Tecniques d'enriquimenr i aïllament de microorganismes en ambients aquàtics (2008)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Ciencias Ambientales - 1º curso
Asignatura Biologia
Año del apunte 2008
Páginas 5
Fecha de subida 25/05/2014
Descargas 0

Vista previa del texto

TÈCNIQUES D’ENRIQUIMENT I AÏLLAMENT DE MICROORGANISMES.
AMBIENTS AQUÀTICS 1.- Importància i significat d’un cultiu axènic o pur: Un cultiu axènic o pur es caracteritza per contenir una única classe de microorganisme.
Aquest tipus de cultius s’aconsegueixen mitjançant tècniques d’aïllament.
Els cultius axènics o purs es poden obtenir de moltes maneres a partir d’un enriquiment; els mètodes més emprats són principalment la sembra per estries en superfície i la sembra en profunditat o tubs d’agar.
Un cop s’ha obtingut un cultiu axènic cal fer-lo créixer. L’objectiu final és obtenir múltiples clons (rèpliques exactes) del microorganisme original per poder formar colònies. És a dir, grans quantitats de cèl·lules que en facilitin l’estudi al laboratori, principalment, per la recerca de noves aplicacions en l’àmbit de la indústria farmacèutica i alimentària i, per l’elaboració de les aplicacions ja existents en aquests camps.
2.- Mètode d’enriquiment: El mètode d’enriquiment té com objectiu incrementar la població d’un determinat grup de microorganismes, mitjançant l’ús de medis de cultiu específics i condicions d’incubació que siguin favorables pel creixement d’un sol tipus o grup de microorganismes relacionats fisiològicament.
Aquest mètode és el primer pas per aconseguir aïllar una determinada espècie de microorganismes i, així, poder obtenir un cultiu axènic o pur.
3.- Tècniques d’aïllament: 3.1 Sembra per estries: El mètode més fàcil i més habitual per obtenir un cultiu axènic és el mètode per “estria en placa”. Se submergeix una nansa d’inoculació esterilitzada en un cultiu mixt i es dibuixen estries per la superfície del medi de cultiu sòlid amb agar en una placa de petri. A mesura que la nansa descriu una ziga-zaga, es dipositen menys microorganismes a la superfície. Aleshores, es torna a esterilitzar la nansa a la flama, es torna a tocar la darrera regió estriada i se segueixen dibuixant noves estries a una zona fresca i estèril de la superfície. En repetir aquest procés diverses vegades les cèl·lules individuals poden separar-se .
Figura 1: Placa de petri. Sembra per estries.
Aleshores les plaques s’incuben, fins que s’han multiplicat molts cop i han creat colònies visibles. Tot hi que cada colònia segurament representa un clon originat d’una sola cèl·lula, no en podem tenir la seguretat. És possible que s’hagin dipositat 2 cèl·lules prou juntes i que hagin donat lloc a una colònia mixta. Per tan, per estar segurs que s’ha obtingut un cultiu axènic, es repeteix el procediment començant per una colònia aïllada de la primera placa. Les colònies aïllades que creixen aquest segon cop són, gairebé segur, cultius axènics.
3.2 Sembra per tubs d’agar: El mètode “sembra en profunditat” consisteix en la dilució d’un cultiu mixta en tubs d’agar fos; quan l’agar solidifica, les colònies es desenvolupen submergides en el tub d’agar en comptes de la superfície, com succeeix en la sembra per estries en placa. És un mètode de gran utilitat per purificar determinats tipus de microorganismes anaeròbics, per exemple, les bactèries fototròpiques del sofre i sulfat reductores de la columna de Winogradsky. Es possible obtenir cultius axènics mitjançant dilucions successives d’una suspensió de cèl·lules en tubs d’agar fos. A partir d’una colònia que ha crescut en el tub de major dilució utilitzada com inòcul, es pot tornar a fer un altre banc de dilucions, de tal manera que s’acabi obtenint un cultiu axènic.
Amb independència del mètode utilitzat per purificar el cultiu, una vegada obtingut un suposat cultiu axènic és essencial comprovar la seva puresa. S’utilitza per aquest fi, una combinació de tècniques microscòpiques, observació de les característiques de la colònia en plaques, o en sembres en profunditat amb tub, i comprovació del creixement en mitjans on el microorganisme que ens interessa aïllar creix molt poc però que afavoreixen el creixement dels microorganismes que els acompanyen.
L’observació microscòpica d’un sol tipus morfològic de la cèl·lula, juntament amb unes característiques uniformes de la colònia i amb absència de contaminació amb test amb diversos mitjans de cultiu es podria prendre com a prova de què un cultiu és axènic.
4.- Columna de Winogradsky: La columna de Winogradsky s’ha utilitzat de forma tradicional per a aïllar bacteris fototròfics vermells i verds, entre d’altres anaerobis. Té el nom del microbiòleg que la va dissenyar al 1880 per a estudiar els bacteris del sòl. És un ecosistema anaeròbic en miniatura que pot ser una reserva de tot tipus de procariotes que intervenen en el cicle dels nutrients.
Està formada per un cilindre de cristall i els passos a seguir per a fer-la són els següents: 1. Omplir més o menys la tercera part del cilindre amb llot ric en matèria orgànica i, si pot ser, sulfur.
2. Barrejar els substrats de carboni (paper de diari, serradures, fullaraca, algun animal mort, arrels, etc.) amb el llot. Així, el llot rep un suplement de CaCO 3 i CaSO4 que actua com a tampó i font de sulfat respectivament.
3. Apretar la barreja dins del recipient evitant que quedin bombolles d’aire.
4. Cobrir el llot amb aigua mineral i es tapa el cilindre amb una fulla d’alumini.
5. Finalment s’ha de col·locar la columna al costat d’una finestra orientada al nord per tal que rebi llum solar (vigilant que no en rebi en excés) i esperar unes setmanes a que creixin els microorganismes al seu interior.
A la columna s’hi desenvolupen diferents tipus de microorganismes on els que es troben més avall utilitzen el rebuig dels que es troben a zones superiors per al seu propi metabolisme. Els cianobacteris i les algues creixen ràpidament a la part superior i alliberen oxigen creant la zona aeròbica. La zona més baixa de la columna és molt rica en SH2 i apareixen diferents grups de bacteris: Figura 3: Columna de Winogradsky Figura 4: Columna de Winogradsky En condicions estrictament anaeròbiques apareixen bacteris del gènere Clostridium sp.
que degraden la cel·lulosa aportada a glucosa i, aquesta, a d’altres compostos orgànics simples. Tot i que les espores poden sobreviure a condicions aeròbiques, la cèl·lula vegetativa mor amb oxigen i per això no comencen a créixer fins que desapareix totalment del sediment.
- Una mica per sobre apareixen els bacteris reductors del sofre que formen una capa negra. Utilitzen els subproductes de la fermentació generant grans quantitats de SH 2, que reacciona amb qualsevol ferro formant sulfur ferrós, de color negre. Una part del SH2 puja a les capes superiors.
- Per sobre es formen dues capes colorejades de color verd (bacteris verds del sofre) i púrpura (bacteris púrpura del sofre), que són menys tolerants al sofre.
- Acabant amb la zona anaeròbica hi ha una altra zona formada per bacteris púrpura, però no del sofre.
La columna de Winogradsky s’ha utilitzat com a medi d’enriquiment de procariotes aeròbics i anaeròbics. Els principals avantatges de la columna són la fàcil disponibilitat de diferents cultius d’enriquiment i la possibilitat d’afegir qualsevol compost del qual se’n vulgui estudiar la degradació i després seleccionar un o més dels microorganismes que duen a terme la degradació. A més a més, la columna és molt més semblant a la natura que els medis de cultiu i, per tant, es poden observar més tipus fisiològics de microorganismes que en els cultius consistents en un medi líquid al qual s’introdueix directament la mostra natural.
5.- Els microorganismes en el ambients aquàtics: La hidrosfera, és a dir, l’aigua a La Terra és una capa discontínua i la trobem distribuïda en oceànica (97,2%) i no oceànica (2,8%). Aquest 2,8% d’aigua no oceànica es divideix entre els glacials (2,15%), aigües continentals (0,62%) i el 0,24% restants es divideix en l’atmosfera (0,001%), torrents i rieres (0,0001%), llacs (0,17%) i aigües subterrànies (0,005%).
5.1.- Activitat dels microorganismes en ambients aquàtics L’activitat al medi aquàtic depèn dels productors primaris, és a dir, els organismes fotosintètics (algues i cianobacteris), que formen les zones òxiques a la part més superficial dels ecosistemes aquàtics, on hi arriba la llum necessària per a la seva activitat. Les algues que es troben en suspensió a la zona més superficial formen el fitoplàncton. En aigües poc profundes, on la llum arriba fins al fons, també trobem algues i s’anomenen algues bentòniques. Aquests organismes, a més de generar l’oxigen necessari per l’ecosistema, poden modificar caràcters físics de l’aigua com la temperatura, el pH...
A les zones més profundes, on no hi arriba la llum del Sol, no hi trobem organismes fotosintètics i són anòxiques (sense oxigen) i hi habiten bacteris anoxigènics (no necessiten l’oxigen).
Els hàbitats marins tenen una producció primària molt baixa degut a què la concentració de nutrients és molt baixa i no permet un gran desenvolupament de productors primaris. Tot i així, hi ha zones a mar obert que són fèrtils. Són zones on els vents o els corrents marines produeixen una gran mobilització de nutrients de les zones profundes cap a les aigües superficials. També pot ser que rebin una gran aportació de nutrients per part de rius.
A les zones costaneres, en canvi, la producció sol ser sempre molt elevada, ja que tenen importants aports de nutrients i hi proliferen els productors primaris.
5.2.- L’oxigen als llacs i rius: L’oxigen és molt abundant a l’atmosfera però té una solubilitat limitada en l’aigua i el intercanvi entre l’atmosfera i l’aigua és lent. La gran producció d’oxigen a les capes superficials no consumeix tota la matèria orgànica disponible i la que resta precipita al fons i és descomposta pels microorganismes facultatius (el seu metabolisme no requereix necessàriament la presència d’oxigen dissolt a l’aigua). Un cop consumit l’oxigen del fons pels descomponedors (el seu metabolisme es basa en la fermentació en comptes de la respiració), aquesta zona passa a ser anòxica i, per tant, els organismes aerobis estrictes no s’hi poden desenvolupar i es crea una diferenciació d’espècies entre la superfície i el fons.
La presència d’oxigen en aquests ecosistemes depèn de la quantitat de matèria orgànica disponible i de la velocitat d’intercanvi d’oxigen entre les capes superficials i les profundes.
A l’estiu, l’aigua dels llacs s’estratifica segons la temperatura degut a l’absència de pluges que fa que l’aigua no es renovi ni es remogui. La temperatura és més alta a menys profunditat, fins que arriba una profunditat en la qual la temperatura gairebé no puja tot i que disminueixi la profunditat, és adir, es manté estable.
Al hivern, la temperatura es manté baixa i constant, ja que hi ha una capa superficial de gel que actua com a aïllant tèrmic. La temperatura només és més baixa a la capa de gel i a la immediatament inferior a aquesta.
5.3.- La Demanda Bioquímica d’Oxigen (DBO): El DBO, la demanda bioquímica d’oxigen, és la capacitat de consumir oxigen d’una massa d’aigua. Per determinar-la s’han de seguir uns passos: 1. Prendre una mostra d’aigua i airejar-la.
2. Ficar la mostra en un recipient i segellar-lo 3. Incubar-la generalment 5 dies a 20ºC a les fosques perquè el microorganismes fotosintètics no produeixin oxigen.
4. Determinació de l’oxigen al principi i al final de la incubació.
La DBO és la diferencia entre la concentració d’oxigen inicial i la concentració d’oxigen desprès d’incubar la mostra d’aigua en les condicions anteriors. Si la DBO té un valor molt elevat vol dir que els microorganismes han consumit molt d’oxigen i que l’aigua conté molta matèria orgànica, és dir, està molt contaminada.
La DBO ens indica de forma indirecta la quantitat de matèria orgànica que hi ha a l’aigua i que pot ser oxidada pels microorganismes. Les autoritats regulen el DBO per a aigües residuals que s’aboquin a rius o llacs, ja que un excés de matèria indica que l’aigua està contaminada.
...