Tema 11 Caracterización de complejos proteicos. Interactómica (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Proteómica
Año del apunte 2015
Páginas 31
Fecha de subida 08/04/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 11 Caracterización de complejos proteicos. Interactómica Principios de la interacción entre proteínas: concepto de interactoma Cada complejo proteico está compuesto por distintas subunidades que interaccionan entre ellas. Estas interacciones transitorias son esenciales para el funcionamiento de la célula. El hecho de que sean transitorias hace que sean más difíciles de caracterizar e identificar.
El INTERACTOMA consiste en un mapa o una visión general de todas las interacciones entre las proteínas. Abarca tanto el conocimiento de las interacciones entre proteínas, como el conocimiento de las relaciones entre complejos.
Cuando hablamos del concepto de interactoma, nos referimos tanto a las interacciones estables como a las transitorias, y son ambos tipos de interacciones las que nos interesa conocer. El conocer las interacciones entre proteínas nos es útil para conocer el funcionamiento y la función de la proteína - si desconocemos la función de una proteína, podemos aproximarnos a ella conociendo las interacciones con otras proteínas.
Los proyectos en los que se intenta hacer un abordaje todas de las interacciones de un sistema biológico y caracterizarlas globalmente son estudios High-troughput. Son los únicos estudios que podemos considerar aproximaciones -ómicas o globales.
Por el contrario, los estudios Low-troughput aspiran al estudio de un menor número de interacciones normalmente, de una o unas pocas proteínas.
Los estudios High-troughput aportan más información, pero acostumbran a ser menos fiables.
Bioquímica de las interacciones Como estamos hablando de interacciones, nos encontramos ante dos componentes que interaccionan entre ellos de forma reversible. Estamos hablando de una reacción bidireccional, en la que tenemos una serie de parámetros entre los que destaca una constante de disociación.
1 Interactómica Se considera que si la constante de disociación es mayor que 10-4, estamos ante una interacción transitoria. Por el contrario, si las constante de disociación es menor que 10-6, nos encontramos ante una interacción estable. Cuanto más estable sea la interacción, será más fácil de identificar.
Interacciones proteína-proteína Que dos proteínas interaccionen entre sí viene determinado fundamentalmente por la superficie de ambas proteínas. Entran en juego dos conceptos: - Geometría - Interacciones no covalentes: electrostáticas, hidrofóbicas, puentes de H, interacciones de Van der Waals.
Como ya sabemos, hay diversos programas que nos permiten modelizar las características de la superficie de la proteína - PyMol, DELPHI, Protein Workshop, Chimera, GRASP, MSMS, SEQMOL, … Las regiones hidrofóbicas de la proteína acostumbran a encontrarse en el interior de esta, pero también las podemos encontrar en ciertas regiones de la superficie, conocidas como parches hidrofóbicos (hydrophobic patch). Estas regiones hidrofóbicas suelen ser relevantes en las interacciones entre proteínas  normalmente, las proteínas interaccionan por las regiones hidrofóbicas.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La carga electrostática también es importante de cara a las interacciones. En la siguiente imagen vemos una proteína que ha sido coloreada en función de su carga. La carga positiva ha sido representada en azul y la negativa en rojo (como es habitual). Si nos centramos en la interacción de la proteína con otra proteína vemos que las zonas ácidas están interaccionando con las zonas básicas.
La geometría de las proteínas también es un factor determinante en la interacción, ya que para poder interaccionar, las proteína obviamente tendrán que encajar.
Interés del análisis de las interacciones proteína-proteína En primer lugar, conocer las interacciones entre proteínas nos lleva a ampliar los conocimientos de los mecanismos de acción de éstas.
Por otro lado, aparte de un mejor conocimiento del proteoma, el análisis de las interacciones proteicas también tiene una aplicación práctica, ya que nos puede conducir a encontrar la forma de modular (o inhibir) la acción de las proteínas o de una vía de señalización mediante la rotura o la interrupción de estas interacciones.
En el siguiente ejemplo podemos ver cuatro fármacos que se encuentran en fase de ensayo clínico que intentan cortar las interacciones proteína-proteína alterando así determinadas vías de señalización implicadas en cáncer  se trata de fármacos anti-cancerígenos.
3 Interactómica Mecanismos para identificar proteínas - técnicas basadas en la captura por afinidad La idea general de estas técnicas es simple: se hace una extracción celular y se trata de capturar físicamente la proteína de interés. Una vez aislada, se mira a qué está enganchada.
En primer lugar, cabe destacar que a la proteína capturada la llamamos cebo (bait) mientras que a la proteína que se copurifica junto a esta (es decir, la proteína que interacciona), la llamamos presa (prey).
La forma más popular es la captura con anticuerpos, la inmunoprecipitación.
La forma de enfocar el análisis dependerá de si tenemos o no una hipótesis previa: - Si desconocemos totalmente con qué interacciona una proteína y no contamos con una hipótesis al respecto realizamos espectrometría de masas.
- Si partimos de una hipótesis previa (si sospechamos de con qué otra/s proteínas puede estar interaccionando) hacemos un Western Blot.
Si queremos saber con qué proteínas interacciona una proteína determinada, lo principal es obtener la forma de capturar la proteína - hay varias formas: Anticuerpos - inmunoprecipitación Incubamos la preparación con anticuerpos que reconozcan la proteína. En caso de no haber anticuerpos contra dicha proteína, se añade mediante la técnica de ADN recombinante una etiqueta a la proteína (contra la que irán destinados los anticuerpos).
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV A los anticuerpos se unirá la proteína con todo aquello que tenga enganchado. Una vez hecho esto, necesitamos la forma de capturar los anticuerpos: la manera más clásica son las bolas cromatográficas de agarosa recubiertas de una proteína -proteína G o A- que tiene afinidad por las regiones Fc del anticuerpo.
Se centrifuga y los complejos formados por la proteína (unida a todo aquello con lo que interaccione), anticuerpo, proteína A o G y bola de agarosa se van al pellet. A continuación, el pellet se resolubiliza con algo que corte la interacción de la proteína G o A con las inmunoglobulinas (SDS, pH bajo, urea, …).
Los distintos componentes quedan purificados.
Después, se hace correr la muestra en un gel desnaturalizante y se cortan las bandas que aparecen para identificarlas por espectrometría de masas. También podemos aplicar la espectrometría de masas/masas directamente sin correr previamente en el gel.
Sobre esta idea general se pueden aplicar distintas variaciones: por ejemplo, para capturar las proteínas podemos usar bolas de agarosa unidas directamente a los anticuerpos. En este caso, la ventaja es que al hacer la elución nos queda la proteína directamente, sin anticuerpos.
*Se separa en columnas con un poro que no deje pasar las bolas de agarosa.
Aunque ya se ha mencionado anteriormente, para identificar proteínas:  Sin hipótesis previa, como ya hemos dicho, se aplica la espectrometría de masas.
 Si partimos de una hipótesis, podemos tener anticuerpos contra la proteína que sospechamos que interacciona. Tras separar, se corre en gel y se realiza un Western Blot contra esta proteína.
Los anticuerpos tienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. La región Fc se une a la proteína A, que proviene de Staphilococcus aereus o a la proteína G, que procede de Streptococcus. La proteína G se une solamente a IgG y no reconoce a las Ig A, E o M. La proteína A tiene un espectro más amplio: reconoce a las Ig M, A y E e incluso a algunas IgG con mayor o menor afinidad.
5 Interactómica Coimunoprecipitación (CoIP) Para comprobar si está la proteínas que sospechamos (la presa), se hace un Western Blot anti prey. Para confirmar que hay interacción entre las proteínas bait y prey hay que realizar el experimento inverso: es necesario inmunocapturar prey y hacer un Western Blot anti bait.
A la hora de buscar interacciones proteicas es necesario emplear, durante las primeras fases, detergentes sin carga. Por eso, en el ejemplo de la imagen se ha empleado un detergente no iónico para solubilizar las proteínas mitocondriales - estudian la interacción entre la aconitasa y la frataxina.
La agarosa es una superficie muy porosa, y estos poros acaban generando problemas: retienen parte del anticuerpo haciéndolo más inaccesible, por lo que dificultan los lavados (pueden quedar proteínas unidas). Como nos interesa separar mucho lo unido de lo unido y lo más rápido posible, desde hace unos años se está introduciendo una alternativa a la resina de agarosa, las Dynabeads. Con esta resina nos evitamos que se genere el background de restos de proteínas y suciedad que queda con las bolas de agarosa. Las Dynabeads son bolas magnéticas, que resultan más rápidas de limpiar. Los anticuerpos se unen a estas beads de la misma forma en la que se unían a la agarosa.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Problema de los anticuerpos Para poder hacer inmunoprecipitación es necesario contar con un anticuerpo que reconozca la proteína. El problema es que no en todos los casos disponemos de anticuerpos que reconozcan la proteína. Pueden no estar disponibles o ser anticuerpos de mala calidad (lo que nos llevaría a una mala inmunoprecipitación).
También podemos encontrar que, por ejemplo, un anticuerpo funcione bien en el Western Blot pero no en la inmunoprecipitación - es comprensible ya que, en el Western Blot la proteína está desnaturaliza y en la inmunoprecipitación está plegada. Si el epítopo de la proteína está "escondido" (no está en la superficie de la proteína plegada), se detectará cuando la proteína se desnaturalice (solo funciona con WB). En cambio, si el epítopo tiene estructura 3D, será necesario que se mantenga la estructura para que se produzca la interacción (inmunoprecipitación). Cuando se adquieren los anticuerpos, se adjunta la información de en qué técnicas funciona.
La solución si no existe anticuerpo que funcione en la inmunoprecipitación de la proteína es añadir una etiqueta o tag que modifique la secuencia de la proteína.
Así, la podremos purificar fácilmente usando la afinidad contra la etiqueta.
Se hace una construcción genética en la que, al gen de la proteína, se le añade la secuencia de la etiqueta.
Tipos de etiqueta en inmunoprecipitación Es habitual usar pequeños péptidos que provienen de proteínas inmunogénicas - se trata de secuencia antigénicas para las que se conocen anticuerpos que funcionan bien. Se emplean péptidos como HA, Myc y FLAG.
Existen otras secuencias: CBP, GST, proteína A, … que son fragmentos de proteínas que podemos purificar empleando cromatografía de afinidad.
CBP - Calmoduline Binding Peptide. Como su propio nombre indica, se trata de un péptido que se une a calmodulina. Para purificar se usa una columna de calmodulina (agarosa recubierta de calmodulina). Como no se emplean anticuerpos, ya no se considera inmunoprecipitación.
GST - Glutatión S-transferasa. Se trata de una enzima que tiene un lugar de unión a su sustrato, el glutatión.
7 Interactómica Proteína A: es la misma proteína A que se usa para hacer bajar a las inmunoglobulinas (que tiene afinidad por la región Fc de las Ig) Para capturar la proteína se usa agarosa recubierta de inmunoglobulinas.
Debemos expresar la proteína a partir de un plásmido, lo que generalmente nos conduce a la sobreexpresión. Esto, en algunos casos, nos puede resultar muy problemático. S. cerevisiae tiene un sistema de recombinación homóloga muy eficiente, por lo que puede marcar la copia cromosómica con eficiencia.
En el siguiente ejemplo tenemos un estudio sobre las proteínas con las que interacciona la frataxina.
No hay anticuerpos que funcionen los suficientemente bien para inmunoprecipitación de la frataxina por lo que se construyó un plásmido en el que se fusionó FLAG al gen de la frataxina. Después, se hizo la captura con anticuerpos anti FLAG.
En la imagen se pueden ver las distintas bandas que aparecen: la banda más gruesa corresponde a la cadena pesada de los anticuerpos.
Ellos cortaron las bandas, las digirieron e identificaron mediante espectrometría de masas las proteínas que contenían. Para validar los resultados, se hace un experimento con inmunoprecipitación para cada proteína detectada.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Problema de la inmunoprecipitación Hay ciertas proteínas que se unen de forma inespecífica al anticuerpo (con las Dynabeads se reduce bastante este efecto pero continúa pasando).
Para minimizar esto, se desarrolló la estrategia Tandem Affinity Purification (TAP) que consiste en añadir al gen una etiqueta que tenga en realidad dos etiquetas al mismo tiempo. Por ejemplo, CBP y proteína A. Entre las secuencias de las etiquetas se incluye una secuencia de unión a una proteasa, es decir, una secuencia de corte.
Sometemos la proteína de interés a una doble inmunoprecipitación: cuando el complejo está retenido en la primera columna, cortamos con la proteasa para eluir así el complejo de la resina. La elución es más específica y hace que muchos contaminantes que quedan unidos a la columna no eluyen junto a la proteína de interés. Después se pasa la muestra por una segunda columna, con afinidad por la segunda etiqueta.
La desventaja de este método es que el complejo proteico debe ser bastante estable para aguantar dos purificaciones seguidas sin degradarse.
El equipo de investigación que desarrolló este sistema fueron los primeros en analizar un interactoma entero. Analizaron el interactoma de levadura con distintas cepas, cada una de las cuales tenía un gen distinto marcado con una tag.
9 Interactómica Se trata de un estudio a gran escala o High Throughput - generó gran cantidad de datos que quedan registrados en bases de datos.
Debido a la gran magnitud del análisis, no validaron las interacciones descubiertas, como ocurre normalmente en los estudios High Throughput.
Factores que pueden afectar a la estabilidad del complejo en interacciones transitorias Los factores que alteran la estabilidad de los complejos proteína-proteína son de especial relevancia en estudios de inmunoprecipitación. Estos estudios se hacen in vitro o a partir de lisados celulares, por lo que no se realizan en las mismas condiciones que tiene la célula in vivo.
Encontramos que la estabilidad de los complejos se ve afectada por: - Concentración de la proteína, que lógicamente no será la misma en un lisado que in vivo.
- Concentración de sales, que interfieren en las interacciones iónicas e hidrofóbicas debido a su efecto caotrópico o salting-in (que corta interacciones polares) y a su efecto salting-out (que favorece las interacciones hidrofóbicas).
- Orientación y disposición de la etiqueta.
- Cofactores (iones, metales, …) que pueden estar o no presentes in vitro.
- Ausencia de metabolitos - Coenzimas.
- Modificaciones post-traduccionales, que pueden verse afectadas al realizar el lisado. Si no contamos con las mismas modificaciones, dos proteínas que interaccionan in vivo podrían no hacerlo in vitro.
A continuación, vamos a profundizar en estos factores: Efecto de la concentración Como ya se ha comentado, cuando tenemos una interacción entre dos proteínas estamos ante una reacción reversible: la reacción de formación del complejo. Esta reacción está gobernada por una seria de parámetros cinéticos, como la constante de disociación (KD).
Como vemos en las fórmulas de la imagen, la concentración de complejo depende del producto entre la concentración de las dos proteínas que lo forman.
Tras hacer el lisado de la célula estamos disminuyendo X órdenes de magnitud la concentración de proteína, lo que conlleva la disminución de la concentración de complejo. Además, es probable que a una concentración menor, el complejo se disocie.
La inmunoprecipitación funciona muy bien para complejos estables, con una constante de disociación baja, pero no funciona tan bien con complejos menos estables.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Molecular crowding La disponibilidad de agua también influencia a la hora de formar los complejos. Normalmente, cuando se forma el complejo las proteínas están solvatadas por agua pero se requiere una cantidad menor de agua para solvatar el complejo que para solvatar las proteínas por separado (las proteínas suman una superficie mayor). Por lo tanto, cuando hay poco solvente disponible se favorece la formación de complejos, sobre todo si se forman por interacciones hidrofóbicas entre las proteínas.
Es común que se empleen compuestos con alta capacidad de solvatar agua para formar los complejos los crowding agents. Estos tienen alto peso molecular y son poco reactivos (por ejemplo, polietilenglicol, ficol o proteínas). Los agentes ideales deben ser altamente solubles y no formar agregados.
Efecto de la sal Como ya se ha comentado en más de una ocasión, la sal favorece las interacciones hidrofóbicas y desfavorece las interacciones polares.
Por este hecho, si hablamos de formación de complejos, podemos decir que la sal favorece la formación de complejos de proteínas que interaccionen mediante interacciones hidrofóbicas y desfavorece la formación de aquellos complejos de proteínas que interaccionan por interacciones hidrofílicas o polares.
A la hora de estudiar las interacciones entre proteínas suele usarse un buffer con una concentración de sal bastante estándar.
*Por otro lado, es preciso mencionar que las etiquetas pueden dar lugar a problemas estéricos, de plegamiento, de localización, de cantidad, … 11 Interactómica Uso de entrecruzadores para la caracterización de complejos y su arquitectura Los entrecruzadores (o cross-linkers) son compuestos que tiene dos extremos reactivos frente a alguna otra sustancia, como aminoácidos, un grupo de azúcares, etc. Si tenemos un complejo proteico y añadimos un entrecruzador, éste será capaz de unir de forma covalente trozos de proteína que se encuentren próximos. Es decir, los entrecruzadores mantienen los complejos estables. Por tanto, estos compuestos nos permiten aplicar técnicas más agresivas sin que los complejos se disocien y así poder llegar a saber por qué regiones interaccionan las proteínas.
Estos compuestos raramente funcionan in vivo, ya que es muy complicado que se incorporen en la célula. En lugar de entrar en su interior, los entrecruzadores se quedan interactuando con las proteínas del exterior.
Ejemplos: Podemos encontrar distintos grupos reactivos. Por ejemplo, los hay que reaccionan con los grupos amino de los aminoácidos. También podemos encontrarlos que interaccionen con las cisteínas.
Los compuestos DMA y DMS son prácticamente iguales; solamente se diferencian en la longitud del brazo espaciador (se unen a los mismos grupos).
El DSP resulta interesante ya que, como podemos ver, tiene en medio de la molécula un puente disulfuro. Éste nos permitirá cortar la interacción en el momento en que nos interese añadiendo un reductor de puentes disulfuro (las proteínas que se mantienen unidas con el entrecruzador se separarán).
El entrecruzador más sencillo es el formaldehido, que se usa frecuentemente para unir proteínas y DNA.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En el siguiente trabajo vemos un ejemplo de unos investigadores que han usado como entrecruzador paraformaldehido para encontrar compuestos que interaccionen con la proteína Ras. Añadieron una etiqueta a la proteína y emplearon anticuerpos anti-tag.
Si una vez hecha la purificación, se calienta la muestra a 100ºC, el paraformaldehido se rompe, separándose las proteínas que unía.
En la imagen podemos ver un Western Blot contra los lisados si purificar y sin separar con el anticuerpo antiMyc (Myc es la tag que se ha añadido a la proteína). A medida que vamos aumentando la concentración de paraformaldehido (como podemos ver en el Western Blot de la parte superior de la imagen), van apareciendo bandas adicionales. Éstas se corresponden a elementos entrecruzados, que se deben a que la proteína de interés se ha entrecruzado con alguna otra (que esté lo suficientemente cerca).
Se piensa que el paraformaldehido provoca demasiadas interacciones inespecíficas.
En el siguiente ejemplo se utiliza como entrecruzadores dos isótopos, uno de más pesado que el otro ya que tiene deuterio. Los entrecruzadores se han usado para saber por qué regiones interaccionan dos proteínas que forman un complejo - se espera que los entrecruzadores interaccionen por los lugares de contacto.
Por último se analizan los resultados con MS/MS: en el espectro aparecen parejas de picos separados por la misma cantidad de Daltons (que se corresponden con el isótopo pesado y el isótopo ligero).
Por tanto, en este caso se han empleado los entrecruzadores para validar y para profundizar en la topología del complejo.
13 Interactómica En el siguiente ejemplo vemos cómo se ha empleado un entrecruzador bastante sofisticado: es "trifuncional" o "cuatrifuncional". Este entrecruzador tiene una parte que reacciona con grupos amino (Amine-reactive ester), un grupo fenilazida, que es foto-reactivo (solo es reactivo cuando se ilumina con luz UV), biotina que puede emplearse para capturar la proteína de interés y por último incluye un puente disulfuro (que puede servir para cortar la interacción).
El compuesto se engancha con la proteína por el grupo reactivo y se incuba en presencia de la proteína con la que sospechamos que interacciona nuestra proteína de interés. Se ilumina con luz UV de forma que el grupo fenilazida se vuelve reactivo. Si las proteínas estaban lo suficientemente juntas, cosa que ocurrirá si las proteínas interaccionan, al volverse reactivo el entrecruzador, se engancharán. Para cortar la interacción, se añade un reductor de puentes disulfuro. Si ha habido interacción entre las dos proteínas, la biotina se habrá quedado enganchada en la otra proteína (en la proteína presa). Se purifica la proteína en una columna de afinidad para la biotina.
En el ejemplo se ha empleado para estudiar las interacciones de la Frataxina. Al cortar el puente disulfuro con un reductor, la parte de la biotina ha quedado unida a ISU, la proteína que formaba complejos con Frataxina.
Por último, tenemos aminoácidos modificados con el grupo diazirina. Son foto-reactivos y, cuando son excitados con luz UV se convierten en reactivos y pueden promover entrecruzamiento.
Dentro de estos tenemos varios aminoácidos modificados que podemos añadir al medio de cultivo para que las proteínas los incorporen. Al exponer las células a luz UV excitaremos el grupo, promoviendo que se formen entrecruzamientos - las proteínas próximas interaccionarán.
Vemos un ejemplo en el que se han empleado estos aminoácidos.
Se buscan proteínas que interaccionen con estomatina. Sin los aminoácidos foto-activables la estomatina aparece como un monómero. En presencia de los aminoácidos foto-activables (activos) aparecen bandas de tamaño superior que se corresponden a la estomatina interactuando con otras proteínas.
14 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Análisis de interacciones binarias in vivo Los sistemas que hemos visto hasta ahora de análisis de complejos proteicos son sistemas de estudio in vitro. El principal problema de estos es que las condiciones en las que se encuentran las proteínas in vivo son muy diferentes. Es por esto por lo que se han ido desarrollando técnicas que permitan el estudio in vivo.
Todas estas técnicas de análisis in vivo tienen en común que son sistemas binarios: se analiza si una proteína interacciona con otra.
En general todos estos sistemas se basan en la fusión de la proteína de interés con una proteína reportera y la/s proteínas prey con otra proteína reportera . La idea de todas estas técnicas es que detectaremos un efecto cuantificable si las reporteras están lo suficientemente próximas: sin interacción entre las proteínas no habrá efecto.
Técnica del doble híbrido (yeast two-hybrid) Este técnica requiere expresar las proteínas en levadura. Puede utilizarse para testar interacciones de proteínas que no sean propias de la levadura y que se expresen heterólogamente en ellas.
Las proteínas se expresan en levadura fusionadas: una de ellas se fusiona con un dominio de unión al DNA que reconozca al promotor del gen reportero y la otra con un dominio de activación de la transcripción. Como podemos ver en el esquema, si se produce interacción entre las proteínas, el dominio de activación de la transcripción quedará muy cerca del gen reportero, produciéndose así la transcripción de este.
Como genes reporteros se usan el gen de la β-galactosidasa, genes implicados en la síntesis de aminoácidos (la levadura solo crecerá en un medio sin esos aminoácidos si hay interacción), … 15 Interactómica La técnica también permite descubrir interacciones nuevas gracias a la vía sexual de la levadura. Como sabemos, la levadura puede estar en forma haploide o diploide. Cuando se encuentra en forma diploide, la levadura presenta dos tipos de apareamiento: Mat A y Mat α. Cuando una Mat A se encuentra próxima a una Mat α, éstas se aparean formando un cigoto. Al final de proceso, del cigoto salen descendientes diploides, que tendrán la suma de las dotaciones genéticas de los progenitores.
Si queremos encontrar interacciones entre proteínas basta con expresar en una cepa de levadura Mat A la proteína de interés fusionada con el dominio de unión al DNA (al igual que se hacía en el caso anterior) y, por otro lado, expresar toda una batería de cepas de levadura Mat α en cada una de las cuales habrá una proteína distinta fusionada con el activador de la transcripción .
Una vez se han desarrollado tanto la cepa Mat A como la batería de cepas Mat α se lleva a cabo un apareamiento sistemático de la primera levadura (Mat A) con todas las demás. En aquellos cigotos en los que haya interacción entre las proteínas se expresará el gen reportero.
Mediante este sistema se puede llegar a hacer una búsqueda global de interacciones - en lugar de contar con una sola cepa inicial (Mat A) se parte de muchas cepas.
16 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En el siguiente ejemplo se ha empleado como gen reportero un gen que permita a la cepa crecer en ausencia de histidina. Al cultivar en un medio sin histidina, solo se desarrollarán aquellos cigotos en los que se ha producido interacción entre las proteínas.
¿Son realmente fiables los resultados? A continuación se muestra una revisión en la que se han comparado tres trabajos que se han llevado a cabo en mosca y otros dos que se han hecho en la especie humana.
De los tres experimentos realizados en mosca, solo hay un resultado que coincide. Los dos experimentos de humanos tienen 17 resultados en común.
El problema es que aproximaciones tan globales como esta pueden dar lugar a muchos falsos positivos.
Los defensores de la técnica del doble híbrido dicen que, en general, estadísticamente se encuentra cierta disociación entre las interacciones que se descubren con esta técnica y las que se descubren con otras y que, por este hecho, el doble híbrido debe considerarse como un punto de partida o un primer screening.
A favor del doble hibrido se puede decir que los mapas de interacción que resultan de análisis de doble híbrido muestran relación entre proteínas con funciones similares o iguales.
17 Interactómica FRET - Fluorescence resonance energy transfer Como ya sabemos, las moléculas fluorescentes tienen la capacidad de absorber luz a una determinada longitud de onda (λ) y de, una vez han sido excitadas, emitir luz a una λ superior. La técnica FRET se basa en que la luz emitida por una molécula fluorescente sea absorbida por otra molécula también fluorescente (que emita una radiación a una λ superior). Para ello, el espectro de emisión de la molécula donadora (1ª molécula fluorescente) se debe solapar con el espectro de absorción de la 2ª molécula fluorescente o molécula aceptora. Además, para que se produzca el efecto FRET las moléculas donadora y aceptora deben encontrarse bastante próximas. Por este mismo motivo, FRET puede emplearse como herramienta para saber si dos proteínas están interaccionando (se encuentran juntas).
Normalmente, las moléculas fluorescentes tienen un rango de longitud de onda en el que absorben y, el espectro de emisión se encuentra desplazado de este rango (es superior).
Podemos comprobar si dos proteínas están interaccionando fusionándolas con proteínas fluorescentes, como GFP (Green Fluorescent Protein), que tiene un fluoróforo generado por un proceso autocatalítico.
Se han descubierto distintas proteínas fluorescentes que tienen características espectrales diferentes.
Además, se han modificado genéticamente las proteínas fluorescentes que se conocían para llegar a abarcar todo el espectro.
Cada proteína fluorescente tiene un máximo de excitación y un máximo de emisión superior. Además, contamos con dos parámetros adicionales: el coeficiente de extinción molar y el Quantum Yield (QY).
El coeficiente de extinción molar está relacionado con la cantidad de luz que absorbe una molécula - cuanto más alto es el EC, más luz absorbe.
Por otro lado, el QY indica la cantidad emitida por la molécula por cada fotón absorbido - normalmente, las moléculas fluorescentes emiten menos cantidad de luz que la que absorben La eficiencia de la proteína fluorescente es una suma de los dos factores.
A menudo se emplea otro parámetro que resulta de multiplicar el EC y el QY; cuanto más elevado sea el valor de este parámetro, más brillante será la molécula fluorescente.
En la siguiente imagen vemos u n ejemplo de cómo funciona la técnica FRET. El objetivo es saber si la proteína PLB y la proteína SERCA están interaccionando. Para ello, se expresan ambas proteínas en un sistema biológico fusionadas con dos proteínas fluorescentes distintas entre las que haya solapamiento entre el espectro de emisión de una y el espectro de absorción de la otra.
18 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Si existe interacción entre las proteínas, al excitar el fluoróforo de la primera de ellas, emitirá una luz que excitará al segundo fluoróforo, que emitirá luz a una longitud de onda diferente. Por tanto, si las proteínas interaccionan, excitando el primer fluoróforo, detectaremos la emisión del segundo fluoróforo.
La curva representada en la siguiente gráfica mide la eficiencia del fenómeno FRET en función de la distancia entre los dos fluoróforos.
Cuesta bastante encontrar proteínas fluorescentes cuyos espectros de emisión y absorción se solapen. Si se solapan poco, no toda la luz que emite la molécula será absorbida por la aceptora, por lo que la señal finalmente detectada será más débil y será posible detectar parte de la luz emitida por la donadora además de la emitida por la aceptora.
En este caso, el espectro de emisión de la donadora es muy amplio, tanto que llega a solaparse con el espectro de emisión de la aceptora. Este hecho implica que, cuando no hay interacción entre las proteínas, según a qué longitud de onda estemos detectando, obtendremos una señal que en realidad procede de la molécula donadora (dentro del espectro correspondiente a la 2ª proteína).
19 Interactómica En el siguiente trabajo vemos un análisis de la interacción de las proteínas de un poro. Se ha encontrado que en la pareja Nup116-Nup82 en la que sí hay interacción se obtiene un valor muy similar al obtenido en la siguiente pareja de proteínas entre las que no hay interacción.
Por tanto, no existe una diferencia excesiva entre los valores obtenidos cuando se produce FRET y los valores obtenidos cuando no se está produciendo FRET (cuando no se da el fenómeno FRET también hay fluorescencia). Es decir, pasar de obtener fenómeno FRET a no obtenerlo no se corresponde con pasar de 0 a 100.
Acceptor photobleaching FRET Consiste en abordar FRET de una forma diferente: en lugar de poner énfasis en la fluorescencia de la molécula aceptora, nos centramos en la fluorescencia de la molécula donadora, que se puede detectar mejor. Cuando se produce el fenómeno FRET, es decir, cuando aceptora y donadora se encuentran lo suficientemente próximas, la fluorescencia de la molécula donadora disminuye.
El procedimiento que se sigue en esta versión de FRET es "cargarnos" en un momento determinado la fluorescencia de la molécula aceptora y comprobar si al hacer esto aumenta la fluorescencia de la molécula donadora.
Para eliminar la capacidad de fluorescencia de la molécula aceptora empleamos el efecto photobleaching: sometemos a la aceptora a sobre-excitación.
En el siguiente ejemplo, podemos ver la aplicación del Acceptor photobleaching FRET en el análisis de interacciones proteicas.
Se ha ido analizando la fluorescencia de la 1ª proteína fluorescente, en este caso CFP, (haciendo diferentes análisis) hasta que llega el momento en que se destruye una de las proteínas (YFP) mediante un impulso muy fuerte de excitación. El efecto que ha causado la destrucción de YFP es que ha aumentado la fluorescencia de la otra proteína, por lo que podemos deducir que se producía el efecto FRET y que las dos proteínas interaccionan.
20 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Protein fragment Complementation (PFC) Queremos saber si dos proteínas interaccionan y, para ello, las expresamos in vivo fusionadas cada una de ellas a un fragmento distinto de una misma proteína reportera. Al expresar las proteínas, si estas se encuentran lo suficientemente próximas la proteína reportera se podrá reconstruir y hará si correspondiente función.
Se han ido desarrollando diversas proteínas reporteras con el tiempo. En los ejemplos que se muestran en la imagen vemos representadas las dos mitades en las que separa la proteína en diferente color.
A la hora de emplear o desarrollar una de estas proteínas reporteras hay que tener en cuenta que la unión no debe producirse de manera espontánea, sino cuando las proteínas fusionadas estén realmente muy próximas.
Ejemplos Split-ubiquitin (ubiquitina) Tenemos uno de los fragmentos de ubiquitina, el C-terminal, fusionado a un factor de transcripción.
Este será a su vez uno de los fragmentos que fusionamos a una de las dos proteínas que queramos estudiar. A la otra proteína fusionamos el fragmento restante de a ubiquitina. Cuando se produce interacción entre las dos proteínas, los dos fragmentos de ubiquitina se encuentran lo suficientemente juntos como para unirse. Se forma la ubiquitina (que mantiene unido el factor de transcripción), que es reconocida por una proteína de unión a ubiquitina (UBP) que resulta ser una proteasa específica de ubiquitina. Esta corta la unión entre la ubiquitina y el factor de transcripción que tiene enganchado. El factor de transcripción queda libre y puede desplazarse al núcleo, donde activará la transcripción de un gen reportero que podrá ser detectado.
21 Interactómica Este es uno de los sistemas que pueden emplearse para analizar interacciones en proteínas de membrana siempre y cuando la ubiquitina se mantenga en la región citoplasmática.
Split GFP Se trata de un ejemplo más sencillo que el de la ubiquitina. Cada una de las proteínas a estudiar se fusiona a una mitad de la proteína fluorescente (GFP). Si se produce interacción entre las dos proteínas, se puede reconstruir la proteína fluorescente y se podrá detectar su fluorescencia. La ventaja de usar proteínas fluorescentes es que nos aporta también información sobre la ubicación.
Sobre este método se ha desarrollado una estrategia más sofisticada: se emplean mitades de varias proteínas diferentes.
Así, en función de qué proteínas fluorescentes se unan se generará una proteína fluorescente con características espectrales distintas (por ejemplo, podemos distinguir las distintas combinaciones por el color de la luz emitida). Así, podemos analizar muchas proteínas diferentes a la vez.
22 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Phage Display Library Se trata de un tipo de ensayo in vitro que ya hemos estudiado anteriormente, pues se trata del mecanismo de selección de nanobodies. Como podemos recordar, los nanobodies se expresaban mediante un plásmido de bacteriófago en el que la secuencia del anticuerpo estaba fusionada a una proteína de la cápsida del fago.
Esta técnica también puede emplearse para buscar interacciones de proteínas. Queremos conocer con qué proteínas (o lo que sea - glicanos, bacterias, etc.) está interaccionando una proteína concreta. La proteína a estudiar debe estar purificada e inmovilizada sobre una superficie.
Por otro lado, clonamos todos los genes de un organismo en un vector de bacteriófago fusionados con las proteínas de la cápsida de éste.
Así, se producirán bacteriófagos que en su superficie expresarán las diferentes proteínas del genoma que hemos clonado. Hemos creado una librería de plásmidos que expresan todas estas proteínas (cada fago expresa una proteína distinta).
Una vez hecho esto, se ponen los fagos en contacto con la proteína de interés, que se encuentra fijada en una superficie. Si la proteína que está expresando el fago interacciona con ésta, el fago quedará retenido. Basta con aislar los plásmidos que están en los fagos que han quedado retenidos para saber de qué proteínas se trata.
En el siguiente estudio se han buscado qué proteínas de membrana son capaces de unirse al plasminógeno y a otras proteínas similares para encontrar proteínas bacterianas implicadas en virulencia e infección.
23 Interactómica Separación de complejos en forma nativa Las técnicas bioquímicas clásicas también pueden ser aplicadas al estudio de interacciones proteicas, no tanto para descubrir interacciones nuevas sino para validaciones.
Se trata de técnicas que permiten separar las proteínas en función de su tamaño. Si se da algún cambio en la estructura cuaternaria - debido por ejemplo a la formación de complejos - lo podremos ver reflejado en los resultados de estas técnicas.
Gel filtración Como ya sabemos, se trata de un tipo de cromatografía líquida en la que se separan las proteínas (en forma nativa) en función de su tamaño.
El tiempo de retención de la proteína en la columna dependerá de su tamaño. Las moléculas grandes salen antes que las de menor tamaño. Podemos establecer la relación entre el tiempo de retención y el peso molecular de la proteína.
Si sabemos que una proteína pesa X Daltons y en la cromatografía de gel filtración se comporta como si pesara más Daltons, indica que está formando un complejo con algo.
Mediante este método también se pueden analizar mutaciones o la presencia de un determinado cofactor.
En el siguiente ejemplo vemos una proteína de 17kDa, la mayor parte de la cual aparece en el volumen vacío. Es decir, la mayor parte de la proteína se mueve por la columna como si tuviera un peso molecular mayor que el que realmente tiene. Esto nos indica que solo una pequeña proporción de la proteína aparece como monómero (17kDa).
En este caso, en función del tratamiento que se ha dado a la proteína vemos que este hecho se evidencia más o menos.
24 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV BN-PAGE (BlueNative PAGE) Se basa en la separación electroforética en un gel nativo -sin detergentes- en presencia del colorante azul de Coomassie.
En el siguiente ejemplo vemos el estudio de los complejos de la cadena de transporte de electrones.
Aparecen bandas adicionales en la parte superior del gel que se corresponden a supercomplejos: los complejos se asocian entre ellos contribuyendo a una mayor eficiencia de la cadena de transporte electrónico. Se considera que estos complejos se forman en función de las necesidades energéticas de la célula. Por tanto, la formación o no de complejos constituye una manera de modular la eficiencia.
Estudiaron la formación de estos supercomplejos en ratas de diferentes edades, observando que se formaban más en aquellas ratas más jóvenes que en las de mayor edad.
En el siguiente ejemplo se profundiza más en la misma idea de los supercomplejos. Miden la distribución de los complejos y la actividad de la cadena de transporte en respuesta a la ingesta de alimento. Se analiza una proteína del complejo III de la cadena de transporte electrónico y comparan los resultados obtenidos de ratas en ayuno y de ratas alimentadas. Podemos comprobar que, a pesar de tratarse de una electroforesis en condiciones nativas, el complejo III aparece representado en varias bandas.
Probablemente esto se debe a que encontramos el complejo III fusionado con otras proteínas, lo que cambia su peso molecular.
En ayuno, disminuye la asociación entre el complejo I y el complejo III. Esto se ha correlacionado con la pérdida de actividad y el consumo de oxígeno. Los datos de la actividad nos revelan que, en función del sustrato que demos a la mitocondria (tenemos la mitocondria aislada), funcionan más unos complejos u otros.
25 Interactómica Los ratones bien alimentados consumen más oxígeno que las ratas en ayuno. De esta información dedujeron que la asociación de los complejos I y III permite un mejor y más eficiente funcionamiento de la cadena de transporte de electrones y, por tanto, implica un mayor consumo de oxígeno.
La técnica BlueNative PAGE también permite hacer una electroforesis bidimensional combinando la BlueNative en la primera dimensión y una electroforesis desnaturalizante en la segunda dimensión.
Encontramos que todas las proteínas que se encuentran formando un complejo aparecen en la misma línea tras realizar la segunda dimensión: esto implica que en la BlueNative PAGE se han separado de la misma manera. Que se separen de la misma forma podría significar que están asociadas o simplemente que se trata de proteínas con el mismo peso molecular.
ESI-MS La técnica ESI se trata, como ya hemos visto, en una técnica de ionización electrospray. ESI permite ionizar proteínas enteras, no solo péptidos, e incluso se considera que algunos complejos proteicos pueden mantenerse estables después del proceso de ionización - mantiene la integridad de los complejos. Por tanto, la técnica puede servir para calcular las masas de algunos compuestos proteicos.
Por ejemplo, la ionización electrospray permite obtener la masa del complejo de forma más precisa que con la cromatografía de gel filtración. A partir de los resultados obtenidos de la masa molecular, se puede deducir la estequiometria.
En la ionización en electrospray ocurre el fenómeno de la gota menguante o Shrinking Droplet. Se generan una serie de gotas que contienen disuelto el analito. A medida que se evapora el solvente, la gota se va haciendo más pequeña pero la cantidad de analito no disminuye, por lo que queda más concentrado.
En el esquema de la imagen podemos ver unos analitos que están formando complejos. A medida que se va concentrando el analito, aumenta la proporción de complejos. Es decir, el aumento de la concentración hace que se favorezca la formación de complejos y además, provoca que éstos sean más estables.
El electrospray es tan solo una fuente de ionización y, para conocer la masa de los complejos, es necesario un analizador de masas. Se han utilizado diferentes analizadores, siendo los más frecuentes aquellos analizadores más o menos convencionales (ToF, quadrupol, …) aunque también se han utilizado otros diferentes.
En el siguiente ejemplo se ha purificado el complejo por gel filtración, se ha ionizado (ESI) y se ha analizado por espectrometría de masas. Si nos fijamos en el espectro resultante, vemos diferentes picos 26 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV que no corresponden a diferentes isótopos, es decir, no se trata de la envoltura isotópica. En realizada, estas relaciones masa/carga corresponden al complejo: cada pico corresponde a un número de cargas diferente (las distintas moléculas del complejo ha adquirido diferentes cargas durante la ionización). Tras el proceso de deconvolución se ha obtenido la masa real del complejo.
En moléculas tan grandes es muy complicado ver la envoltura isotópica ya que con masas tan grandes cuesta obtener una buena resolución. Las pequeñas irregularidades de los tipos se trata de la envoltura isotópica que puede intuirse.
En ocasiones se emplean otros tipos de analizadores de masas. Por ejemplo, GEMMA (Gas-Phase Electrophoretic Mobility Molecular Analysis). Estos analizadores son, en cierta manera, una electroforesis en gas en lugar de en gel. En analizador de masas está lleno de algún tipo de gas neutro, que debe ser atravesado por los analitos. Debido a la presencia de gas, aparte de por la masa, el avance de la molécula también vendrá condicionado por el diámetro de la molécula. Cuanto mayor el diámetro de la molécula, ésta tendrá más impactos con las moléculas de gas. Estos impactos entre la molécula y el gas son poco energéticos y por tanto, no rompen la molécula, pero retardan el avance de las moléculas.
Estos analizadores funcionan relativamente bien para analizar complejos proteicos, y permiten analizar por cuántas subunidades están formados los complejos (en función de la cantidad de subunidades, cambia el diámetro).
Usando esta técnica se analizó la proteína ferritina, de la que se ensamblan varias subunidades formando una esfera dentro de la cual se almacena hierro. En el espectro de masas aparecían distintos picos, que variaban en determinadas circunstancias.
27 Interactómica Espectroscopía SPR - Surface Plasmon Resonance Se comenzó a utilizar hace alrededor de unos 10 años. La primera empresa en comercializar estos aparatos fue BIACORE, por lo que esta técnica también recibe este nombre.
Se trata de un sistema con diversos componentes: En primer lugar, tiene un chip de proteína o chip sensor. Se trata de una superficie, compuesta de dextrano y oro, sobre la que se inmoviliza una proteína o analito concreto.
Después, tiene un sistema microfluídico que permite hacer circular otras moléculas a través del chip.
En principio, a través de este sistema podemos hacer pasar proteínas que interaccionen con la proteína inmovilizada. Al final, los aparatos cuentan con un sistema que detecta si se está produciendo alguna interacción: SPR.
Esta técnica se utiliza cuando sospechamos que dos proteínas pueden interaccionar y queremos conocer la afinidad de la interacción así como otros parámetros cinéticos.
Se emplea entre otras cosas, para estudiar la interacción de complejos antígeno-anticuerpo. Por ejemplo, tenemos un antígeno que nos interesa mucho por ser una diana terapéutica potencial y estamos desarrollando anticuerpos contra esta. Desarrollamos diversos clones de anticuerpos contra la proteína. Inmovilizamos el antígeno en la superficie del chip (hay diversas maneras) y lo colocamos en el aparato. Vamos haciendo pasar uno a uno los diferentes anticuerpos que hemos sintetizado por el sistema fluídico del chip (haciendo los lavados pertinentes). Mientras, medimos o estimamos la cantidad de material que hay unido en la superficie del chip en cada momento gracias al fenómeno SPR.
Fenómeno SPR - cambio del índice de refracción en función de la masa.
Si incidimos sobre la superficie del chip con un rayo de luz polarizada, el rayo será reflejado pero, en función de la cantidad de materia inmovilizada en el chip, se genera una zona de sombra en esta reflexión. El aparato incluye un detector que mide el ángulo de esta zona de sombra  mide el efecto SPR.
28 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Como el ángulo de la sombra varía en función de la cantidad de materia que hay en el chip, la medida del ángulo nos indicará la cantidad de anticuerpo que se ha unido al antígeno inmovilizado en el chip.
Vamos midiendo este ángulo a lo largo del tiempo, partiendo de un t=0 en el que no hay ningún anticuerpo en el chip. Hacemos pasar cada anticuerpo por separado, aumentando la cantidad que incorporamos en el chip hasta llegar a un máximo ángulo de sombra; una vez alcanzado este ángulo esperamos a que el ángulo vaya disminuyendo, fenómeno que se relaciona con la disociación de los complejos antígeno-anticuerpo. El ángulo máximo es una medida de la afinidad (antígenoanticuerpo) y el tiempo que tarda en alcanzarse el máximo y en llegar de nuevo a un ángulo 0 son medidas de la cinética de asociación y disociación.
Aparte de con anticuerpos, también puede emplearse esta técnica para péptidos con función terapéutica o con fármacos y proteínas de interés.
 Se trata de une técnica para caracterizar cinéticamente interacciones proteicas que consideremos relevantes, no para caracterizar interacciones nuevas.
Bases de datos de interacciones Existen algunas bases de datos específicas que tienen información sobre las distintas interacciones que se han descrito. De entre todas las que existen , la base de datos más compleja es BioGRID. Se trata de un repositorio de interacciones cuyos datos están recogidos a través de revisiones y filtrado exhaustivos.
A los datos de las bases de datos se puede acceder de forma completamente libre y gratuita.
29 Interactómica Buscamos por ejemplo, la proteína Grx5 de S. cerevisiae. Se han descrito sobre este proteína una 14 interacciones físicas y 19 interacciones genéticas.
- Las interacciones físicas son interacciones entre dos proteínas, sea como sea la interacción.
- Interacción genética  la afectación a uno de los dos genes afecta a la otra proteína.
La base de datos también especifica si se trata de interacciones descubiertas en estudios High Througput o Low Throughput ya que las interacciones descubiertas en estudios a pequeña escala (Low Throughput) son las más fiables.
También se indica en cada interacción, qué proteína ha sido tomada como proteína Bait y cuál como proteína Prey en el estudio.
Hay que tener en cuenta que la información que encontramos en las bases de datos no se corresponde con la verdad absoluta sino que las bases de datos simplemente recogen todo aquellos que se ha publicado sobre una proteína. La importancia de estas bases de datos es que permiten conocer todo aquello que se ha dicho de una proteína de un solo vistazo.
Hay que ser crítico con los resultados que se muestran en estas bases de datos.
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