Práctica II (2016)

Pràctica Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 2º curso
Asignatura Bioquimica Metabolica
Año del apunte 2016
Páginas 8
Fecha de subida 17/06/2017
Descargas 5
Subido por

Vista previa del texto

-DEPARTAMENT DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR- QÜESTIONARI (PRÀCTICA II) PRÀCTIQUES DE BIOQUÍMICA METABÒLICA GRAU DE NANOTECNOLOGIA Curs 2016-17 Nom: Sara Arias i Pau Brunet Grup de pràctiques: 1 Bioquímica metabòlica 2016 1. La mesura de l’activitat de la piruvat quinasa de múscul de rata es realitza per espectrofotometria a 340 nm. Raonar la presència de tots els components presents a les barreges de reacció. Descriure les reaccions que hi tenen lloc. Les reaccions que hi tenen lloc són les següents: PEP + ADP !"#$%&' )$"*&+& Piruvat + NADH Piruvat + ATP ,&-'&' ./+0".#12/*&+& Lactat + NAD+ Com podem observar, per mesurar la activitat de la piruvat quinasa, es requereix d’una segona reacció, més ràpida, que degradi NADH al la vegada que es genera piruvat (relació estequiomètrica 1:1). Així doncs, si podem mesurar amb l’espectrofotòmetre la degradació de NADH, podrem observar també la aparició de piruvat i, conseqüentment, la activitat de l’enzim piruvat quinasa. La presència de PEP, ADP i piruvat quinasa resulta evident per mesurar la activitat d’aquest enzim, mentre que el NADH i l’enzim lactat deshidrogenasa s’afegeix per crear la segona reacció, amb la qual podrem mesurar l’aparició del piruvat, fent-lo reaccionar amb NADH i mesurant la desaparició d’aquesta molècula. 2. Representació de les gràfiques en les que s’obtenen les activitats PK de múscul i fetge a les concentracions determinades pel teu grup de pràctiques. Representar les velocitats en unitats d’absorbància a 340 nm/min.mL de barreja de reacció. Hem mesurat l’activitat PK del fetge a 0.1mM, 0.2mM i 2mM: ABS [PEP]= 0,1mM (Fetge) 1,73 1,728 Absorbància 1,726 y = -0,0099x + 1,7309 R² = 0,94161 1,724 1,722 1,72 1,718 1,716 1,714 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Temps (min·ml) Bioquímica metabòlica 2016 Absorbància ABS [PEP]= 0,2mM (Fetge) 1,715 1,71 1,705 1,7 1,695 1,69 1,685 1,68 1,675 1,67 y = -0,0288x + 1,7195 R² = 0,9868 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Temps (min·mL) ABS [PEP]= 2mM (Fetge) Absorbància 2 y = -0,5729x + 1,7161 R² = 0,99998 1,5 1 0,5 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Temps (min·mL) Hem mesurat l’activitat PK de múscul a 0.025mM, 0.1mM i 0.5mM: ABS [PEP]= 0,025mM (Múscul) 1,62 Abdsorbància 1,6 y = -0,0889x + 1,6268 R² = 0,96312 1,58 1,56 1,54 1,52 1,5 1,48 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Temps (min·mL) Bioquímica metabòlica 2016 ABS [PEP]= 0,1mM (Múscul) 1,6 Abdorbància 1,55 y = -0,195x + 1,6093 R² = 0,99924 1,5 1,45 1,4 1,35 1,3 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Temps (min·mL) ABS [PEP]= 0,5mM (Múscul) 1,5 Absorbància 1,45 y = -0,1859x + 1,5135 R² = 0,97107 1,4 1,35 1,3 1,25 1,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Temps (min·mL) 3. Determinació dels paràmetres cinètics dels enzims PK de múscul, indicant les taules [PEP] vs v (nmol NADH/minut.mL de barreja de reacció), posant en comú totes les velocitats obtingudes per tots els grups. El coeficient d’extinció molar del NADH a 340 nm és de 6,2.103 M-1·cm-1. Hem deduït les velocitats en unitats de absorbància partit de temps amb les gràfiques de l’exercici anterior. Sabem que el ritme al que desapareix NADH (el producte) o, el que és el mateix, el ritme al que disminueix l’absorbància, durant els primers instants coincideix amb la velocitat inicial. La velocitat inicial (𝑣4 ( 6789:;8à=>?7 @"* )) per cadascuna dels concentracions serà la pendent de la recta que hem obtingut a l’apartat 2. Bioquímica metabòlica 2016 Per saber la concentració a partir de la absorbància s’usa la llei de Lambert-Beer: 𝐴𝑏𝑠 = 𝑐 · 𝑙 · 𝜀 → 𝑐 = 𝐴𝑏𝑠 𝐴𝑏𝑠 = 𝑙 · 𝜀 6.22 · 10P Transformem l’ 𝜀 als unitats que en tenim de concentració 6,022 S -@·@X Q.RR·S4T ·, @1U·-@ · S4VT @1U S@@1U = I per saber la velocitat en funció de la concentració seguim la mateixa llei; ∆𝐴𝑏𝑠 ∆𝑐 · 𝑙 · 𝜀 ∆𝑐 1 ∆𝐴𝑏𝑠 1 𝑚𝑀 = → = · = · 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑒𝑛𝑡 = 𝑣0 ( ) 𝑡 𝑡 𝑡 𝑙·𝜀 𝑡 6.22 𝑚𝑖𝑛 Taula 1. Velocitats inicials (múscul) [PEP](mM) (1)𝒗𝟎 ( 0,02 0,025 0,05 0,075 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 𝑼𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃à𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒎𝒊𝒏 ) 0,0536 0,1324 0,1384 0,198 0,1948 0,2588 0,242 0,3068 0,26 0,3692 (2)𝒗𝟎 ( 𝑼𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃à𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒎𝒊𝒏 0,0536 0,0889 0,122 0,2236 0,195 0,2728 0,3064 0,2916 0,1859 0,2376 (Mitja)𝒗𝟎 ( ) 𝑼𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃à𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒎𝒊𝒏 0,0536 0,11065 0,1302 0,2108 0,1949 0,2658 0,2742 0,2992 0,22295 0,3034 ) Mitja 𝒗𝟎 ( 𝒎𝑴 𝒎𝒊𝒏 ) 8,61736E-09 1,77894E-08 2,09325E-08 3,38907E-08 3,13344E-08 4,27331E-08 4,40836E-08 4,81029E-08 3,58441E-08 4,87781E-08 Corba cinética múscul 0,00006 V(mM/min) 0,00005 0,00004 0,00003 0,00002 0,00001 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 [PEP](mM) Es tracta de una corba hiperbòlica que segueix la cinètica de Michaelis-Menten; 𝑣= o@áq· r st r Amb el Solver a l’Excel es pot determinar el valor dels paràmetres 𝑉𝑚á𝑥 i 𝐾@ . 𝑣@&q = 4,543 · 10{| 𝑚𝑀/𝑚𝑖𝑛 Bioquímica metabòlica 2016 𝐾@ = 4,011 𝑚𝑀 4. Estimació de la S0.5 i la Vmax de la PK de fetge amb la corba obtinguda posant en comú totes les velocitats obtingudes per tots els grups. Repetim el mateix procediment que amb el múscul Taula 2. Velocitats inicials (fetge) 𝑼𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃à𝒏𝒄𝒊𝒂 [PEP](mM) (1)𝒗𝟎 ( 0,05 0,1 0,2 0,5 0,6 1 1,2 1,6 2 3 0,0156 0,016 0,0648 0,2192 0,2472 0,3952 0,6624 0,624 0,4452 0,59 𝒎𝒊𝒏 (2)𝒗𝟎 ( ) 𝑼𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃à𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒎𝒊𝒏 (Mitja)𝒗𝟎 ( ) 0,0136 0,099 0,0288 0,176 0,262 0,3956 0,6084 0,5036 0,528 0,4648 𝑼𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃à𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒎𝒊𝒏 ) 0,0146 0,0575 0,0468 0,1976 0,2546 0,3954 0,6354 0,5638 0,4866 0,5274 (Prof.)𝒗𝟎 ( 𝑼𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃à𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒎𝒊𝒏 (Prof.)𝒗𝟎 ( ) 0,0085 0,0102 0,03 0,165 0,255 0,45 0,525 0,571 0,574 0,564 𝒎𝑴 𝒎𝒊𝒏 0,001366559 0,001639871 0,004823151 0,026527331 0,040996785 0,072347267 0,084405145 0,091800643 0,092282958 0,090675241 Com que els resultats obtinguts pels grups de pràctiques no eren satisfactoris i donaven una corba hiperbòlica, s’han utilitzat els resultats obtinguts pel professor: V(mM/min) Corba fetge 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 [PEP](mM) Com podem observar a la gràfica, la cinètica que hi ha al fetge és una corba sigmoïdal (cinètica de Hill), llavors segueix l’equació 𝑣 = o@áq· r ~ . Amb Excel utilitzem el r•.€ ~ • r ~ Solver per determinar els paràmetres 𝑣@áq , 𝑠4,| i h. 𝑠4,| = 1,346436919𝑚𝑀 𝑣@áq = 0,150699453𝑚𝑀/𝑚𝑖𝑛 ℎ=1 ) Bioquímica metabòlica 2016 5. Representar la recta de regressió a partir de les mostres de proteïna patró i estimar la concentració de proteïna als homogenats de fetge i múscul. Fer la representació gràfica. Es segueix una relació lineal? Per què? Recta Petró de l'absorbància del Stock BSA 0,6 Absorbància 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 y = 0,0522x + 0,0235 R² = 0,99318 0 0 2 4 6 8 10 12 [Stock BSA] (µg/mL) La recta patró que hem obtingut segueix l’equació 𝐴𝑏𝑠 = 0,0522 · 𝐵𝑆𝐴 + 0,0235 Les absorbàncies del fetge i del múscul mesurats son recogudes a la taula següent. Fetge1/50 (µL) Abs [BSA] (µg/mL) Múscul1/100 (µL) Abs [BSA] (µg/mL) 5 0,132 2,079 20 0,148 2,385 10 0,294 5,182 40 0,302 5,335 La concentració estimada al fetge la calculem aplicant el factor de dilució a la concentració obtinguda a partir de la recta patró; R,4‡ˆµg @, /‹‹/*.1#Œ |,S“Rµg @, /‹‹/*.1#Œ · S@U /‹‹/*.1#Œ · S@, /‹‹/*.1#Œ |•, ."U$-"ó S4•, ."U$-"ó · R4@, ."U$-"ó · R4@, ."U$-"ó S@, Œ/'2/ S@, Œ/'2/ = 8,314 𝜇𝑔 = 10,364 𝑚𝐿 𝜇𝑔 𝑚𝐿 I fent la mijta tenim que la concentració estimada de proteïna al fetge és de 9,339 𝜇𝑔 𝑚𝐿 Fem ho mateix per el múscul; R,P“|µg @, /‹‹/*.1#Œ |,PP|µg @, /‹‹/*.1#Œ · S@, /‹‹/*.1#Œ · S@, /‹‹/*.1#Œ R4•, ."U$-"ó •4•, ."U$-"ó · S44@, ."U$-"ó · S44@, ."U$-"ó S@, @ú+-$U S@, @ú+-$U = 11,925 = 13,338 𝜇𝑔 𝜇𝑔 𝑚𝐿 𝑚𝐿 La concentració estimada de proteïna al múscul és de 12,632 𝜇𝑔 𝑚𝐿 Bioquímica metabòlica 2016 El motiu de que la relació entre absorbància i concentració sigui lineal recau en la llei de Lambert Beer: Abs=𝜀 · 𝑙 · 𝑐, on c si es dibuixa la concentració en funció de l’absorbància o viceversa quedarà una funció de tipus y=mx, donant a lloc una relació lineal entre ambdues quantitats 6. Expressar el nombre d’Unitats de PK per mg de proteïna presents en múscul i fetge de rata i també per g de teixit fresc. Com que el volum de la cubeta és de 1ml; Per el fetge tenim una 𝑣@áq = 0,00303614 𝑚𝑀/𝑚𝑖𝑛 (calculat a l’exercici 4) i hem agafat 2ml d’extracte amb una concentració de 9,339 𝜇𝑔 𝑚𝐿 (calculat a l’exercici 5) L’activitat de la piruvat kinasa és: 1000𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑒 10{P 𝐿 𝑐𝑢𝑏𝑒𝑡𝑎 · 0,003036 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑒 · 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑒 = 3,036 · 10−3 𝑈 𝐿·𝑚𝑖𝑛 3,036 · 10−3 𝑈 50𝑚𝑙 𝑑 œ 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢ï𝑡 1𝑚𝑙 𝑑 œ 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑝𝑢𝑟 𝑈 · = 8,119 œ œ 2𝑚𝑙 𝑑 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑡 1 𝑚𝑙 𝑑 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑝𝑢𝑟 9,339 · 10{P 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒ï𝑛𝑎 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒Ï𝑛𝑎 3,036 · 10−3 𝑈 50𝑚𝑙 𝑑 œ 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢ï𝑡 1𝑚𝑙 𝑑 œ 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑝𝑢𝑟 𝑈 · = 759 œ œ {P 2𝑚𝑙 𝑑 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑡 1 𝑚𝑙 𝑑 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑝𝑢𝑟 0,1 · 10 𝑔 𝑑′𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑔 𝑡𝑒𝑖𝑥𝑖𝑡 Els resultats no tenen sentit i creiem que es degut a un error amb el solver al fer el càlcul dels paràmetres. Per el múscul tenim una 𝑣@&q = 4,543 · 10{| 𝑚𝑀/𝑚𝑖𝑛 (calculat a l’exercici 4) i hem agafat 5ml d’extracte amb una concentració de 12,632 𝜇𝑔 𝑚𝐿 (calculat a l’exercici 5) L’activitat de la piruvat kinasa és: 1000𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑒 10{P 𝐿 𝑐𝑢𝑏𝑒𝑡𝑎 · 4,543 · 10{| 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑒 · 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑒 = 4,543 · 10{| 𝑈 𝐿· 𝑚𝑖𝑛 100𝑚𝑙 𝑑 œ 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢ï𝑡 1𝑚𝑙 𝑑 œ 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑝𝑢𝑟 𝑈 = 0,0719 œ œ {P 5𝑚𝑙 𝑑 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑡 1 𝑚𝑙 𝑑 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑝𝑢𝑟 12,632 · 10 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒ï𝑛𝑎 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒ï𝑛𝑎 4,543 · 10−5 𝑈 · 4,543 · 10−5 𝑈 5𝑚𝑙 𝑑 œ 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑡 · 100𝑚𝑙 𝑑 œ 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢ï𝑡 1𝑚𝑙 𝑑 œ 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑝𝑢𝑟 𝑈 = 9,086 œ {P 1 𝑚𝑙 𝑑 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑝𝑢𝑟 0,1 · 10 𝑔 𝑑′𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑒 𝑔 𝑑𝑒 𝑡𝑒𝑖𝑥𝑖𝑡 ...