Biocatàlisi Tema 5 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biocatàlisi
Año del apunte 2015
Páginas 7
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 14

Vista previa del texto

1 INTRODUCCIÓ: QUÈ SÓN ELS ENZIMS? 2 CLASSIFICACIÓ I NOMENCLATURA DELS ENZIMS.
3 CINÈTICA ENZIMÀTICA (I).
4 CINÈTICA ENZIMÀTICA (II).
5 CINÈTICA ENZIMÀTICA (III).
5.1 LINEALITZACIÓ DE LA HIPÈRBOLE En aquest apartat s’estudien els mètodes que hi ha per linealitzar l’equació de l’hipèrbole. Linealitzar les equacions ens permet obtenir informació sobre els paràmetres cinètics de l’enzim. Per comparar els diferents mètodes de linealització es prendran valors model.
1 Representació de Lineweaver-Burk o dels dobles inversos. Agafem l’equació de Micaelis Menten i la invertim. És la més fàcil i la més utilitzada, però presenta un problema: els punts que en la representació hiperbòlica es veien ben distribuïts aquí no estan bé, no s’ajusten completament a la recta. Els punts d’elevada concentració de S estan molt junts entre ells i els de baixa concentració estan separais i es desvien molt de la linealitat. Els punts de baixa concentració són els que tenen una senyal més feble i tenen una probabilitat més alta d’error.
2 Representació d’Eadie-Hofstee. Aquí els punts s’ajusten més a la linealitat. Com hi arribem? Agafant l’expressió de Micaelis-Menten i multiplicant-la en ambdós costats per Km+[So].
3 Representació de Hanes-Wolff. En aquest cas partim de l’equació de Micaelis-Menten: multipliquem els dos termes per [So]. Així s’aconsegueix que els valors que tinguin més pes sobre la linealitat siguin els de concentració elevada de substrat, al revés que a Lineweaver.
Les diferents representacions lineals presenten desviacions respecte els valors de la Km i la velocitat màxima.
El mètode que es desvia més és el de Lineweaver-Burk, i el que més s’aproxima és el de Hanes-Wolf.
4 Representació Eisenthal-Cornish-Bowden. Partim d’una expressió com la d’Eadie-Hofstee, després dividim entre [So]. Obtinc una expressió de velocitat en funció de concentració de substrat i la puc igualar a 1. Per a cada parella de valors velocitat-substrat hi ha un punt en què coincideixen. Aquest punt ens indica, projectat sobre l’eix d’abscisses, la Km; i projectat sobre l’eix d’ordenades, la velocitat màxima.
5 Equació integrada de Micaelis-Menten: En un sol experiment considerem tota la degradació de S a P. Però per fer-ho, cal que es compleixi un requisit: l’efecte de la concentració de producte sobre la reacció ha de ser despreciabe, és a dir, cal que pel fet de que es formi producte la reacció no es desplaci cap al sentit contrari.
Com ho solucionem això? Imaginem una reacció que dóna com a producte un àcid feble. En les condicions d’assaig, treballo a pH 7 i el pKa de l’àcid és de 4. Per tant de seguida que es formi l’àcid aquest es protonarà.
Aquesta forma ionitzada ja no podrà ser substrat de la reacció! Si assumim que el procés és irreversible, tenim l’expressió de Micaelis-Menten i sabem que la velocitat de la reacció és igual a la desaparició de substrat en un intèrval de temps finit. Agafem les expressions, les igualem, les endrecem i integrem des de So a temps inicial fins a S a temps final. Ara ho expressem en funció de P format. Considerem que la concentració de producte és infinita. Finalment obtenim l’expressió d’una recta, de la qual el pendent és la –Km, l’ordenada en l’origen és la velocitat màxima i el punt d’intersecció en l’eix de les abscisses és vmàx/Km.
5.2 SIGNIFICAT DE LA KM Podem deduir la Km numèricament amb un tractament matemàtic simple: determinem quina és la concentració de substrat a la que tenim la meitat de la velocitat màxima.
1 A partir del valor de la Km també podem conèixer en quin marge de concentració de substrat ens és útil treballar perquè els canvis de concentració de S es tradueixin en canvis en la velocitat. Si treballem a una concentració de substrat massa elevada, la gràfica de Micaelis Menten ens surt una recta, que correspon al valor de la velocitat màxima.
Si volem observar canvis en la velocitat, hem de treballar a concentracions de substrat baixes.
El mínim de S corresponn a 0,01Km; en aquestes condicions la velocitat inicial serà 0,01 respecte la velocitat màxima , és a dir, que tindrà una velocitat molt petita. En el cas contrari trobem què passaria si la concentració de substrat fos elevada: 4Km.
Fent la mateixa aproximació veiem que estem a 4/5 de la velocitat màxima: una velocitat alta, propera a la màxima.
Sabem que per arribar a la velocitat màxima cal treballar a un marge de concentracions d’entre 5 i 10Km. Això em permetrà obtenir el valor d’aquest paràmetre.
2 Una altra consideració respecte la Km és que aquesta és independent de la concentració d’enzim.
3 La tercera consideració és que valors petits de Km indiquen una elevada afinitat de l’enzim pel substrat o, dit en termes més tècnics, una alta tendència a la formació del complex ES.
5.3 SIGNIFICAT DE LA KCAT La kcat és una constant macroscòpica que ens indica la velocitat en la qual el substrat esdevé producte al llarg de la reacció. A diferència de la Km, la velocitat màxima sí que depèn de la concentarció de l’enzim. Quan estem en condicions de saturació (concentració de substrat elevada) tot l’enzim està en forma ES, i en aquestes condicions podem dir que tot l’enzim està formant el complex ES.
A partir de la velocitat màxima podem calcular la kcat. La kcat ens indica el nombre de molècules que són transformades de substrat a producte per unitat de temps i per molècula d’enzim. Kcat també és anomenada nombre de recanvi, i les unitats són de t^-1 en minuts o segons.
La kcat és una constant macroscòpica, és el resultat de la contribució de les constants de diferents etapes. La constant k2 fa referència a un canvi químic del procés: la segona constant k3 és el que anomenem constant de dissociació. Si k3 és molt més petita que k2 vol dir que la kcat serà molt propera a la constant de dissociaciñó del producte. Els enzims que catalitzen més ràpid tenen kcats més grans.
5.4 EFICIÈNCIA CATALÍTICA Tant la Km com la kcat per separat no ens dónen informació sobre el mecanisme del procés. Per determinar l’eficiència d’un enzim cal tenir en compte les dues variables. Això ens porta a definir un paràmetre que anomenem eficiència catalítica o constant d’especificitat d’un enzim per un substrat i és el quocient entre Kcat respecte Km (unitats M^-1seg^-1). Com més gran sigui, més eficient serà l’enzim.
El quocient kcat/Km mai podrà ser més gran que el valor de k1. En enzims molt eficients, el límit d’eficiència ve determinat per la velocitat de col·lisió, directament proporcional a k1 i per tant a la velocitat de formació del complex ES. Els valors de màxima eficiència catalítica són de l’ordre de 10^8 o superior. Aquesta expressió em pot servir, per exemple, si vull comparar un enzim que utilitza dos substrats diferents i vull veure sobre quin dels dos és més eficient la catàlisi.
Treballant a concentracions de substrat baixes i sabent l’eficiència catalítica ens permet comparar com catalitza aquest la mateixa reacció sobre dos substrat diferents, i veure sobre quin dels dos és més eficient la catàlisi. Com que treballar a concentracions de substrat molt baixes és difícil, hi ha una altra aproximació que consisteix en treballar amb la mateixa concentració dels dos substrats sobre una mateixa concentració d’enzim. Obtindrem una relació de les dues velocitats que ens permetrà discriminar quin dels dos substrats és millor per aquell enzim.
5.5 QUÈ PASSA QUAN TENIM UN SISTEMA REVERSIBLE? Posem un exemple fisiològic: síntesi d’RNA. La RNA polimerasa condensa nucleòtids trifosfat entre ells i s’allibera pirofosfat. Per evitar que la reacció torni enrere i que el polímer es trenqui, el sistema té incorporada una activitat pirofosfatasa que hidrolitza el pirofosfat en dos fosfats inorgànics, i així la reacció ja no és reversible i es produeix sempre en el sentit de síntesi de RNA.
1 Considerem la reversió de la reacció en la primera i també en la segona etapa.
2 Considerem estat estacionari, perquè se’ns compleixi que el canvi d’ES en el temps és 0.
3 La única variació respecte el procediment que hem vist anteriorment és que incorporem l’efecte de la conversió des d’E+P. Obtenim una expressió per a la concentració d’ES.
4 Obtenim una expressió en funció de la concentració d’enzim. També podem expressar l’equació de la velocitat en funció de la formació de producte.
5 Dividim els dos termes per la concentració d’enzim total 6 Substituïm ES per l’expressió que hem deduït al pas 4 7 Transformacions algebraiques. Obtenim l’expressió de la velocitat en funció de la concentració de substrat, concentració d’enzim inicial i de les 4 constants.
8 Substitueixo a l’expressió les relacions de constants microscòpiques per les constants macroscòpiques.
9 Ara tenim la velocitat de la reacció a una concentració de substrat expressada com un sistema reversible on tinc en compte la concentració de producte del medi i les constants de velocitat corresponents. És una expressió més general que la de Micaelis-menten, de fet si considerem que [P] és 0 en aquesta equació em queda l’expressió de Micaelis-menten que hem deduït al principi del tema. Si treballem a concentracions de Substrat=0, em queda l’expressió de Micaelis-menten però en funció del producte.
Si analitzem la cinètica només en presència de substrat i a condicions de velocitat incial obtindrem la velocitat màxima i la Km per al substrat; si fem l’estudi en presència de producte obtindrem els mateixos paràmetres però lògicament per al producte. A partir d’aquesta expressió podem quantificar les 4 constants del sistema: k1, k-1, k2 i k-2. A partir de la velocitat màxima en presència de substrat puc conèixer la k2 i a partir de la velocitat màxima en presència de producte podrem conèixer la k1. I a partir d’aquestes, tota la resta.
5.6 RELACIÓ DE BRIGGS-HALDANE.
Tota aquesta transformació que hem fet ens permet obtenir les constants microscòpiques del procés, a partir de constants macroscòpiques que són la velocitat màxima i la Km. A partir dels resultats, puc deduïr la Keq de la reacció, que és la relació entre la concentració de producte respecte la de substrat.
1 Per calcular la Keq torno a l’expressió que hem fet anteriorment. A l’equació de la reacció la velocitat és 0.
Per tant igualo aquesta expressió a 0 i reordeno.* 2 Podem expressar la Keq en termes de les constants microscòpiques.
3 I substituïr-les per donar una expressió en termes de velocitat màxima i Km.
Nota*: Quan analitzem l’expressió de la velocitat veiem que en presència d’una quantitat de producte la velocitat sempre serà inferior a la que tindriem en la seva absència.
...