrregues les molècules s’orientaran d’una manera o una altra; el recorregut de les molècules depèn de la seva càrrega, la seva mida, la seva configuració, etc. Hem de buscar, en el ca s de Southern, Northern i Western, les condicions adients per poder distingir en funció de la grandària, no de la càrrega, etc.
Per l’anàlisi dels àcids nucleics farem servir gels d’agarosa; en Southern i Northern fem servir agarosa desnaturalitzant per RNA (en concentracions suficients de formamida o formaldehid) i agarosa no desnaturalitzant pel DNA, per tal que es pugui separar per grandària. Nosaltres volem que se separin per la seva grandària; si les molècules de RNA estan plegades no se separaran de forma adequada.
Per l’anàlisi de proteïnes farem servir gels de poliacrilamida, que també separen per grandària.
En funció de la mida mitja del porus les molècules es desplaçaran d’una manera diferent (a més petit el porus, més dificultat de pas). Això ho podem fer servir per discriminar diferents grandàries. A mesura que augmentem la concentració de l’agarosa (o poliacrilamida), més petits seran els porus, i amb més precisió separarem fragments petits, que en casos de porus grans correrien tots els fragments a la mateixa velocitat.
En funció d’això triarem un % o un altre d’agarosa i d’acrilamida.
60 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tot seguit tenim una taula amb la correspondència entre la mida dels fragments que podem separar en funció de la concentració d’agarosa/poliacrilamida del gel: Amb porus grans (% baix d’agarosa/poliacrilamida) les bandes són més clares. A mesura que els porus es van fent petits (augmentem la concentració), el recorregut de les molècules és menor, així com la distància entre les bandes. Els porus grans s’utilitzen per treballar amb fragments grans i viceversa.
Nosaltres hem de triar la concentració que ens permeti distingir bé aquelles bandes que ens proporcionin informació rellevant pel nostre estudi.
61 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En els RNAs podem diferenciar clarament dues bandes; corresponen a les bandes de les subunitats ribosòmiques.
Aquestes subunitats són molt abundants, això dóna claredat a les bandes. A més, la banda de la subunitat 28S és aproximadament el doble d’intensa que la del 18S; això vol dir que tenim un RNA en bones condicions. Si en aquests carrils veiéssim bandes difuses voldria dir que el material està degradat.
També podem veure que hi ha RNA degradat a la part inferior; això afavorirà l’aparició de més bandes de DNA genòmic (DNA contaminant) a la part superior. Finalment també veiem els carrils dels marcadors emprats, un carril de material degradat i un corresponent a un RNA intacte (es veuen les dues bandes diferenciades i prou).
Si obtenim molt material contaminant a la part superior, s’ha de repetir l’extracció de RNA.
En els DNAs, el material genòmic queda a la part superior i a la part inferior. Si obtenim un carril difuminat, el DNA estarà contaminat. En la imatge següent podem distingir 4 carrils difuminats (4 mostres de DNA degradat) i un on es diferencien bé les bandes (DNA intacte).
L’inconvenient de les tècniques de Southern i Northern és que requereixen molt de temps (una setmana). Per tal que siguin eficients, s’ha de controlar molt cada pas. Sempre és millor optar per altres tècniques.
Quan extraiem el DNA comprovem si és íntegre i no està contaminat. En cas afirmatiu, el digerim. En el cas de les molècules de RNA, es degraden amb més facilitat que les de DNA, perquè hi ha moltes RNAses. És per això que abans de procedir a la seva digestió hem d’eliminar totes les molècules que ens facin l’anàlisi més difícil; hem de poder detectar i eliminar tot el que no sigui RNA. Sempre és millor treballar amb materials d’un sol ús per evitar problemes de contaminació.
Transferència i fixació Quan transferim el gel de l’electroforesi a una membrana més rígida, normalment de Nylon, hem de fixar el gel. Un cop fixat, incubarem i farem les hibridacions de mostra amb la sonda desnaturalitzada.
62 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Hibridació Per que tingui lloc la hibridació, el que fem és disminuir la severitat. Si recordem, les sondes les hem desnaturalitzat en condicions d’alta severitat (augmentant la temperatura); ara el que farem doncs serà baixar la temperatura.
Modulant condicions com el pH, la força iònica, la concentració salina i la temperatura és com podem controlar la hibridació.
Normalment és fa baixant la temperatura que s’havia augmentat per desnaturalitzar la sonda, doncs així ja s’aconsegueix la hibridació, però també es pot fer a partir de modular la força iònica (augmentant la salinitat) o el pH (aconseguir un pH més àcid). En funció del que estiguem analitzant, les condicions òptimes seran unes o altres.
Si baixem massa la severitat, podem tenir molt soroll de fons, que es traduiria a bandes poc definides; observarem moltes marques perquè la sonda haurà hibridat de forma inespecífica.
En canvi si apliquem condicions d’alta severitat aconseguirem bandes molt més definides (tot i el possible soroll de fons).
Rentats Un cop mostra i sonda han aparellat, es fan una sèrie de rentats per eliminar les restes de sonda que no s’han unit específicament a les seqüències de DNA complementàries. Per fer els rentats el que fem és tornar a augmentar la severitat; a cada rentat, anirà augmentant el grau de severitat.
Les condicions de severitat en què es fan les hibridacions i els rentats són bàsiques per uns bons resultats. En els rentats és més senzill jugar amb la severitat que en la hibridació, ja que podem anar augmentant la severitat.
Si els rentats no es fan bé també ens podem trobar amb soroll de fons; si no hem augmentat prou la salinitat, els rentats potser no són prou severs com per eliminar tot el material que hagi hibridat de forma inespecífica. Tot i que la hibridació estigui feta en bones condicions, poden aparèixer bandes inespecífiques si no s’han anat amb els rentats.
63 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Normalment es fan entre dos i quatre rentats, en els quals les condicions de severitat van incrementant. Si tot això es fa correctament podrem arribar a aconseguir unes bandes molt ben marcades sense soroll de fons.
Els rentats són quasi més importants que les hibridacions, ja que amb ells podem mirar de corregir el que no hagi quedat prou bé amb la hibridació.
A més, amb els rentats podem deshibridar del tot una sonda i tornar a hibridar amb una altra en la mateixa membrana; deshibridem la sonda que hem utilitzat al principi, fem rentats successius per eliminar les restes d’aquesta primera sonda, i rehibridem amb una de nova.
D’aquesta manera es poden fer diferents anàlisis utilitzant la mateixa membrana.
Aquest procediment de deshibridació s’ha de realitzar en membranes de niló perquè les membranes de nitrocel·lulosa són massa dèbils i els rentats severs les malmeten.
Els rentats determinen la qualitat final dels resultats; si observem resultats que presenten moltes inespecificitats, haurem de fer rentats augmentant més la severitat.
Detecció El mètode de detecció que triem anirà en funció d’allò que vulguem detectar.
64 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Els diferents mètodes de detecció són: - Radioactivitat. En aquest cas el marcatge és directe.
No radioactivitat. En aquest cas la detecció és indirecta. Incubarem una sèrie de components i ho combinarem amb rentats per eliminar la resta de molècules de detecció o marcatge no unides.
o Quimioluminiscència.
o Cromogènia.
Els mètodes de detecció per radioactivitat són molt més sensibles que els no radioactius. El marcatge no radioactiu en bones condicions arriben als 60fg (filtrat glomerular). La radioactivitat arriba als 10fg.
En conclusió, les sondes ens permeten: - Identificar.
Localitzar.
Quantificar.
...una proteïna, un RNA o una seqüència concreta de DNA.
Amb les tècniques de blotting, detectem la presència o absència de la banda, però no el lloc on es troba la seqüència dins de l’estructura cel·lular, ja que les mostres no es desestructuen.
En aquestes tècniques partim dels components (àcids nucleics i proteïnes). Així doncs, pdorem detectar variacions en les seqüències i quantificar-les (conèixer l’abundància relativa d’aquella seqüència en la mostra); ens permeten determinar la presència/absència de DNA, RNA o proteïnes.
65 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Ens serveixen per dir que “què hi ha” però no “on hi ha”. Per saber on es troben hauríem de realitzar una hibridació in situ. Les tècniques de blotting únicament serveixen com a anàlisis moleculars, doncs treballen amb molècules completament aïllades.
Com sabem, hi ha diferents tipus de blotting. Nosaltres hem vist el Southern, que treballa amb DNA, i permet determinar la distància entre dues dianes de restricció del gen d’interès, com també detectar variacions en aquestes dianes o en el fragment comprès entre les dues dianes. Ara veurem també el Northern Blot i el Western Blot.
BLOTTING – Identificació i quantificació Northern blot Les tècniques de Northern blot ens permeten determinar canvis en la quantitat i grandària dels RNA. En aquest cas el RNA no es digereix, sinó que s’analitza la molècula completa.
Canvis en grandària Comencem per aïllar el RNA en condicions intactes. Això ens permetrà determinar la grandària del RNA. En funció del recorregut electroforètic, podem determinar: variants d’splicing (hi ha canvis en la posició de les bandes); si s’ha escindit un intró o no (el fragment de RNA que trobarem més o menys gran i es pot identificar en funció de la posició de la banda).
Canvis quantitatius Això es fa analitzant la intensitat de la banda en diversos temps. En tenim diversos exemples.
Inhibició de GAL1 mitjançant glucosa En aquest cas, s’estudia la repressió de la glucosa sobre l’expressió del gen GAL1 en Saccharomyces cerevisiae a partir de la intensitat de la banda que correspon al gen en qüestió.
A mesura que s’afegeix glucosa, el nivell d’expressió de GAL1 disminueix, ja que la glucosa actua com a repressor. Detectem una menor quantitat del mRNA del gen GAL1 (la intensitat de la banda disminueix).
66 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Síndrome de l’X fràgil en diferents teixits En aquest cas, comparem la banda obtinguda de la mostra del cor amb altres teixits per poder afirmar on és major l’expressió del mRNA del gen causant de la síndrome de l’X fràgil, el gen FMR1.
Tenim una mostra on s’utilitza una sonda de cDNA marcada a nivell del gen FMR1. Els nivells més alts es detecten en el cervell i en els testicles (les bandes, de 4,4 Kb, són més intenses).
L’expressió és més baixa en la placenta, el pulmó i el ronyó.
Trobem múltiples transcrits més petits al cor (1,4 Kb). Per tant és un mRNA que pot produir diferents bandes; això és conseqüència d’un splicing alternatiu.
Controls Ara bé, no podem assegurar res d’això sense l’ús de controls. L’eficàcia de l’extracció de RNA en un teixit o un altre pot variar; és molt difícil aïllar RNA de la mateixa manera i en les mateixes condicions i quantitats en teixits diferents. Per això, farem servir controls, que seran majoritàriament sondes per un transcrit d’un gen constitucional que s’expressi igual en tots els teixits. Així ens assegurem tenir la mateixa intensitat a cada carril, independentment del teixit.
La quantitat de mostra que carreguem als carrils també pot variar; necessitem un control intern per tal que la quantitat en els carrils sigui la mateixa. Així, si hi ha un carril més intens, podrem discriminar i sabrem que no serà per la quantitat de RNA total, sinó per que hi haurà més quantitat d’aquest RNA en concret.
En l’estudi de la imatge tenim el Northern blot que es va dur a terme per determinar l’efecte de les citosines sobre l’expressió d’un gen en cervell de ratolí, acompanyat de la fotografia que correspon als gels utilitzats per fer les separacions electroforètiques (el gel del blotting). Les diferències en les intensitats de les bandes del Northern indiquen diferències en el nivell d’expressió. Així doncs, podem utilitzar la mateixa fotografia que tenim de les separacions electroforètiques d’aquests RNAs; si la intensitat de la senyal de tots els carrils és semblant, es transfereix l’RNA al filtre, i es procedeix a la hibridació i la detecció. Si la quantitat de RNA que hi ha en tots els carrils és equivalent, ens podem fiar d’aquest senyal.
67 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En el Northern blot s’utilitzen sondes de gens constitutius com ara: - GAPDH β – actina β2 – microglobulina Increments corregits Ens podem trobar casos on tenim un gen control i un gen estudiat i que a l’hora de mesurar la intensitat de les bandes, la intensitat del gen estudiat és més gran que la del gen control de referència.
Per exemple: en l’electroforesi que veiem tot seguit, la banda del gen estudiat surt 10X més intensa en la mostra. En aquests casos hem de corregir l’increment per tal de determinar l’abundància relativa de l’expressió d’aquest gen. En aquestes situacions el que fem és observar la intensitat d’aquests dos gens en una mostra control. En la mostra control, el gen control s’expressa el doble que el gen mostra (2X). Això vol dir que el gen en la mostra s’expressa cinc cops més que en els casos “normals”.
Increment corregit = 10/2 = 5 Els controls són molt importants a l’hora de donar per vàlids els estudis.
Això en realitat és un Western blot, però com porta marejant amb els diferents blots 50465 classes, ja no ve d’aquí.
68 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Detecció de transgènics També podem aplicar aquestes tècniques per determinar la presència d’un transgènic en un ratolí. En els estudis en què inserim gens en els ratolins (transgens), el que és interessant és saber si s’ha inserit correctament, quantes còpies hi ha, si s’expressa, etc. Tots aquests interrogants els resolem fent una detecció mitjançant tècniques de blotting.
El DNA del ratolí a partir del qual es fa la detecció és la cua (se li talla). S’ha de tenir suficient DNA per poder realitzar un Southern blot. Mitjançant l’ús de sondes específiques pel gen modificat (transgen), podem determinar si el ratolí el conté o no (si s’ha inserit en el seu genoma). Si la sonda hibrida, voldrà dir que el transgen està present en el DNA del ratolí.
Si hi ha múltiples còpies del transgen, es veuran silenciades totes per metilació, de manera que el transgen no s’expressarà.
En aquesta imatge, tenim un estudi on es van digerir 10 micrograms (10 per carril de DNA) de la cua del ratolí amb BamHI i EcoRI. A continuació es va fer una electroforesi en 1,2% d'agarosa, i es van transferir per capil·laritat alcalina a una sonda Hybond N +. La mostra transferida va hibridar amb la sonda marcada del transgen.
A la imatge veiem bandes a 6 i 5 Kb a cada carril. Després hi ha una banda, que és la del transgen, que apareix als 2 kb, en els 4 darrers carrils. Aquests quatre darrers carrils corresponen a ratolins als quals se’ls ha subministrat la mostra en major o menor quantitat de transgen (en diferent número de còpies). Un presenta 1 còpia (0X), i els altres 6 (1X), 16 (5X) i 60 (10X). Hi ha variabilitat en la intensitat de les bandes (s’ha utilitzat un marcatge radioactiu).
També tenim dos carrils de control, que contenen mostres de DNA de ratolins que ja s’havien obtingut prèviament amb una còpia del transgen (s’usen com a carrils de referència).
Per tant, identifiquem quatre nous ratolins transgènics en aquesta transferència de Southern; 4 de cada 30 ratolins examinats (13%) eren transgènics.
69 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Si haguéssim fet servir marcatge per precipitat de color, només observaríem presència o absència. Per quantificar, necessitem una tècnica que permeti detectar amb precisió el número de còpies present a la mostra. La millor manera de fer-ho és amb el marcatge radioactiu.
Una manera de comprovar si s’expressen o no els transgens és fent un Western blot, amb el qual s’analitza si expressen o no els transgens que hem introduït.
En la següent imatge tenim un exemple de Western on es comprova a nivell dels diferents teixits del ratolí si s’expressen o no els elements del transgen inserit. Hi ha proves que permeten detectar-ho sense necessitat de sacrificar el ratolí.
En aquesta darrera imatge, tenim un ratolí verd i un ratolí blau. Hem inserit el transgen als dos ratolins. El ratolí verd expressa el transgen, en canvi el blau, que és el seu germà, no.
70 ...