Tema 4 (2013)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Tècniques Instrumentals Avançades
Año del apunte 2013
Páginas 16
Fecha de subida 17/10/2014
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María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA Y SU INTERACCIÓN CON LA MATERIA La radiación electromagnética son ondas que se propagan en el espacio con un componente eléctrico y uno magnético, actuando como fase entre ellos. La radiación electromagnética se clasifica según la frecuencia de su onda, y se basan en la interacción de la energía electromagnética con la materia. Se pasan transiciones, diferentes estados energéticos de los electrones de la materia, que transmiten energía y ésta se detecta.
La energía interna de las moléculas depende de:  La energía de los electrones en el campo electrostático del núcleo  Los niveles vibracionales de un núcleo atómico a otros unidos por un enlace  Los niveles rotacionales de la molécula considerada como un todo Se encuentran las siguientes técnicas espectroscópicas, las cuales todas tienen que ver con cada una de las transacciones que se dan en las moléculas: 1.
2.
3.
Espectro de absorción (luz visible o UV): Estudia la energía interna de los electrones en el campo electrostático del núcleo Espectroscopia de infrarrojos: Permite ver estructuras secundarias a partir de transacciones de tipo vibracional que afectan los enlaces Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR): induce transposiciones en los spines de los átomos Se pueden inducir transposiciones entre los niveles electrónicos con radiación electromagnética, donde deben coincidir la energía de la radiación y la diferencia de energías entre los dos niveles electrónicos.
E  h·  h·c·w  h·c· 1  ; Donde: v es la frecuencia.
ω es el número de ondas.
La fórmula nos da λ a la cual podemos inducir la transición entre estados energéticos. No todas las transiciones son posibles aunque se cumpla la ley, por tanto esta ley nos da la condición para que se dé. En el caso del espectro de adsorción depende de la diferencia de dos niveles y se debe a la zona del visible (pequeña) o del ultravioleta (grande). Si es muy grande se trabaja en una zona que se encuentra entre el ultravioleta y el rayo X y esto es posible gracias al sincrotrón.
1 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN La espectroscopia de absorción se refiere a una variedad de técnicas que emplean la interacción de la radiación electromagnética con la materia, comparando la intensidad de un haz de luz medida antes y después de la interacción con una muestra. Básicamente se excitan los electrones para que, al bajar a su estado basal, emitan una radiación detectada por un instrumento concreto. Por lo tanto, interesa conocer la absorción de la  para hacer pasar el electrón de un estado fundamental a un excitado. La distancia entre dos niveles, es igualmente la  que hay que aplicar para realizar la transición. Se mueve dentro de una variedad de longitudes de onda, como en la espectroscopia infrarroja, ultravioletavisible, etc.
Ley de Lambert-Beer La absorbancia es la relación entre la intensidad de luz que entra en el espectrofotómetro (I o), y la que sale (I):  Io  A  Log    I  Siempre I ≤ Io, ya que parte de la luz ha sido absorbida por la muestra. Según esta ley, la absorbancia es directamente proporcional a la trayectoria a través de la solución y a la concentración de la especie que produce la absorción: A=a·b·c Donde a es una constante de proporcionalidad llamada absortividad. Resulta evidente que la magnitud de a depende de las unidades utilizadas para b y c. Cuando se expresa la concentración en mol/L y la trayectoria a través de la celda en centímetros, la absortividad se denomina absortividad molar y se representa con el símbolo ε. En consecuencia, cuando b se expresa en centímetros y c en mol/L: Abs = ε · [c] · L Transmitancia Los detectores tienen una detección limitada; a partir de Abs =2 tenemos problemas para la precisión. Esto explicaría que se recomiende trabajar con una absorbancia máxima de Abs máx = 1, donde la absorbancia óptima Abs corresponde a un valor de 0,5. Debemos procurar no rebasar una absorbancia de 2 puesto que la precisión sería muy baja. Esto se puede comprobar mirando la transmitancia, que nos dice qué % de la intensidad incidente atraviesa la celda. Además de trabajar en modo Abs con los espectofotómetros, pues, también podemos trabajar con la trasnmitancia que es el porcentaje de luz que pasa a través de la celda respecto el rayo incidente:  I  T (%)   ·100  Io  2 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 Relación entre absorbancia y transmitancia Ejemplo 1: Tenemos una disolución de Abs = 1,0  cuánto valdrá el % de transmitancia?  Io  Abs  Log    1 ; 101 = 10;  I  La trasmitancia será la inversa  T   Io     10 ;  I  I ·10  Io  I  Io 10 I  0,1 (llega el 10% de la luz).
Io Ejemplo 2: Tenemos una Abs = 2 por lo que cuánto valdrá la transmitancia?  Io   Io  Log    2 ;    100 ;  I   I  T (%)  I ·100  Io T (%)  I  Io 100 Io ·100  1% 100 Io Tipos de espectrofotómetros Haz sencillo La lámpara da luz a una longitud de onda determinada que es absorbida por la muestra que retorna la luz al detector con diferentes I. Este tipo va bien para medidas puntuales pero para absorbancias de 300-320 nm no, puesto que deberemos hacer blancos cada vez.
Doble Haz Suele ser recomendable utilizar un espectrofotómetro de doble haz, en el cual la luz pasa alternadamente por las celdas de muestra y de referencia. Esto se realiza mediante un motor que hace girar un espejo dentro y fuera de la trayectoria de la luz. Cuando el espejo obturador intermitente (entrecortador) no desvía el haz, la luz pasa a través de la muestra, y el detector mide la potencia radiante I. Cuando dicho espejo desvía el haz de luz a través de la celda de referencia, el detector mide Io. De esta forma, la luz es desviada varias veces por segundo, y el circuito compara automáticamente Io e I para obtener la absorbancia (A = log Io/I). Este procedimiento mejora las prestaciones de un equipo de haz simple, donde el haz de luz sigue un camino único a través de una sola muestra. Ello causa inexactitud, porque tanto la intensidad de la fuente como la respuesta del detector fluctúan en el transcurso del tiempo. Si hay un cambio en alguna de ellas entre la medición de una cubeta y otra, la absorbancia aparente tendrá error. Un instrumento de haz simple es poco apropiado para mediciones continuas de absorbancia.
3 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 Absorbancia en proteínas Ante todo, cabe mencionar las características básicas de las proteínas para su análisis espectroscópico: 1.
Todas las proteínas tienen un pico a 200nm gracias al enlace peptídico.
2.
Los grupos aromáticos (Trp, Tyr, Fen) poseen otro pico a 250-280nm 3.
Los cofactores normalmente poseen picos a longitudes de onda más largas (260-340nm).
La espectroscopia UV – Visible es la más limitada para la información de compuestos. Los compuestos que tengan un cromóforo o instauraciones son visibles en esta región. Un cromóforo es cualquier grupo de átomos que absorben luz independientemente de que presente color o no, aunque también puede presentar un grupo autocromo que es el que amplía la conjugación de un cromóforo mediante la compartición de electrones de no enlace. Los máximos de absorción se deben a la presencia de cromóforos en una molécula. Este tipo de espectroscopía sirve principalmente para el análisis de compuestos aromáticos, carboxílicos (a y b insaturados), principalmente.
En las proteínas los principales cromóforos que se encuentran son:  Enlace peptídico  Aminoácidos aromáticos  Cofactores y el grupo hemo En esta absorbancia, principalmente producida por los enlaces peptídicos, puede verse afectada por las cadenas laterales de los aminoácidos. Otro factor que puede afectar es la conformación de la cadena polipeptídica (sobre todo las estructuras secundarias-hélice ) ya que pude dar lugar a variaciones.
Hay dos posibles soluciones:  Desnaturalizar por completo la proteína con ácido clorhídrico (1mM), para así eliminar la estructura secundaria  Desnaturalizar con el cloruro de guanidinio Existen multitud de fórmulas que nos dan la [proteína] a partir de la absorbancia de la proteína (algunos ejemplos):  A205 = 27 + 120 (Abs280 / Abs205) → 1mg·ml  [prot] = 144 · (A215-A225) → µg·ml 4 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 A parte del pico normal a 190, también salen los picos característicos a los aminoácidos aromáticos:  E257= 200 M ·cm → Phe -1 -1  E274= 1400 M ·cm → Tyr -1 -1  E280= 5600 M ·cm → Trp -1 -1 Hay proteínas que tienen un tercer componente, es decir, un tercer pico por los grupos prostéticos que pueda tener la + proteína unida. Normalmente se debe a coenzimas redox, como el NAD . Cuando el NADH se oxida, pasa a tener un máximo de absorción a 260, que se suele solapar con los picos de los aromáticos: Las aplicaciones de la absorbancia en el caso de las proteínas son:     Medir concentraciones de proteína Identificar proteínas ( mediante grupos prostéticos) Seguir una reacción enzimática Estructura Características de absorción de los ácidos nucleicos Las bases de los ác.n son las que absorben. Si hacemos un espectro del ADN se observa un máximo a 260nm y debería llegar a 0 si el ADN no estuviera contaminado con proteínas (300nm). Puede ser que el DNA no sea puro si no da de 0 en el punto de 290nm, cosa que significa que hay más cosas (como proteínas) que hacen agregar al DNA. Por ello, hay que purificarlo y así eliminar todas las proteínas a las que está unido para empaquetarlo bien, porque dichas proteínas provocan el fenómeno conocido como la dispersión de luz.
-1 -1 La ε de los ácidos nucleicos (6.000 – 10.000 M cm ), no se suele usar para calcular la concentración porque es un valor muy elevado y que varía demasiado. Esta variación de ε se debe según si el DNA está desnaturalizado o nativo, y también da información sobre el porcentaje de C-G. De este último parámetro, nos interesa porque que la temperatura de fusión sea mayor o menor, depende de ello.
5 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 La expresión para buscar la concentración del DNA, es: , on es dóna ds (doble cadena), 45% G-C.
*Si el DNA no es perfecto, se puede añadir un método de corrección, en el caso que a 290 nm no sea 0: De 290 a 320.
Si se altera el DNA, por ejemplo calentado las bases (grupos del DNA que absorben), se pueden llegar a separar las cadenas por completo. El conocido efecto hipercrómico, da lugar cuando la A260 aumenta en el orden de un 30%. Si se enfría lentamente, se puede revertir el proceso y provocar que las cadenas se vuelvan a unir, y así se disminuye la A260 y se da el efecto hipocrómico.
Este efecto va disminuyendo la absorbancia hasta los valores normales de absorción. Esto es debido a que las bases están apiladas con las hebras juntas, y si se separan quedan más expuestas al solvente y absorben más.
Esto principalmente se utiliza para la cinética de desnaturalización del DNA. Salen unas curvas de fusión o de desnaturalización que indican el nivel de separación entre las hebras. Se encuentra un punto de inflexión denominado TM (temperatura de fusión del DNA), que es la temperatura en la cual tenemos la mitad de nucleótidos en estructura sencilla y la otra mitad en estructura de cadena doble. Permite estudiar el efecto del porcentaje de C-G en la estabilidad del DNA o el efecto de la concentración de sal en la estabilidad del DNA. En el DNA de muchas bacterias no tiene efecto, 6 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 ya que la cantidad de sal es moderada (3M) y el % de C-G es de un 80%, un valor alto, por lo cual el DNA se estabiliza más y no acaba de desnaturalizar.
El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 Å. El menor grado de absorción se produce en el estado de doble hélice: la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia. Por tanto, la absorbancia a 2.600 Å se puede utilizar como una medida del estado físico (conformación de la hélice) de la molécula de ADN. Las curvas de fusión tienen forma de S observándose un aumento brusco de la absorbancia al llegar a una temperatura determinada, la temperatura de fusión. En resumen, nos permite seguir cambios en la conformación: Curvas de fusión: Consisten en coger una muestra de ADN y seguir su Abs a 260nm en función de la T. Observaremos que durante un rato calentamos y no aumenta la Abs. Esto quiere decir que aún se mantiene estable la estructura del ADN hasta que llega a un momento en el que se comienza a desnaturalizar hasta que llega a estarlo totalmente.
Punto de inflexión: Es la Tm (T de fusión) donde la mitad de los nt’s se hayan en la forma de doble cadena y la otra mitad en cadena sencilla.
Las curvas de fusión permiten medir la estabilidad térmica de la doble cadena de ADN en función de las condiciones ambientales y las características propias de la cadena.
Las aplicaciones más interesantes son:  Determinación de la concentración  Determinación de la pureza o calidad de la preparación  Estudio de las curvas de fusión  Interacción con proteínas Cromóforos Factores de la absorción de los cromóforos:  - Disociación de grupos: Como el ejemplo del grupo hidroxilo (OH ) de la tirosina, que es un grupo disociable y cambia el máximo de absorción de manera radical  Polaridad del disolvente: Perturbación del disolvente  Proximidad de otros cromóforos 7 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 Los factores que afectan al pH, principalmente, son el pH y la polaridad del disolvente.
El pH Si se sube el pH a 9,5, tendríamos el pKa con la mitad de hidroxilo protonado. El efecto es considerable porque aumenta el máximo de absorción. Puede servir para detectar el pKa. Para afectar a un cromóforo, éste tiene que tener un grupo disociable. Un ejemplo puede ser el grupo disociable de la Tyr, pudiendo calcular el pKa de la tirosina midiendo la absorción. Cuando se disocia el protón del grupo -OH aumenta la intensidad, y el pico se desplaza hacia la derecha. Como el grupo protonado se va a 0 antes del pico 295nm, la absorbancia de grupo protonado no afecta a la del grupo disociado. Así podemos hacer una curva de valoración y podemos ver cómo al variar el pH se va disociando el protón poco a poco.
Si tenemos la fortuna de trabajar con una proteína que sólo contenga Tyr y no Trp, analizando la proteína y valorándola podemos saber cuántas Tyr tenemos dentro de la proteína y cuantas expuestas al solvente que se ven afectadas por el cambio del pH.
A un determinado pH, la proteína se desnaturaliza totalmente y las dos tirosinas que estaban escondidas, se ven expuestas al solvente y se disocian de manera instantánea. Haciendo otra curva de valoración, nos muestra el pH al cual la proteína se desnaturaliza y la disociación instantánea de los grupos -OH de las tirosinas ocultas en la estructura de la proteína. En muchos casos, la segunda transición se ve solapada con la primera y no podemos distinguir nada. Esto puede ser debido a que la proteína se desnaturaliza a un pH muy lábil, o que la proteína esté fluctuando constantemente.
La polaridad del disolvente La polaridad del disolvente se puede disminuir añadiendo ciertas moléculas que no afectan a la estructura secundaria y terciaria de las proteínas, como son el glicerol, la sacarosa o el etilenglicol. Provocan un aumento de la densidad de absorción, de manera que lo desplazan hacia longitudes mayores. Este efecto se conoce como perturbación del disolvente. El efecto general es aumentar la intensidad en el máximo de absorción y pasarlo a la longitud de onda más alta.
Un ejemplo es la tirosina libre. Si se le añade un 20% de etilenglicol, se puede definir un espectro de diferencia entre las tirosinas sin etilenglicol y con etilenglicol. Hay dos formas para calcularlo, y la más precisa consiste en una técnica utilizando el espectrómetro de doble haz, que directamente hace la resta de los dos espectros.
Los espectros están tan separados que casi no se solapan. El espectro de diferencia tendrá valores pequeños ya que las diferencias entre los espectros no son importantes. Puede dar absorbancias positivas o negativas, pero siempre con valores muy pequeños. Estos espectros son problemáticos ya que no nos dicen nada sobre la absorbancia absoluta de la muestra.
8 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 La proximidad de los cromóforos Destaca en los ácidos nucleicos, ya que al separar la estructura de doble hélice, la absorbancia aumenta mucho más porque todos los aminoácidos se ven expuestos.
A continuación se presentan dos técnicas espectroscópicas basadas en la absorción, tanto electrónica (dicroísmo circular), como vibracional (infrarrojo). El dicroísmo circular y la espectroscopia infrarrojo son útiles para determinar el porcentaje de una determinada estructura secundaria, con ciertas diferencias. El dicroísmo circular determina el porcentaje de hélice  y hoja β, aunque no es capaz de detectar los giros (loops) que conectan dichas estructuras, por lo cual quedará en forma de random coil. Es una técnica en disolución, ya que no tolera los agregados. La técnica de infrarrojo, en cambio, es capaz de determinar los giros de las hojas β, distinguiendo mejor las diferentes estructuras que la técnica anterior, 1 además de ser más potente. Se puede hacer incluso en estado sólido debido que la dispersión de la luz es menor, con una longitud de onda mayor.
Son técnicas para llevar a cabo el estudio de interacciones post-ligando, cambios conformacionales, estructuras secundarias, etc. Las dos técnicas se presentan a continuación.
ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ELECTRÓNICA Dicroísmo circular El dicroísmo circular es una técnica espectroscópica basada en la absorción diferencial de la luz polarizada. Se considera que en un rayo de luz polarizado en un plano, se encuentran dos componentes polarizados circularmente, uno a la derecha y el otro a la izquierda. Estos componentes están en fase y son de la misma amplitud. Está basada en la actividad óptica de las moléculas, debido que cuando un componente pasa por un medio ópticamente activo, interactúa de manera diferente con los centros quirales de dichas moléculas. Esta interacción induce a un desfasamiento y un cambio de magnitud diferenciales en ambos componentes, por lo cual provocan una rotación del plano de polimerización y se genera una elipse.
Es una técnica de absorción y de baja resolución que ofrece el % de la estructura secundaria. En el DC se trabaja en la zona de absorción del enlace peptídico (a 240-290nm). Los espectros de esta técnica se realizan con polilisina. Si sólo nos interesa conocer el % de hélice alfa utilizaremos la siguiente fórmula: % Hélice   E 220nm  0,25 0,105 Fundamentos físicos La luz polarizada está formada por fotones individuales cuyos vectores de campo eléctrico están alineados en la misma dirección. Hay de dos tipos:  Lineal: El plano es constante, pero la magnitud del vector eléctrico va variando 1 Dispersión de la luz   9 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego  Técnicas Instrumentales T4 Circular: El vector eléctrico se mantiene constante pero va rotando, mientras describe una hélice que tanto puede estar en la derecha como en la izquierda Cuando la luz polarizada en un plano atraviesa una muestra ópticamente activa, sus componentes de luz circularmente polarizada se absorben en distinta cantidad. Por eso se dice que está basada en la actividad óptica de las moléculas.
Elipticidad En la siguiente imagen se explica el fenómeno de elipticidad. En dos ondas circulares polarizadas en direcciones opuestas, todas las resultantes caen en el plano. Si hay dicroísmo, uno es más pequeño que el otro y el resultante no cae sobre el plano, sino sobre una elipse. De aquí proviene el término elipticidad (Ɵ). El grado de achatamiento se puede relacionar con el grado de dicroísmo. En cambio si no hay dicroísmo la resultante caería sobre el plano.
Hay dicroísmo circular donde puede haber absorción de la radiación, pero no a todas las zonas donde hay absorción de luz visible o UV.
Si la muestra no presenta dicroísmo, se trata de una onda harmónica: Dispersión óptica rotatoria El efecto de la diferencia en el índice de refracción para la luz polarizada circularmente a izquierdas y a derechas se encuentra en la imagen siguiente. La luz polarizada emergente se encuentra en el plano y rotada: 10 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 Instrumentación La ventaja que presenta esta técnica es que se necesita cantidades muy bajas de proteína. El aparato utilizado se denomina dicrógrafo, similar a un espectrómetro, pero que utiliza luz polarizada.
En la imagen podemos ver el espectro de dicroísmo circular: La cadena estadística se refiere a que podemos tener los rangos puros. No hay espectro para los codos porque seguramente caen sobre esta cadena.
Para tener dicroísmo circular hay que tener absorción, concretamente en la parte que absorbe el enlace peptídico (grupo amina). La mayor parte de moléculas no presentan dicroísmo circular, debido que se trata de una absorción diferencial.
Algunas moléculas intrínsecamente asimétricas o polímeros (que no presentan dicroísmo circular), puede que lo presenten al encontrarse en una posición geométrica que lo permite. Un ejemplo son los nucleótidos del DNA, donde la hélice es intrínsecamente asimétrica. Las proteínas, pueden presentar dicroísmo en el enlace peptídico y en los puentes disulfuro (entorno a 260-340 nm). Los aminoácidos aromáticos no dan dicroísmo.
Ahora veremos lo que mide el aparato y lo que nos da que no es lo mismo, y cómo tenemos que convertirlo otra vez. El dicrómetro nos da elipticidad, aunque el aparato mide en incremento de absorbancia. El dicroísmo circular se define como la diferencia de absorción entre la luz circularmente polarizada a la izquierda y la circularmente polarizada a la derecha por un cromóforo quiral.
11 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego  Técnicas Instrumentales T4 Lo que mide el aparato es un Abs que será: ΔA= AL –AR = ΔE·l·c Son diferencias extremadamente pequeñas, aunque se pueden medir. De aquí vemos que la manera más fácil y racional de representarlo es mediante el incremento de épsilon. Por razones históricas, los espectrómetros presentan CD como elipticidad Ɵ, que relaciona la medida a la DOR.
 Nos da Ɵ (elipticidad): Ɵ = ΔA·32,98 → [0] Hay que estandarizar Ɵ por la concentración de la disolución y por el paso óptico ( ), ya que hay que tener en cuenta que es la concentración molar del monómero. Esto nos da [Ɵ], que es la elipticidad molar que nos permite 2 1 presentar un espectro donde sus unidades son grado·cm /dmol .
 Finalmente el ε= [Ɵ]/3298 Si trabajamos con polímeros c será la concentración por monómero: nucleótidos en el caso de DNA y residuo aminoacídico en el caso de las proteínas. Cuando estandarizamos (paso imprescindible) obtenemos unidades absolutas y podemos comparar una proteína con otra y podemos superponer los espectros.
El espectro es la suma algebraica de los espectros de hélice , hoja β y de random coil.
Un ejemplo concreto es el de la mioglobina, una proteína que presenta:  68,3% de hélice   4,7 % de lámina β  27 % de anillo estadístico (random coil) Actualmente hay programas para analizar los espectros de dicroísmo circular, donde dan los posibles porcentajes de estructuras secundarias. Esto es posible gracias a que hay muchas proteínas cristalizadas, donde la mejor proteína para utilizar es la polilisina. A continuación se presenta el espectro que dicha proteína que el programa utiliza: S  = a []  + b [β]  + c [RC]  a, b y c: % de estructura secundaria S: valor d’elipticidad a  12 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 Esta fórmula es útil para la mayoría de proteínas, ya que las proteínas con mucha cantidad de prolina, lisina o glicina, el dicroísmo circular falla bastante.
Muchas veces el interés no es conocer los tres motivos estructurales presentes, sino tan solo el % de hélice . Para ello, se encuentra una fórmula empírica donde a partir de ε se puede encontrar el porcentaje de : % hélice  = (ΔE220 -0,25)/0,105 Al comparar el resultado de esta última fórmula y la anterior, debería salir el orden, porque no da el número exacto.
Muchas veces se utiliza el producto trifluoroetanol (TFE), de fórmula empírica CF3-CH2OH, que es un estabilizador de hélice alfa.
Concretamente, es un inductor de aquella conformación que prefiere la proteína. Así, favorece más el estado donde hay estructura secundaria.
Aplicaciones del dicroísmo circular en proteínas  Determinación de la estructura secundaria de proteínas que no pueden ser cristalizadas  Investigación del efecto de la unión de drogan en la estructura secundaria proteica  Procesos dinámicos (plegamiento de proteínas)  Estudios sobre los efectos de la cristalización en las estructuras de las proteínas  Estructura secundaria de las membranas de las proteínas  Estudio de los cambios en el centro activo  Estructura de los carbohidratos Las estructuras secundarias formadas por enlaces peptídicos, son asimétricas y tienen espectros de CD característicos. En proteínas, concretamente, el CD del enlace amida nos informa sobre la estructura secundaria: 13 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN VIBRACIONAL Infrarrojo La espectroscopia infrarroja (IR) es la rama de la espectroscopia que trabaja con longitudes de onda de la zona correspondiente en el infrarrojo del espectro electromagnético (entre 800 y 400.000 nm). Se utiliza para identificar un compuesto o investigar la composición de una muestra, ya que da información sobre los tipos de enlace de ésta. Los fotones de radiación infrarroja no tienen energía suficiente para provocar transiciones electrónicas en los átomos, aunque sí pueden conseguir vibraciones en los enlaces covalentes de las moléculas orgánicas. Son, pues, transiciones de nivel vibracional.
Con el infrarrojo prácticamente no hay dispersión de luz debido a que la potencia de luz es la inversa de la longitud. Podemos trabajar, por lo tanto, en material sólido y con agregados. También podemos detectar los codos, random coil, lazos,… con la desventaja que necesitamos muestras importantes de proteína (entre 3-5 mg/mL). Además, es un mecanismo de análisis que genera cierta controversia según si se acerca o no a la realidad.
Se encuentran diferentes modos de vibración, tanto de tensión como de flexión.
1.
VIBRACIONES DE VALENCIA (TENSIÓN) Implican movimientos en la dirección de los enlaces de valencia. Pueden ser simétricos o asimétricos: 2.
VIBRACIONES DE DEFORMACIÓN (FLEXIÓN) Destacan los movimientos perpendiculares a los enlaces. Se pueden dar flexiones en el plano o fuera del plano: 14 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 Estas vibraciones se pueden inducir irradiando con una longitud de onda adecuada. El aparato, lo que hace es irradiar con todas las longitudes de onda a la vez, y cada estado vibracional absorbe la suya.
Cada tipo de vibración tiene una energía diferente, por lo cual absorbe a diferentes longitudes de onda. Al pensar en una cadena polipeptídica, tiene multitud de vibraciones. Para el estudio de proteínas, se utiliza una única vibración para simplificar el estudio, la banda correspondiente a la amida-1. En el espectro se emplea H2O o D2O. Básicamente, toda su magnitud es debida a la vibración del estiramiento del grupo carbonilo del enlace peptídico, prescindiendo de todo lo demás. Sale entorno a 1.600 unidades por onda, donde esta frecuencia de vibración se ve afectada por las diferencias entre estructuras secundarias en las que el carbonilo está implicado. La amida I, entonces, se produce fundamentalmente por vibraciones de tensión del enlace C=O del enlace peptídico, acopladas con vibraciones de tensión del enlace C-N y de deformación de CCN. La frecuencia de las vibraciones depende de los puentes de H que establezcan los grupos C=O y N-H, y el patrón de puentes de H depende a su vez de la estructura secundaria que adopte la proteína, de ahí la sensibilidad de la banda amida I a cambios en la conformación de las proteínas y péptidos.
El espectro es una transformada de Fourier y nos da un espectro completo directamente, a diferencia de la espectroscopia donde se van obteniendo puntos. Los espectros tienen mucho ruido, que se produce al azar y su señal desaparece con la suma de todo el conjunto de espectros por superposición.
Espectro = absorción proteína – absorción background Esto se hace porque todos los motivos estructurales están estabilizados por puentes de hidrógeno entre el grupo amida y el carboxilo. Se da el caso que la implicación del grupo carboxilo en el puente de hidrógeno, se ve afectada según cualquiera estructura secundaria, y la vibración no se da a la misma frecuencia.
Se descompone en gaussianas que corresponden a las diferentes vibraciones según la estructura, que corresponden a los carbonilos asociados a una determinada estructura secundaria. Es el responsable de que los puentes de hidrógeno que estabilizan una determinada estructura secundaria y la frecuencia cambie dependiendo de la estructura.
15 María Monteserín Cuesta Judith Gonzàlez Gallego Técnicas Instrumentales T4 Byler y Suvi, en 1986 estudiaron la descomposición de la gaussiana. Cada uno de los picos representa un punto de estructura secundaria diferente, donde intentaron asignar los picos: Lo hicieron des de un punto de vista empírico. Cogieron 23 proteínas de estructura cristalográfica conocida, comprendiendo todos las posibilidades de estructura secundaria (todo , todo β, proteína con poca estructura, etc.
Complejo proteína-DNA: hace falta restar el DNA para saber cómo ha variado la conformación de la proteína.
Comparando los espectros entre el deuterio y el agua, se pueden diferenciar codos de random coil.
Tras tener la descomposición se da el refinamiento, que permite que se muevan dos números de onda para arriba y para abajo, donde se puede llegar a una solución que se considera que es matemáticamente única. El proceso de deconvulación nos dice si se trata de un buen ajuste a partir de las gausianas. El experimento de Zyler y Susi, con 23 poteínas diferentes, sería un argumento muy justo de que la descomposición es de solución única.
Instrumentación Espectro 16 ...